下水試料を対象としたエストロゲンのＧＣ/ＭＳによる高感度測定法帝人エコ・サイエンス（株） ○末岡峯数、大岩俊雄、田辺薫独立行政法人土木研究所八十島誠、小森行也、田中宏明目次１．２．３．４．はじめに－測定対象エストロゲン試料の前処理フロー＆ＧＣ/ＭＳ測定条件誘導体化の検討測定精度（１）検量線（２）繰り返し測定精度（３）添加回収試験５．下水試料の測定結果６．まとめ付表ＧＣ/ＭＳクロマトグラム－標準液＆下水試料１．はじめに・下水試料は多くの夾雑成分を含むため、前処理精製法が重要である。・エストロゲン類のホルモン作用は、内分泌撹乱化学物質のエストロゲン様活性に比べて高く、低濃度でも生物的影響を及ぼす可能性があるため、高感度測定法が必要である。・ＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法より更に高感度測定法の検討と確認。測定対象エストロゲン２．下水試料の前処理精製フロー基本フロー E1 , E2 , EE2 測定 E1 , E2 , EE2 , E3 測定試料 ↓ 濾過 ↓ ろ　液 ↓ ← SS 抽出液は濾液に (MeOH 超音波抽出) サロゲート添加各 d体 20ng 固相抽出 ↓ 溶出 ↓ 濃縮乾固 ↓ 溶解 ↓ 遠心分離、N2ブロー乾燥 ← 溶出溶媒 6ml ← ← 溶出溶媒 EtO A c/M eO H (1/1) 10%アセトン/D C M アセトン洗浄 6ml N 2ブロー ← MeOH 1ml ← MeOH 5ml N 2ブロー ← DMFA 100μl BSA 200μl TM S化 (80℃/60min) ↓ 濃縮乾固 N 2ブロー ↓ 溶解 ← ウンデカン ↓ G C -M S EtO A c/M eO H (5/1) n-Hx/DCM(1/1) 1ml N H 2カラム ↓ 溶出 ↓ 濃縮乾固 ↓ 溶解 ↓ O asi s H LB N 2 ブローフロリジルカラム同上 10ml ↓ 溶出 ↓ 濃縮乾固 ↓ 溶解 ↓ C 18 カートリッジ 100μl ＨＲ－ＧＣ/ＭＳ測定条件 G C M S 装置カラム温度 (昇温速度) 注入量 H P 6890 Series H P -5M S 0.25m m × 30m 150℃ - 300℃ (20m in) ( 20 ℃・ m in-1 ) 1 μl 装置イオン化分解能測定イオン(SIM ) 測定対象 E1 /E1-d2 E2 /E2-d3 EE2-1/EE2-d4 EE2-2/EE2-d4 E3 /E3-d2 JEO L JM S-700D ( 二重収束型 ) EI ( + ) 1000 SIM (m /e) 342.21 344.22 416.26 419.28 368.22 372.25 425.24 429.26 504.30 506.31 TM S化物 3-TM S-E1 3,17-TM S-E2 3-TM S-EE2 3,17-TM S-EE2 3,16,17-TM S-E3 ＨＲ－ＧＣ/ＭＳ測定条件２参　考 TM S化物のM S(EI)イオンの相対強度 TM S化物 3-TM S E1 3,17-TM S-E2 3-TM S-EE2 3,17-TM S-EE2 3,16,17-TM S-E3 M+ 10 10 9 (1 ) 11 〔M -C H3)〕+ 備　考 ( 1 ) : 基準 (1 ) (1 ) (1 ) 2 (1 ) ４．測定精度（２）繰り返し測定精度標準液の繰り返し測定　(LC -M S/M S法との比較) 注入量　10 pg 測定対象 G C /M S法 LC -M S/M S法注入量　1μl/10ppb(1ng/0.1m l)標準液注入量 10μl/ 1ppb(1ng/1m l)標準液 H R-G C /M S測定(n=6) 平均値 C .V. ID L ppb % pg LC -M S/M S測定(n=6) 平均値 C .V. ID L ppb % pg E1 10.44 1.2 0.37 1.11 6.0 2.1 E2 9.97 0.5 0.15 1.11 6.9 2.3 EE2 10.58 1.4 0.44 0.99 10.4 3.1 E3 10.61 1.7 0.53 1.19 10.4 3.7 ID L :装置検出下限(注入量の　３Ｓ値) ＬＣ－ＭＳ/ＭＳとの検出下限値の比較測定対象 H R - G C /M S 法 ng・ l-1 参考 LC -M S /M S 法 ng・ l-1 E1 0.04 0.2 E2 0.02 0.2 EE2 0.04 0.3 E3 0.05 0.4 分析試料量 1L 検出下限値標準試料の繰り返し測定の 3 S 値４．測定精度（３）添加回収試験結果測定対象無添加 ng 純水添加 ng 二次処理水流入水回収率無添加添加回収率無添加添加回収率 % ng ng % ng ng % E1 0.1 20.1 100.1 1.0 21.5 102.6 4.0 26.0 110.0 E2 0.0 21.1 105.7 0.2 20.2 99.6 1.2 22.0 103.6 EE2 0.0 18.9 94.6 0.0 18.9 94.5 0.0 18.7 93.5 E3 0.0 20.0 99.9 0.9 20.3 97.0 24.3 44.4 100.5 試料純水　、二次処理水　、流入水添加量各 20 ng 内部標準(サロゲート) 各 20 ng ( 各　0.5L ) ５．下水試料のエストロゲン測定結果下水処理場概要水処理方式標準活性汚泥法エストロゲン測定結果ＨＲ－ＧＣ/ＭＳ法下水試料 E1 流入下水二次処理水 (最終沈殿池流出水) 測　定　対　象 E2 EE2 備　考 E3 28.84 3.99 <0.04 99.82 4.78 0.24 <0.04 0.41 -1 単位:ng・ l (参考) LC -M S /M S 法下水試料 E1 流入下水二次処理水 (最終沈殿池流出水) 測　定　対　象 E2 EE2 備　考 E3 27.2 3.2 <0.5 130.1 4.4 <0.5 <0.5 <0.5 -1 単位:ng・ l EE2 は流入下水及び二次処理水とも検出されなかった。 (検出下限値以下) ６．まとめ  下水試料を対象としたエストロゲン遊離体４種（Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，ＥＥ２）についてＨＲ－ＧＣ/ＭＳを用いた高感度測定法について検討した。  下水試料の前処理精製法は、既報のＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法で実施している方法に準じて実施した。  誘導体化は市販のシリル化剤について比較し、反応が早く濃縮が容易なＢＳＡ（N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamide)を用いて検討した。  エストロゲン遊離体のＢＳＡシリル化物のＨＲ－ＧＣ/ＭＳ測定は、以下のＳＩＭイオンを用いて測定した。 E3 EE2 E2 E1 測定対象 3, 16, 17-T M S -E3 3, 17-T M S -EE2 3-T M S -EE2 3, 17-T M S -E2 3-T M S -E1 シリル化物 M+ 〔 M -C H 3〕 + M+ M+ M+ S IM イオン６．まとめ（２）  ＨＲ－ＧＣ/ＭＳを用いた測定は、四重極ＭＳを用いたＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法に比較して、いずれも約１桁高い検出感度が得られた。  下水試料への添加回収試験は、いずれも９４～１１０％の良好な結果が得られた。  標準的な下水処理場の流入水及び二次処理水について測定し、従来のＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法の検出下限値以下の濃度まで検出できた。ただし、ＥＥ２については、流入水及び二次処理水とも０．０４ng・Ｌ－１のレベルを下回っていた。