発光量絶対値測定－ホタル－ルミノールの発表は無し … 2006.6.29 秋山研 PD 安東頼子 ●研究の背景と目的 ●発光量絶対値測定ーホタルー ●今後の展開研究の背景と目的 ① 発光量子収率 88±25% (pH 7.6, Photinus pyralis) Seliger & McElroy (1959) 1959年発光量子収率 88% 1961年ルシフェリンの構造決定と合成光学異性体のD体のみが発光に寄与 1963年旋光度合成 D-ルシフェリン： -36.0° 精製ルシフェリン： -0.6° 精製ルシフェリンはラセミ化が進み D体とL体が約50%ずつになっている発光量子収率 vs pH (H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1959)) 発光量子収率･･･1個の基質分子が 1フォトンを放出する確率 ② 発光色変化その1 発光スペクトルがpHによって変化する pH7.1 Seliger & McElroy (1959) pH5.4 pH6.3 Red emission Yellow-green emission 発光スペクトル(北米産ホタル) vs pH (H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1959)) 中性付近：560nmピークの非対称形状を持つ黄緑色発光酸性側：616nmピークの非対称形状を持つ赤色発光 ② 発光色変化その２酵素の種類によっても異なる !? pH感受型：ミヤコマドボタル、北米産ホタルゲンジボタル、ヘイケボタルなど pH非感受型：イリオモテボタル、ヒカリコメツキなど (近江谷克裕 (2004) 生化学, 第76巻, 第1号, p.5-15) 酵素の種類によって発光スペクトルのpH依存性が異なる研究の現状 ① 発光量子収率高効率の発光反応機構の解明 ex) CIEEL機構 etc… ② 発光色変化  ルシフェリンやその誘導体を用いた生物・化学発光、吸収・蛍光測定  色々な種類の酵素やその遺伝子組換え体を用いた生物発光測定  酵素やその生成物との複合体のX線構造解析 ex) モノアニオン・ジアニオン説、結合回転説、ケトン共鳴状態説、オキシルシフェリン電荷偏り説、酵素の構造差異説考え方の基本は、2つの発光成分の平衡状態によって発光スペクトルが変化するというもの → 未だに決着していない．．．絶対値発光計測は不可欠 ! 発光量絶対値測定ーホタルーホタルの絶対値発光スペクトルと発光量子収率 - 絶対値発光スペクトル - - 発光量子収率 - Luminescence yield (photon/eV) （1個の基質分子が1フォトンを放出する確率） Firefly luciferase : Natural “Photinus pyralis” （ＳＩＧＭＡ） Quantum yield : 41.0 ± 7.4 % (pH 8.5) 結果の考察その1 発光量子収率 41.0±7.4% (pH8.5)  88%のおよそ半分の値 → そもそも比較出来ない  発光生物と比較→最も高い値(ウミホタル：28%, オワンクラゲ：17%, 発光バクテリア：12-17%)  一重項状態統計重率の25%を超えている 88%だと思っている人達にこの値を信じてもらうには…… ① ルミノールの発光量子収率測定を行なう ! → 過去の報告(1.2%)と一致 Bioluminescence intensity of firefly at pH8.0 Luminescence int. (count) 6.E+06 5.E+06 ② Seligerらと同じ方法でルシフェラーゼ(酵素)を精製する ! 4.E+06 3.E+06 Photinus (60%AS) 060613, n=4 Photinus (SIGMA),2mg/ml, 060623, n=3 Photinus (SIGMA), 2mg/ml, 060206, n=3 Photinus (SIGMA),1mg/ml, 050827, n=1 Luciola (SIGMA),1mg/0.25ml, 060623, n=2 2.E+06 1.E+06 市販のルシフェラーゼ(SIGMA) 発光量子収率測定に使用 0.E+00 1 2 3 測定点, n 4 → 精製したルシフェラーゼと市販のルシフェラーゼの発光量が一致結果の考察  発光色変化その2 (発光スペクトル pH依存性) 黄緑色発光と赤色発光本測定で明らかになった事黄緑色発光 (pH7.8 < ) 赤色発光 (pH6 > ) 発光色変化従来の考え方 2.2eV(560nm)、2.0eV(620nm)、1.85eV(670nm) ピークの3つのガウス型発光成分 560nmピークの非対称形状を持つ単一の発光成分 2.0eV、1.85eVピークの2つのガウス型発光成分 620nmピークの非対称形状を持つ単一の発光成分黄緑色発光成分の中には赤色発光成分が黄緑色発光成分と赤色発光成分が入れ替わりに観含まれる。2.2eVピーク成分のpH依存性による。測される。両発光成分の平衡状態pH依存性による。今後の展開 –発光色変化に関連して オキシルシフェリンまたは酵素との複合体絶対値 PL測定 ΦQY = ΦCR × ΦEX × ΦLM ΦQY : 発光量子収率, ΦCR : 化学反応効率, ΦEX : 一重項励起状態の効率 ΦLM : 励起生成物の蛍光量子収率  オキシルシフェリン PL時間分解測定黄緑色、赤色発光成分( 2. 2eV 、2.0eV、 1.85eV成分）それぞれの時間測定を行なう発光成分＋非発光成分  様々な種類のルシフェラーゼを用いた発光量子収率発光スペクトルpH依存性酵素の種類を変えると発光スペクトルpH依存性が異なる。その定量的な評価を行なう。発光色決定の諸説  モノアニオン・ジアニオン説発光生成物オキシルシフェリンの励起一重項状態モノアニオン → 赤色発光 N S ＊ + ↑↓±H S N O ジアニオン → 黄緑色発光 Keto-form - H+ O S ＊ N S -O N enolate-form Red emission Yellow-green emission  回転角説 C2-C2’ bondの回転によって発光色が変わる MaCapra, F., Gilfoyle, D. J., Young, D. M., Church, N. J., Spencer, P., Bioluminescence and Chemiluminescence, John Wiley & Sons, p387 (1994). N Φ -O  オキシルシフェリンのpolarization説 S S ＊ N O Twisted keton Luciferaseに取り込まれているオキシルシフェリンの電子状態によって決まる Ugarova, N. N., Brovko, L. Y., Luminescence, 17, 321 (2002). O- 発光減衰時間 Decay time of firefly at pH8.0 1200 Decay time (sec) 1000 800 Photinus (60%AS) 060613, n=4 Photinus (SIGMA), 2mg/ml, 060623, n=3 600 Photinus (SIGMA), 2mg/ml, 060206, n=3 Photinus (SIGMA), 1mg/ml, 050827, n=1 400 Luciola (SIGMA), 1mg/0.25ml, 060623, n=2 200 0 1 2 測定点, n 3 4