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薬品分析学３
演習
HPLCの構成要素を順番に並べなさい。
ポンプ
記録計
溶媒(移動相液体)の瓶
カラム
ポンプ
圧力計
試料導入部(インジェクター)
検出器
記録計
検出器
試料導入部(インジェクター)
溶媒(移動相液体)の瓶
カラム
圧力計
光学分割 (鏡像異性体の分離)
鏡像異性体 (対掌体): エナンチオマー (enantiomer)
旋光度以外の物性が同じ
通常のカラムで分離不能
ジアステレオマー＆エナンチオマー
不斉中心が2つ以上ある化合物
立体異性体
エナンチオマー (enantiomer)
ジアステレオマー (diastereomer)
3-クロロ-2-ブタノール (Fischer 投影式)
S
R
CH3
H * OH
H * Cl
CH3
CH3
H *
OH
H *
Cl
CH3
ジアステレオマー＆エナンチオマー
ジアステレオマー (diastereomer)
不斉中心が2つ以上ある化合物にしかジアステレオマーは
存在しない
不斉中心が2つ以上ある化合物の異性体
エナンチオマー
(enantiomer)
の関係
S
R
CH3
H * OH
HO
H * Cl
Cl
CH3 対称面
エナンチオマー以外の関係
CH3
* H R
* H S
CH3
ジアステレオマー
(diastereomer)
の関係
ジアステレオマー＆エナンチオマー
3-クロロ-2-ブタノール (Fischer 投影式)
CH3
H * OH
H * Cl
CH3
CH3
HO * H R
H * Cl R
CH3
CH3
S H * OH
S Cl * H
CH3
CH3
HO * H R
Cl * H S
CH3
S
R
エナンチオマー
(enantiomer)
の関係
ジアステレオマー
(diastereomer)
の関係
ジアステレオマー
別化合物
通常クロマトグラフィー
で分別可能
クロマトグラフィーによる光学分割
キラル固定相法
キラル化合物(分離対象)
R
R
R S
R
R
R
R
R
R キラル化合物(固定相) R
R
R
R
キラル移動相法
R
S
R
R
R
R
S
R
R
R
S
R
S
R
R
R
S
R R
R
R
固定相
R
R
固定相
R キラル化合物(移動相)
S
R
S
R
S
R
R
クロマトグラフィーによる光学分割
ジアステレオマー法
R
S
R
R
R
R
R
R R
R 固定相 R
固定相
R
固定相
R
S
R
S
R
S
R
S
キラル化合物
S
R
共有結合形成
化学反応
+ R
R
R
S
R
別化合物
ジアステレオマー(diastereomer)の関係
通常クロマトグラフィー
で分別可能
ジアステレオマー：例
グルコース
環状構造
マンノース
HO
HO
H
O
H
OH
H
OH
OH
H
O
*
*
*
*
HO
O
H
H
OH
OH
OH
OH
H
H
H
O
H
OH
O
H
OH
OH
H
H
OH
H
H
H * OH
HO * H
HO * H
H * OH
CH2OH
α:146 ℃ / β:150 ℃
132～133℃
α:167 ℃ /
β:143-145 ℃
0.69
0.59
0.63
甘味度(vsショ糖)
ジアステレオマー
の関係
OH
H
OH
OH
CH2OH
ジアステレオマー
別化合物
H
O
HO * H
HO * H
H * OH
H * OH
CH2OH
H
HO
H
H
Fischer 投影式
融点
H
OH
H
還元型構造
ガラクトース
通常クロマトグラフィー
で分別可能
クロマトグラフィーによる光学分割
キラル固定相法
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
右足には右足用の靴
キラル移動相法
R
R
別物
S
R
ジアステレオマー(diastereomer)
的な関係
通常クロマトグラフィー
で分別可能
キラル固定相法・キラル移動相法に用いられるキラル化合物
教科書
P183
図3-35
演習
HPLCの構成要素を順番に並べなさい。
ポンプ
記録計
溶媒(移動相液体)の瓶
カラム
圧力計
検出器
試料導入部(インジェクター)
宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ)
以下の物質から「原理的にキラル固定相になるもの」と「原
理的にキラル移動相になるもの」をそれぞれ選びなさい。
ベンゼン
グルコースアルブミン
オクタデシルシリル基
ポリエチレングリコール
シクロヘキサン
ろ紙
プロリン
宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ)
以下の物質から「原理的にキラル固定相になるもの」と「原
理的にキラル移動相になるもの」をそれぞれ選びなさい。
ベンゼン
グルコースアルブミン
オクタデシルシリル基
ポリエチレングリコール
シクロヘキサン
ろ紙
プロリン
キラル固定相になるもの:
グルコース
アルブミン
ろ紙
プロリン
不斉(キラル)中心を有した化合物
キラル移動相になるもの:
グルコース
アルブミン
プロリン
不斉(キラル)中心を有した化合物、かつ、溶媒に溶解する物質
電気泳動
電気泳動装置(ポリアクリルアミドゲル)
パワーサプライ(電源装置)
出典
Wikipedia「ポリアクリルアミド電気泳動」
出典
http://www.tech-jam.com/campaign/budget/bio_10.phtml
ポリアクリルアミドゲル
ポリアクリルアミドゲル
出典: http://www-mls.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp
