5/21～6/11 担当講師 柘植謙爾（つげ けんじ） [email protected] （６）第４章 ゲノム配列の解析 日時：5/21 9:25-10:55 内容：様々な塩基配列の決定法の原理を概説し、その情報を統合してゲノム全体の塩基配列 を得る「ゲノムプロジェクト」の方法論を解説する。 （７）第５章前半 遺伝子の機能を調べる 1 日時：5/28 9:25-10:55 内容：ゲノム中の遺伝子の位置を決める具体的な実験手法について解説する。 （８）第５章後半 遺伝子の機能を調べる 2 日時：6/4 9:25-10:55 内容：遺伝子の機能を調べるための、(1)コンピューターによる機能解析、 (2)実際の遺伝子の 不活性化による機能解析、について概説する。 （９）第６章 ゲノムがどのようにして機能するかを理解する 日時：6/11 9:25-10:55 内容：ゲノムのタンパク質をコードしている遺伝子から生じたRNA分子の集合体である「トラン スクリプトーム」とその翻訳産物の集合体の「プロテオーム」ついてそれぞれの研究方法を概説 する。 5.3 ケーススタディー 出芽酵母ゲノムの塩基配列のアノテーション 出芽酵母ゲノムの特徴 真核生物ではあるが、遺伝子間配列が少なく、イント ロンは極めて少ないため、ORF同定が容易である。 約３０％の遺伝子が相同性検索から機能同定された 約１０％の遺伝子が相同性検索から他の生物にも見 出されることが分かっているが機能未同定である。 →オーファン（みなしご）遺伝子ファミリー 約３０％の遺伝子が相同性検索から他には見られな い出芽酵母固有の遺伝子である。 →単一オーファン遺伝子 酵母ゲノム配列をアノテーション した第１段階の結果 ORF数 ６１２０個 図5.28 トランスポゾンタギング法 図5.29 バーコード欠失法を用いた欠失カセット 図5.30 ゲノムがどのようにして 機能するかを理解する 本章のねらい 6 第 ●cDNAの塩基配列解析によってどのようにトランスクリプトーム研究が行われる かを述べる․ 章 ●トランスクリプトーム研究においてマイクロアレイやチップの技術の長所と短所を 評価し‚ これらの研究でわかった遺伝子発現パターン間の比較がどのように行わ れるかを説明する․ 6.1 ●酵母の生物学とヒトの癌について理解するうえでトランスクリプトーム研究が貢 献した例を挙げる․ トランスクリプトームの 研究 ●トランスクリプトーム研究とプロテオーム研究から得られた異なる形式の情報を 区別する․ 6.2 ●タンパク質プロファイリングをどのようにして行うか述べる․ プロテオームの研究 ●生細胞において互いに相互作用する２つのタンパク質あるいはタンパク質群を 同定する方法について比較し, その違いを述べる․ 特に, 物理的な相互作用と機 能的な相互作用を同定する方法について説明する. 6.3 ●タンパク質相互作用地図の例を挙げ, その重要な特徴について述べる․ ●生物学的プロファイリングの基礎と重要性について説明する․ ●システム生物学の原理と目的について概説する․ プロテオームの先に あるもの オーム研究 omeという接尾語 Genome(ゲノム) gene（遺伝子）とchromosome(染色体)からの造語 に倣い、計算機などを用いて大量の情報を網羅的に解析する 意味で用いられる。 ・ゲノム（遺伝子） ・トランスクリプトーム（転写産物） ・プロテオーム（タンパク質） ・メタボローム（代謝産物） ２００８年６月６日 6.1 トランスクリプトームの研究 トランスクリプトーム ある時点に細胞に存在するmRNAの総体 トランスクリプトーム研究 細胞に存在するmRNAを同定し、その相対的な存在量について 調べる。 