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Issue Date
イネ萎縮ウイルスゲノム転写産物の CDNA 合成
松村, 健; 上田, 一郎; 佐野, 輝男; 四方, 英四郎
北海道大学農学部邦文紀要, 16(2): 194-198
1988-10-31
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/12093
Right
Type
bulletin
Additional
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Information
16(2)_p194-198.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
イネ萎縮ウイノレスゲノム転写産物の cDNA合成
松村
健*・上回一郎
佐野輝男・四方英四郎
(北海道大学農学部植物学教室)
(*北海道グリーンパイオ研究所)
(
/
I
B和 63年 6月 7 日受理)
cDNA Synthesis of Rice Dwarf Virus Transcripts
Takeshi MATSUMURAヘ IchiroUYEDA，Teruo SANO
and Eishiro SHlI
王ATA
(Department o
fBotany，Facultyo
fA
g
r
i
c
u
l
t
u
r
e，
H
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ω
，
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王k
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doGreen-Bio I
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t
u
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)
(
σ
*
H
o
k
東京大学
緒
言
植 物 RNAウイノレスゲノムの cDNAを合成し，逃伝
子レベノレで解析する試みは， 3
'末端にポリ A鎖をもっ
岡田教授から分与された物を用いた。反応産
物は， 2%アガロースゲ Jレ電気泳動 (
9
0m Mt
r
i
s
9
0m M
b
o
r
i
ca
c
i
d
1m MEDTA) で検定した。
一 本 鎖 cDNA合 成
ウイルスが少ないことから立ち後れていた。しかしなが
一一本鎖 cDNA合成は，オリゴ dT鎖をプライマーに用
ら，ポリ A ポリメラーゼの発見 4) や，ランダムプライマ
い
， 50mMトリス塩酸緩衝液 (
4
2Cで pH7
.
9
)，1
0m M
ーの開発 5) などのクローニング技術の急速な進歩ミと共に
塩化マグネシウム， 30mM塩 化 カ リ ウ ム 10mMジチ
0
近年では，ほとんどの純物ウイノレスグループのクローニ
オスレイトーノレ， 1m M
，dATP
，dCTP
，dTTP
，dGTP
，
ングに試みられる様になった。
7
.
4pmolのポリ A 鎖を付加したイネ萎縮ウイノレスゲノ
イネ萎縮ウイノレスは，純物レオウイノレスに l
脅し 1
2木
ム転写産物， 5μgオリゴ dTプライ
7
ー
， 90URNasin
に分配i
し た 二 本 鎖 の RNAをゲノムとするウイノレスで
(RNase阻害剤)からなる反応液中に 52Uの逆転写酵素
ある。更に粒子由来の転写醇素により各々に対応する
(生化学工業)を加えて 4
2Cで 1時間反応させた。 cDNA
mRNAを試験管内で合成する 7
)。そこで，イネ萎縮ウイ
合成効率は，反応液中に[日 _
3
2
P
]dCTPを加え，計測さ
0
ルス粒子の遺伝子解析を目的として，この転写酵素を
れる取り込み量から算出した。取り込み量は，政不溶分
利用し，ゲノム RNAか ら 転 写 さ れ た 一 本 鎖 RNAの
画をトノレエンシンチレーター中でアロカシンチレーショ
cDNA合成及びそのクローニングを試みた。
ンカウンターを用いて測定した。反応産物は，アルカリ
アガロースゲノレ電気泳動法 2) で分析した。
実験材料及び方法
二 本 鎖 cDNA合 成
t
tl'Q 転 写 産 物 の 調 整
イ ネ 萎 縮 ウ イ ル ス の れt v
二 本 鎖 cDNA合成は， GUBLERa
nd HOFFMANl)
当研究室で継代保存しているイネ萎縮ウイルス感染イ
の方法に準じて行った。すなわち，反応液中に， 1
.45μg
ネより UYEDAand SHIKATA の方法的でウイルスを
の合成された一本鎖 cDNAと転写産物のハイブリッド，
純化した。純化ウイノレスからの転写産物の試験管内合成
Z
10μCi[
a
_3
P
]dCTP(
3
0
0
0Ci/mmol)を加え，二本鎖
は
， UYEDAand SHIKATAの方法 7) を用いて行った。
0
cDNA合成効率を測定した。 1
20C，1時間更に 2
2
C，1
転写産物 3
'末端へのポリ A 鎖の付加
時間反応させた後，反応産物を S
ephadexG-50パスツ
ーノレピベットカラムでf
古製した。
3
'末端へのポリ A 鎖の付加反応は， OHNOらの方法 3
)
に準じて行った。反応に用いたポリ A ポリメラーゼ、は，
1
9
4
1
9
5
松村・上回・佐野・四方: イネ萎縮ウイノレスの cDNA合成
オリゴ dC鎖の付加及び形質転換
一本鎖 cDNA合成
'末端へのオリゴ dC
合 成 さ れ た 二 本 鎖 cDNAの各 3
ポリ A 鎖付加反応 2分
， 1
0分の各転写産物を用いて
鎖の付加は， 1
4
0m Mカコジノレ酸ナトリウム， 30mMト
a・3
2
P
]dCTPの取
一本鎖 cDNAの合成を行った結果， [
.