/stbiol/protocols/SDS_PAGE.pdf
ポリアクリルアミドゲル化学構造
電気泳動(アガロースゲル)
電気泳動装置(アガロースゲル)
パワーサプライ(電源装置)
出典: 教科書P218 図3-56
注意: 教科書の図3-56(b) の図はアガロースゲル電気泳動槽の図
アガロースゲル
アガロースゲル
アガロース:
寒天の主成分
上記単位構造が連なっ
た多糖類(ポリサッカラ
イド)
出典: http://munetoshi.blog50.fc2.com/
blog-date-200805.html
見ての通り寒天だ！
ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル
アガロースゲル
ポリアクリルアミドゲル
ポリマー(長鎖化合物)がからまって固まったもの
電荷が同じなら
−
ゲルの網目を抜けでる速さ
>>
分子ふるい効果
分子量の小さな分子が早く
泳動される
ゲルろ過と逆
+
分子量が同じなら電荷の大
きな分子が早く泳動される
電気泳動速度
移動速度
v: 移動速度; μ: 移動度; V: 電圧; L: 電極間距離; E: 電場強度
移動度
Q: 化合物電荷; π: 3.14•••; η: 溶媒粘度; r: 化合物半径
化合物半径 r ↑
移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/r)
化合物が大きくなると、泳動速度が遅くなる
化合物電荷 Q ↑
溶媒粘度 η ↑
移動度 μ ↑ (μ ∝ Q)
移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/η)
ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル: 応用
アガロースゲル
ポリアクリルアミドゲル
核酸の鎖長決定
(プラスミド等)
核酸の鎖長決定
蛋白質の分子量決定
蛋白質の等電点決定
−
−
核酸−蛋白質の結合定数決定
疎水性コア
−
+
−
蛋白質の構造形成原理
ポリアクリルアミドゲル: SDS-PAGE
SDS-PAGE
負電荷
−
SDS: sodium dodecyl sulfate (界面活性剤) =
別名：ラウリル硫酸ナトリウム
= 蛋白質の変性剤
PAGE: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)
− −
− −−
− −
− −
蛋白質側鎖
−
長鎖脂肪鎖
(疎水性)
蛋白質主鎖
蛋白質の構造を崩す
鎖長に応じた泳動度
分子量に依存した長さ(大きさ)
蛋白質の分子量決定
キャピラリー電気泳動
装置概略
キャピラリー: フューズドシリカ(溶融石英)をポリイミドでコート
電源: 高圧電源 (10k〜30kV, 250 μA 以下)
検出器: 紫外吸光度(UV)検出器、フォトダイオードアレイ検出器
資料注入: 落差法(サイホン)、吸引法、加圧法、(電気)泳動法
キャピラリー電気泳動：分類
キャピラリーゾーン電気泳動
支持体：なし(電解質溶液)
泳動の駆動力：電気浸透流(電荷(+,N,−)に関わらず陰極側へ)
泳動速度：陽イオン > 中性物質 > 陰イオン
Si O Si O Si
O− OH O−
+
+
電気浸透流
電気二重層
壁近傍の陽イオンの流れが駆動力
−
電気浸透流の元
泳動界面が平ら
高分離能のクロマトグラフィー(電気泳動)
キャピラリー電気泳動：分類
キャピラリーゲル電気泳動
支持体：あり(ポリアクリルアミド、アガロース等)
泳動の駆動力：静電引力
泳動速度：分子ふるい効果(大きな分子が遅い)
キャピラリー中のゲル電気泳動
キャピラリー電気泳動：分類
ミセル動電クロマトグラフィー
泳動液：イオン性ミセル添加電解溶液
泳動の駆動力：電気浸透流(ミセルの泳動は遅い)
泳動速度：ミセル相と水相との分配平衡
ミセル相に取込まれやすい化合物の泳動が遅れる
キャピラリー電気泳動：応用
DNA塩基配列解析(シーケンシング)
キャピラリーゲル電気泳動
どちらか不明
キャピラリーゾーン電気泳動
生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置
演習
化合物(a)〜(c)のうち、四角で囲んだ化合物と「キラル固定相法」
「キラル移動相法」等の光学分割が必要な化合物と、通常カラム
で分離可能な化合物を(a)〜(c)の記号で答えなさい。
CH3
S H * OH
R H * Cl
CH3
(a)
CH3
R HO * H
R H * Cl
CH3
光学分割が必要な化合物：
通常カラムで分離可能な化合物：
(b)
CH3
S H * OH
S Cl * H
CH3
(c)
CH3
R HO * H
S Cl * H
CH3
宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ)
分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。
(a) 電荷価数: -5, 半径: 9 nmの球
(b) 電荷価数: -1, 半径: 3 nmの球
(c) 電荷価数: -2, 半径: 60×10-10 mの球
分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。
ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体
であるものとする。
(d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