トランスクリプトームの歴史 高密度 ●ハイブリダイゼーションによる方法 ・ドットブロット １～数１０（遺伝子） ＊遺伝子全長レベルをプローブに使える ・マイクロアレイ 数１０～数１０００（遺伝子） cDNA ＊遺伝子全長をプローブに使える ・ DNAチップ 数１０００～数万（領域） 合成DNA（～数１０ｂｐ） ＊対象遺伝子内に２０か所程度貼りつく配列が必要 ・タイリングアレイ 数万～１００万（領域） 合成DNA（～数１０ｂｐ） ＊対象DNA内全領域に貼りつく分の配列が必要 ●シーケンシングによる方法 ・SAGE法 mRNAを逆転写後細かく分断してシーケンシングする 得られた短い配列の場所と頻度を記録する 大量の塩基配列解析が必要（４５４シーケンサー等） シーケンシングによる方法 SAGE mRNAからcDNAを合成後、短くしてから片っぱしから塩基配列を決定し、 得られた配列の場所と頻度を測定する方法 大量サンプルを塩基配列決定 出来るシーケンサーが必要（たとえば４５４シーケンサー等の次世代機） 図6.1 マイクロアレイ解析 ハイブリダイゼーション した量の大小を疑似カ ラーに変換して表現 （決してこういう色が見え ているわけではないこと に注意！！） 図6.2 マイクロアレイとDNAチップ 遺伝子の一部 数１０ｂｐ ～遺伝子全長 手作業でもできる 見た目は大きいが低密度 半導体技術の応用 見た目は小さいが、高密度に オリゴDNAが合成されている 図6.3 トランスクリプトーム解析の注意点（１） ハイブリッド形成のシグナルの強度 とプローブ量の関係 飽和状態のことを専門用語で “サチる” という 英語の“saturated”から ここが勝負!! サチると濃度 はわからない 図6.4 トランスクリプトーム解析の注意点（２） 選択的スプライシング 選択的スプライシング（alternative splicing） 真核生物のスプライシングは様々な経路で起こる場合があるので、 mRNA量を評価する場合これらの取り扱いには注意が必要 図6.5 １回の実験で２つのトランスクリプトーム を比較する （とても重要な概念） 野生型 混ぜて ハイブリ 変異型 cDNA cDNA ●で標識 ●で標識 同じ場所の●/●を比較する ことで、両者の発現量の 比率がわかる ●の量を見ている ●の量を見ている 図6.6 遺伝子発現プロファイル 階層的クラスタリング ２つ以上のトランスクリプトーム間の遺伝子発現パターンの比較より、 よく似た発現パターンの遺伝子をクラスタリング（グループ化）することで、 遺伝子間の機能の関連性を調べる方法 図6.7 ７つのトランスクリプトームにおける５個の遺伝子の発現プロファイルの比較 ７つのトランスクリプトームは、成長培地に高エネルギーの栄養を加えて培養した 細胞から、経時的に採取したものより得られた。階層的クラスタリングによってデータ を解析した後、系統樹が作成され、５個の遺伝子の発現プロファイル間の類似度が 示されている。 胞子化のトランスクリプトーム変動 環境シグナルに対する遺伝子発現応答がどのように起こるか分かってくる 各ステージ で転写増加 ↑ 250種 胞子形成時 に転写減少 ↑ 158種 ↓ 600種 ↑ 61種 ↑ 5種 図6.8 タイリングアレー解析 あるゲノム領域内の全長をカバーするDNAチップ この例では、ヒト２１番と２２番染色体に沿って平均３５ｂｐごとに合計１００万 のプローブが作成された。この結果、従来から知られているエキソン以外の 場所からもmRNAが発見され、アノテーションに重要な役割を果たす。 図6.9 プロテオームの研究 大きく分けて２つある ●タンパク質の同定・定量・経時変動 ・どんなタンパク質がどの程度存在するか ・あるタンパク質の存在量の時間変化 ・野生型と変異型の間で存在量の異なるタンパク質の同定 ●タンパク質の相互作用（インターラクトーム） ・どのタンパク質がどのタンパク質と相互作用しているか、 そのネットワークを調べる 二次元電気泳動 等電点 タンパク質の正と負の 電荷の総和がOとなるｐH 等電点電気泳動 大きさ 図6.10 二次元電気泳動の結果 pH5側 等電点 pH6側 大きさ 大きい 小さい 注目するスポットを切り出し質量分析によりタンパク質を同定する 図6.11 プロテオーム中のタンパク質の同定 