8
)，2m M塩化コバノレト， 0.2mM
リス塩酸緩衝液 (pH6
り込みが認められたが，ポリ A鎖付加反応 2分の転写産
ジチオスレイトーノレ， 0
.
2
3m MdCTP 中に合成された
物を用いた方が合成効率はよかった (
F
i
g
.
2
)
。一本鎖
erminaldeoxynucleotidyl
二 本 鎖 cDNA と 4Uの t
cDNA合成反応時の塩濃度の影響を調べた結果，塩化カ
00C で‘行った。反応時聞は，制限酵
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s巴を加え 3
リウム濃度 30mMの方が [
α
_
3
2
P
]dCTPの 取 り 込 み 量
素 PuuI
Iで 1カ所切断したプラスミド pBR322を用
F
i
g
.
3
)，また，合成反応 2
0分
， 4
0分
， 6
0分で
が多く (
L
，
、 3H-dCTPの取り込み量から算出した。
の各試料の 2%アノレカリアガロースゲノレ電気泳動の結果
オリゴ dC
鎖を付加した二本鎖 cDNAは，プラスミド pBR3
22の
P
s
t1切 断 部 位 に オ リ ゴ dG鎖 を 付 加 し た ベ ク タ ー
(BRL社製)0
.
0
3pmolとアニーリングした後，塩化カノレ
(xl03
c
p
m
)
シウム処理した大腸菌 HB101に取り込ませた。形質転
3
換の方法は， MANIATIS ら2) の方法に準じて行った。
定申
験
士ロ
実
果
2
転写産物へのポリ A 鎖の付加
， 5分
， 10 分の各試料を 2~もア
ポリ A 鎖付加反応 2分
ガロースゲノレ電気泳動した結果，反応時間が進むにつれ
て転写産物の各バンドがわずかに上方へ移動しているの
F
i
g
.
1
)
。この結果は，転写産物の 3
'末端に
がみられた (
。
ポリ A鎖が付加されていくのにつれて移動度が遅くな
ったためで-ある。
1
2
3
4
20
40
60
(
m
i
n
.)
n
c
o
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p
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l
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f 32P-dCTP t
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dcDNA
. PolyA t
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:
0，2m
in.
e，10min.
{EJ02
内
10
AhU唱 l 島 内 内
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巴c
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n time on polyadenylat
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c
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. Polyadenylated
RDV t
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s
c
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s were analyzed on 2%
.
agarosegel
l
a
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e1
:
l
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n
e2
:
l
a
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e3・
l
a
n
e4・
RDV t
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s
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s
.
2min.
5min.
10min.
20
40
60
。
目
100
(min.)
F
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.3
. E任e
c
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fKClconcentrationonr
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no
fRDVR NA.
KCl concentration:
e=30m M，0 =50mM.
1
9
6
a
北海道大学農学部邦文紀要第 1
6巻 第 2号
1
2
3
4
5 6
J
(x10 cpm)
22・
C
12・
C
3
2
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.4
. Autoradiograph o
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l Synthesized ssDNA was analyzed
KC.
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l
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a1
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KClc
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; l
a
n
e1
，3，5: 30m M
l
a
n
e2，4，6
:5
0m M
Reaction time; l
a
n
e1
，2:20min.
:4
0min.
l
a
n
e3，4
:6
0m
i
n
.
l
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n巴 5，6
l
p
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I
Id
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;I
pBR3
2
2
。
6
0
30
90
120 (
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.)
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f 32P-dCTP t
o double
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d cDNA. I
n
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i
o
n temperature
0
0
Ct
o2
2
C
.
waschanged from1
2
1
2
3
でも，バンド聞にみられる不完全長 cDNAの量が少な
F
i
g
.