(e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質
(f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質
宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ)
分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。
e: 電子1個の電荷
(a) 電荷価数: −5, 半径: 9 nmの球
-19 (C)
-1.602×10
(5e)
5e
=
=
移動度
6πη×9
54πη
クーロン
(b) 電荷価数: −1, 半径: 3 nmの球
(1×e)
e
3e
=
=
=
移動度
6πη×3
18πη
54πη
(c) 電荷価数: −2, 半径: 60×10-10 mの球
60×10-10 m = 6×10-9 m = 6 nm
(2e)
e
3e
=
=
=
移動度
6πη×6
18πη
54πη
答 (a) > (b) ≈ (c)
宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ)
分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。
ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体
であるものとする。
単位(C)
移動度
単位(m)
(d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量
分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!)
ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係)
分子量 → 半径の変換が肝！
蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA)
= 9000/NA (g)
移動度
単位(C)
単位(m)
(d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量
分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!)
ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係)
分子量 → 半径の変換が肝！
蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA)
= 9000/NA (g)
蛋白質1個の体積 =蛋白質1個の質量／密度 (a (g/m3))
= {9000/NA (g)}/a (g/m3)
9000
=
(m3)
NA•a
4πr3
蛋白質1個の体積 =
(m3) (球の体積の公式)
3
移動度
単位(C)
単位(m)
(d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量
3
4πr
9000
=
蛋白質1個の体積 (m3) =
NA•a
3
4πr3
(球の体積の公式)
9000
=
3
NA•a
27000
3×9000
3
=
r =
4πNA•a
4πNA•a
r=
√
3
√
3
27000
1
= 30
4πNA•a
4πNA•a
(d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
r=
√
3
√
3
27000
1
= 30
4πNA•a
4πNA•a (m)
(e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質
√
√
√
√
√
√
3
3×分子量
=
4πNA•a
√
3
36
36000
r=
= 10
4πNA•a
4πNA•a
(m)
(f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質
r=
3
3×分子量
=
4πNA•a
3
3
3×12000
=
4πNA•a
3×15000
=
4πNA•a
3
3
√
3
45
45000
= 10
4πNA•a
4πNA•a
(m)
(d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
Q 1
5e
Q
=
=
μ(d) =
r
6πη
6πη
6πηr
e
=
6πη
√
3
√
3
e
4πNA•a
=
27000
6πη
√
3
πNA•a
54
(e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質
Q 1
4e
=
μ(e) =
r
6πη
6πη
√
3
e
4πNA•a
=
36000 6πη
√
3
πNA•a
140.6
(f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質
Q 1
6e
=
μ(f) =
r
6πη
6πη
答: (f) > (d) > (e)
√
3
e
4πNA•a
=
45000 6πη
√
3
πNA•a
52.08
53×4πNA•a
27000
分離分析：まとめ
DNA塩基配列解析(シーケンシング)
キャピラリーゲル電気泳動
どちらか不明
キャピラリーゾーン電気泳動
生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置

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