ゲノム配列から予想さ れるアミノ酸配列と一 致するかどうかにより タンパク質を同定する 図6.12 ICAT （同位体で標識する方法） 生物A 重水素無し標識 生物B システイン標識 重水素入り標識 トリプシン処理 赤 生物A 青 生物B 混合して質量分析計にかける 訂正 教科書p.181の 図の説明は 赤と青の色が 入れ替わっている 正 赤→水素 青→重水素 水素と重水素の質量数の差（●と●で質量数が異なる） 図6.13 ファージディスプレイ ファージの外殻にタンパク質を提示する方法 ファージを使うことの利点 ＝ 遺伝子型と表現型の 対応している 提示しているタンパク質の 遺伝子が内部にある “遺伝子付きのタンパク質” 図6.14 ファージディスプレー２ いろいろなコートタンパク質を 持ったファージたち PCRで増幅後塩基配列を調べることで タンパク質のアミノ酸配列を明らかに 出来る 図6.14 酵母ツーハイブリッド法 ベイトタンパク質に結合するタンパク質をライブラリーからスクリーニングする方法 釣れた タンパク質 ベイト（えさ） を融合した DNA結合 タンパク質 ・生えるようになる ・色がつく など ベイトとは相互作用しない タンパク質（はずれ） ・生えない ・色がつかない など 図6.15 ツーハイブリッド法の問題点 ベイトの使用した場所よりとれるものと取れないものが出てくる 本来の C D A の姿 B E C D ツーハイブリッド法で 釣れる可能性あり A B E 図6.16 アフィニティーカラム カルモジュリン 融合タンパク質 ベイト カルモジュリン 結合タンパク質 P.185のタンデム アフィニティーの 部分は完全な 誤訳 質量分析計でどんな タンパク質があるか調べる 図6.17 アフィニティー精製の問題点 本質的にツーハイブリッド 法と同じ 本来の の姿 ベイトを固定する 方法により、本来の 能力を失う場合がある 樹脂 担体 図6.18 出芽酵母のタンパク質相互作用地図 円はタンパク質を示す 楕円はタンパク質複合体を示す 図6.20 インターラクトームネットワーク ツーハイブリッド法をはじめとする様々な相互作用解析法により得られた相互 作用をしているタンパク質間を線で結んだ結果 たくさんの相互作用を持つ少数のタンパク質（ハブ）と 相互作用の少ない多くのタンパク質に分類された。 個々の遺伝子が壊滅的な変異を受けても、プロテオームに与える影響を 最小限に抑える構造になっている。 （ハブタンパク質が変異する場合は被害が深刻） （多くの生物で）遺伝子の不活性実験を行った結果、かなり多くのタンパク質が 不必要であるという実験結果と一致する。 ハブには２種類ある パーティーハブ すべてのパートナーと同時に作用（全体の構造に対する影響小） デートハブ 異なる時間に相互作用（全体の構造に対する影響大） パーティーハブとデートハブ パーティーハブを取り除いた場合 構造変化小 デートハブを取り除いた場合 構造変化大 6.3 プロテオームの先にあるもの 板谷 金井 中東 石濱 曽我 メタボローム 図6.22 メタボローム ある特定の条件下での細胞または組織中に存在する代謝産物 の完全な集合体 これを定量できるようになると 代謝フラックス 各種生化学反応の反応速度論とメタボロームのデータを統合することで、 代謝産物の流れ、即ち、代謝フラックスを知ることが可能となる 代謝工学 例えば、細菌での抗生物質の合成量を増加させる目的で、変異や組み換え DNA技術によってゲノムを変化させ、細胞の生化学に影響を与える技術が 可能となる。 システム生物学の例 大腸菌の鞭毛の生合成に関与するシステム ３つのグループに分かれる１２個のオペロンによって制御される５１遺伝子からなる レポーター遺伝子を用いて 遺伝子発現の順序や発現量がわかる 本システムをコンピューター上で モデル化可能になった 図6.23
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