4
)
。これらの結果から一本鎖 cDNA合成
かった (
は，ポリ A鎖付加反応を 2分行った転写産物を用 L、，極
化カリウム濃度 30mMで反応を行ったところ，一本鎖
cDNAの合成効率は，約 48%であった。
二本鎖 cDNA合成
二本鎖 cDNA合成反応でのい _
3
Z
P
]dCTPの 取 り 込
0
ZC，1時間では，おもにリボ兄クレ
み量を調べた結果 1
アーゼ H の働きにより一本鎖 cDNAとハイブリッドを
"
o
Cでは，二
形成している転写産物の部分が分解され， 2
F
i
g
.
5
)
。
本鎖の cDNAが合成された (
0
2
2C反 応 後 の 試 料 を 2%アノレカリアガロースゲル電
気泳動した結果，二本鎖 cDNAが合成されたが，低分子
の cDNAが多かった (
F
i
g
.
6
)
。
二本鎖 cDNA各 3
'末端へのオリゴ dC鎖の付加及び
形質転換
'末端に付加するオリゴ dC鎖の
二本鎖 cDNAの各 3
数は1O ~15 個であることが望ましいとされている。そ
こで， pBR322を Pvu1
1で切断し，反応液中に加えた
3H-dCTPの取り込み量と pBR3
2
2のモノレ数から反応
時聞を 5分から 1
0分と決定した。この条件でオリゴ dC
鎖付加反応を行った二本鎖 cDNAを sephadexG-50
F
i
g
.6
. Autoradiograph o
fs
y
n
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h
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d double
s
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'
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d cDNA
ine agarose
was a
n
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d on 2% a
l
k
a1
l
ge.
l
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: double s
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l
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: s
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d cDNA.
l
a
n
e3
: HpaII d
i
g
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s
t
e
do
fplasmid pBR3
2
2
.
1
9
7
松村・上回・佐野・四方: イネ萎縮ウイノレスの cDNA合成
(
d
開}
(qxnl
1
5
0
1
0
0
0
0
易に全長の cDNAを合成し得る方法であるが，本実験
では，一本鎖 cDNA反応程の高い二本鎖 cDNA合成効
率は得られず，二本鎖 cDNAの合成効率は一本鎖 cDNA
に対して 1670であった。これは，二本鎖 cDNA合成の
際鋳型となる一本鎖 cDNAに不完全な長さの分子が多
かったためと考えられる。二本鎖 cDNA各 3
'末端への
1
0
0
5
0
0
0
dC鎖の付加反応は， pBR3
2
2を用いた予似1
実験で‘は 5分
から 1
0分 で 完 了 し た 。 し か し 本 実 験 で は ， 二 本 鎖
cDNAのモノレ数は予備実験で算出した pBR322のモ Jレ
0倍以上であったにも関わらず反応時間 5分
数より数 1
0分で目的とされるオリゴ dC鎖が付加されてい
から 1
5
0
1
0
0
0
4
0
0
3
0
0
2
0
0
1
0
0
。
10 (
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)
5
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. 32P-cpm and 3H-dpm o
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n
d cDNA.
o=32pcpm，
口 =3Hdpm.
0分
たため，反応系に過剰の dCTPがあれば 5分から 1
で反応が完了することが判明した。抗生物質によるスク
リーニングの結果得られたクローンは，紅l
み込まれた
cDNAの長さによる選抜が行われていないため数十臨
ま対からなるクローンも得ていると思われるが，短い
:
J
cDMA断 ーを含んだクローンの数が多くなればクロー
ニング後のスクリーニング量が多くなるため， ，正予質転換
I
I
iの cDNAのサイズによる分画をカラムない
に用いる 1
しは電気泳動を用いて行う必要があると忠われる。
摘 要
パスツーノレピペットカラムで分画し，各分画の 3
Z
p量及
び 3H.
量を測定した結果，二本鎖 cDNAを含む分画，す
1 試験管内で合成したイネ萎縮ウイノレスゲノム転写
2
pの取り込みのある分画にも 3Hの 取 り 込 み
なわち， 3
産物の 3
'末端にポリ A ポリメラーゼを用いてポリ A 鎖
があり dC鎖が付加されていた (
F
i
g
.
