araC_lacI oscillator 1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす -2. GFP、lacI、araCのパーツをPCRで増やす 2. promotor+RBS+adaptor+teminatorをプラスミドの中に入れる 3. araC、GFP、lacIのORFをHindIIIで入れる 4. araCとGFPをつなぐ 5. araC_GFP、lacIを同時に大腸菌に入れる Step1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす方法: PCRで増やす Adaprtorの部位は backboneに切れる場所がない酵素を選ぶ (検討中) 必要なもの: *注文したprimer *P1.1H Primerとして注文 EcoRI 5’ P1.1H Adaptor(パーツ以外の制限酵素部位、HindIII) B0010 XbaI ParaC/lacI RBS B0012 speI pstI 3’ HindIIIはpromotorに切れる場所があるので、直す Primer 5’側 EcoRI Adaptor(パーツ以外の制限酵素部位、HindIII) XbaI ParaC/lacI 5’ RBS Terminatorの最初の部分 3’ 配列 5’ GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT catagcatttttatccataagattagcggatcctaagcaatacaattgtgagcgctcacaattatgatagattcaattgtgagcggataacaatttcaca BBa_B0010 attaaagaggagaaa AAGCTT TTCGAA ccaggcatcaaataaaacg 3’ Primer注文 3’側 speI pstI 5’ Teminatorの最後の部分 3’ 配列 gggcctttctgcgtttata のantisense BBa_B0012 GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT Step1-2. GFP、lacI、araCのパーツをPCRで増やす方法: PCRで増やす必要なもの: *注文したprimer *パーツ #GFP(P1.2B) #lacI(P1.7L、P1.2Oのどちらか) #araC(P1.14L) HindIII 5’ HindIII パーツのORF ssrA tag 3’ primer 5’側 HindIII 5’ 配列 5’ GFP 5’ lacI 5’ araC AAGCTT TTCGAA AAGCTT TTCGAA AAGCTT TTCGAA ORFの最初の部分 3’ P1.2B Atggtgagcaagggcgagg 3’ P1.2O/7L Atggtgaatgtgaaaccagtaacg 3’ P1.14L Atggctgaagcgcaaaatgatcc 3’ Primer(続き) 3’側 HindIII 5’ ssrA tag ORFの最後の部分配列 P1.2B Ggatgaactatacaaataataaのantisense GFP 3’ Acgcgtgcaaacgacgaaaactacgctttagcagcttaacgcgtの 3’ AAGCTT TTCGAA 5’ antisense lacI araC P1.2O/7L Gctggcacgacaggtttcc のantisense 3’ 同上(ssrA tagの antisense) P1.14L Gccgtcaagttgtcagctのantisense 3’ 同上(ssrA tagの antisense) AAGCTT TTCGAA 5’ AAGCTT TTCGAA 5’ Step2. promotor+RBS+adaptor+teminatorをプラスミドの中に入れる必要なもの: Plasmid backbone *ColEI(P1.3D) *p15A(P1.9CとP1.9G、同じものだけどQualityに不安があるのでどちらもやる) 方法: パーツの制限酵素で切って貼る。ぷちっ☆ Step3. araC、GFP、lacIのORFをHindIIIで入れる araCとGFPはColEI、 lacIはp15Aに入れます。間違わないように！！よいしょ☆ Step4. araCとGFPをつなぐ araCとGFPをつないで、１つのプラスミドに入れる Step5. araC_GFP、lacIを同時に大腸菌に入れるうまくいけば振動する。。。