天然型より高性能なmiRNAと DNAからなるmiRNA阻害剤LidNA 大阪市立大学大学院工学研究科准教授立花亮世界初のDNAからなる miRNA阻害剤LidNA ・LNAと同等以上の阻害活性ヘテロLong siRNA ・siRNAと同等の活性・免疫応答を引き起こさないキメラLong miRNA/siRNA ・天然型miRNAの４倍以上の活性ヘテロLong siRNA ・siRNAと同等の活性・免疫応答を引き起こさない Ida, et al. J. Biosci. Bioeng.117: 401-406(2014) 0.8 siPol HsiPol 1m 2m 3m 4m 5m 6m 7m 8m 9m 10m 11m 12m 13m 14m 15m 16m 17m 18m 19m 20m 21m 22m 23m 24m 25m control Normalized DsRed/GFP ratio ミスマッチ位置の最適化 1 5 nM 25 1 x 0.6 0.4 0.2 0 mismatch position Normalized DsRed/GFP ratio 5 nM 6 nt 1 3’ 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 siPol HsiPol_7m GGAGGA GGTGGT AACAAC AAGAAG CCACCA CCTCCT TTCTTC TTGTTG control 1 siPol HsiPol_7m AGGAGG TGGTGG CAACAA GAAGAA ACCACC TCCTCC CTTCTT GTTGTT control 延長配列は5’側にG-rich配列がよい 5 nM 6 nt 5’ ヘテロLong siRNAはsiRNAと同等の活性がある 6 9 12 9-21塩基の延長がよい 15 18 21 control 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Normalized DsRed/GFP ratio 1 siRNAと違い、免疫応答を引き起こさない IFNβ 60 12 50 10 40 OAS1 7 6 5 8 30 4 20 3 6 4 2 10 0 mock 1 mock 0 mock poly (I:C) 2 0 9 8 poly (I:C) Fold activation/GAPDH 14 IP-10 poly (I:C) 16 キメラLong miRNA/siRNA ・天然型miRNAの４倍以上の活性組み合わせが必要ミスマッチの位置 G-rich配列による延長延長配列のDNA化 Control 50 pM 天然型 miR-143 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Normalized DsRed/GFP ratio 1 天然型miRNAより４〜７倍活性が高い Normalized DsRed/GFP ratio 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20 10 0 0 5 0 2 5 1 0 20 10 5 0 0 0 2 5 10 pM 2.5 MIAPaCa-2 2.5 HeLaS3 2 1.5 1.5 1 0.5 0.5 0 0 Control 1 Control cell viability 2 5’– augagauucaacagucaacTT -3’ 3’– TTuacucuaaguugucaguug –5’ この構造を siRNAにも応用 pri-miR-21 pre-miR-21 18 ga a a a u 5’- uagcuuauc gacug uguug cugu a 3’- ugucggguag-cugaccacaac-ggua c cu u 36 mature miR-21 5’- uagcuuaucagacugauguuga -3’ MIA PaCa-2 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 Control 0 0 Control cell viability 1 HeLa-S3 天然型のmiRNA あるいは従来型のsiRNAで活性を見落としていたもの低い活性のため、開発を断念したもの活性がはっきりと見える可能性がある。世界初のDNAからなる miRNA阻害剤LidNA ・LNAと同等以上の阻害活性 DNAなのになぜ阻害活性がある？単純なDNA相補鎖はmiRNAを全く阻害しないことが知られていた。しかし・・・二本鎖部位が miRNA阻害活性に必要 miRNA結合部位(MBD) プロトタイプLidNA 二本鎖部位二本鎖部位があることで結合力は約2,000倍向上、LNAより強力 LidNA-type probe semi-LidNA-type probe single strand probe miRNA binding domain probe-type LidNA-type semi-LidNA-type single strand LNA 2’-O-MeRNA ka (M-1s-1) 9.2 x 104 1.4 x 104 1.9 x 102 5.0 x 102 3.3 x 102 kd (s-1) 5.0 x 10-5 9.6 x 10-5 1.9 x 10-4 2.4 x 10-6 1.2 x 10-5 Tachibana, et al. FEBS Lett. 586: 1529-1532 (2012) KD value 0.54 nM 7.1 nM 1.0 µM 4.9 nM 35 nM 約2,000倍 LNAより高い親和性 Normalized DsRed2/GFP ratio 様々なmiRNAに対する LidNAを設計できる 1.2 25 nM 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 LidNA ＋－－＋－－＋－－＋－－＋－－＋－－ 15 nM let-7a 5 nM miR-21 15 nM miR-22 10 nM miR-34a 10 nM miR-34c 10 nM miR-122 Normalized DsRed2/GFP ratio 7 6 5 4 3 2 1 0 2 days 5 days 10 days MIAPaCa-2 miR-21 target 2 30 nM 1.8 MOCK Cell viability 1.6 1.4 control 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 Time after LidNAs transfection (d) miRNA阻害剤LidNA 用途核酸医薬再生医療のための細胞作製ヘテロLong siRNA キメラLong miRNA/siRNA 業界製薬関連企業バイオテクノロジー企業 [email protected] お問い合わせ先公立大学法人大阪市立大学産学連携コーディネーター渡邉敏郎ＴＥＬ 06－6605 － 3469 ＦＡＸ 06－6605 － 3552 e-mail [email protected] 24