7
)
。
オリゴ dC鎖を付加した二本鎖 cDNAで 大 腸 肉 HB
1
0
1を形質転換し，
テトラサイクリン又はアンピシリン
を含む培地上て、選抜したところ 5μgの鋳型 RNAより
合成した cDNAより 1
6
4個のクローンを得た。
を付ー加した結果，各分節に均等にポリ A 鎖 が 付 加 さ
れた。
2 ポリ A 鎖付加反応 2分または 1
0分行った転写産
物を鋳型にしオリゴ dT鎖プライ
7
ーと逆転写酵素によ
り一本鎖 cDNA合成を試みたところ，付加反応 2分の
転写産物を用いた方が合成効率はよかった。
論議及び考察
梢物 RNAウイノレスは，
3 一本鎖 cDNA合成反応に対する塩濃度の影響を
ゲノムの 3
'末端にポリ A 鎖
調べた結果，指化カリウム波度 30mMの時の合成効率
を持っていることが少なく，そのため， cDNA合成の￨際、
が高かった。決定された条件でー木鎖 cDNA合成を行
にプライマーとアニーノレする相補配列を付加することが
った結果， ー木鎖 cDNA合成効率は，約 48%であった。
必要である。
木実験で用いたポリ A ポリメラーゼは，付加される
4
. 二本鎖 cDNAを合成した結果，合成効率はー木鎖
cDNAに対して約 16%であった。合成後の試料を 2%
RNAの塩基数に関係なく均等にポリ A鎖が付加され
アノレカリアガロースゲノレ電気泳動したところ全長に相
F
i
g
.
1
)
。ー木鎖 cDNA合成反応では，反応液中の血
た(
当すると思われる cDNAよりも断 J
:
-的な長さの cDNA
化カリウム濃度が 30mMの時が合成効率が良く，反応
がより多くみられた。
0分で、すでに各分節の全長に相当する一本鎖が
開始後 2
5
. 合成されたご.木鎖 cDNAにオリゴ dC鎖を付加，
合成されていた。この反応系での一本鎖、 cDNA合成効
pBR3
2
2に組み込んだ後大腸I
如こ取り込ませた結果，
率は， 48%で、あった (
F
i
g
.
4
)
。二木鎖 cDNA合成で用
1
6
4個のクローンが得られた。
いた GUBLERandHOFFMAN の 方 法 は ， 今 ま で の
cDNA合成方法に比べて実験操作すが少ない一l
二，比較的容
北海道大学長学部ず¥
1文 紀 要 第 1
6巻 第 2号
1
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d by t
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-
参考文献
1
. GUBLER，U. and HOFFMAN，B
.・
.
1 A simple
andverye
f
f
i
c
i
e
n
tmethodo
fgeneratingcDNA
l
i
b
r
a
r
i
e
s
. Gene2
5
:2
6
3
2
6
9
.1
9
8
3
.F
.andSAMBROOK，
2
. MANIATIS，T.FRITSCH，E
}.:“ MolecularC
lonig": A laboratorymanual
.
a
s
s
o
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i
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. V
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2
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Summary
Conditions f
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r cDNA s
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c
e dwarf
v
i
r
u
s(RDV) were i
n
v
e
s
t
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g
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t
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d
. Rice dwarf v
i
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5
. Cold Spring Harbor Laboratory. 1982
pp 5
t
r
a
n
s
c
r
i
p
t
s synthesized by RDV v
i
r
u
sp
a
r
t
i
c
l
e;
n
3
. OHNO，T. TAKAMATSU，N. MESHI，T. and
v
i
t
r
o were polyadenylated f
o
rs
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n
g
l
es
t
r
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dcDNA
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y
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目
.
: Hop stunt viroid: molecular
OKADA，Y
cloning and n
u
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e sequence o
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The RNAs were polyadenylated f
o
r 2 minutes
p
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ecDNAc
o
p
y
. Nuc.
lAcidsRes. 11: 6185-
and 1
0 minutes. Single s
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d cDNA s
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. SIPPEL，A. E
.
: Puri五c
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n and c
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s experiment
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d adenyltransferase from E
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e optimal concentrationo
fKClf
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Eur
.}
. Biochem. 3
7
: 31
. 1973
5
. TAYLAR，
.
1
.M.，ILLEMENSEE，
R
.andSUMMERS，
.
1
.
: E伍 cienttranscription ofRNAintoDNA
s
i
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e strand cDNA s
y
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s was determined t
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be 3
0mM. The e
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s was 48% f
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rRDV t
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s
. Double
byaviansarcomav
i
r
u
spolymerase. Biochem.
strand cDNA s
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