学 位 論 文 要 旨 陸上植物におけるジテルペン環化酵素の分子進化に関する研究 Molecular evolution of diterpene cyclases in land plants 生物生産科学専攻 嶋根 生物制御科学大講座 真奈美 本 研 究 で は , シ ダ 植 物 イ ヌ カ タ ヒ バ (Selaginella moellendorffii) の ジ テ ル ペ ン 環 化 酵 素 の 機 能 解 析 を 端 緒 と し , ジ ベ レ リ ン (GA) の 生 合 成 に 関 与 す る ジ テ ル ペ ン 環 化 酵 素 , ent-kaurene 合 成 酵 素 (KS) の 基 質 認 識 に 関 す る 分 子 進 化 に つ い て 実 験 的 検 証 を 行 っ た 。G A は ジ テ ル ペ ン 型 の 植 物 ホ ル モ ン で あ り , 陸 上 植 物 の 成 長 調 節 に お い て 様 々 な 役 割 を 果 た す 。 植 物 に お け る GA 生 合 成 に 関 し て は 顕 花 植 物 を 中 心 に 研 究 が 進 ん で お り , ジ テ ル ペ ノ イ ド 共 通 前 駆 体 で あ る geranylgeranyl diphosphate (GGDP) か ら 2 段 階 の 環 化 反 応 を 経 て ent-kaurene が 合 成 さ れ , そ の 後 修 飾 反 応 を 経 て 主 要 な 活 性 型 GA で あ る GA1 や GA4 が 生 合 成 さ れ る 。 ent-Kaurene 生 合 成 に 関 与 す る 環 化 反 応 に お い て , 顕 花 植 物 で は ent-copalyl diphosphate ( ent-CDP) 合 成 酵 素 (ent-CPS) と ent-kaurene 合 成 酵 素 (KS) と い う 2 つ の 単 機 能 型 ジ テ ル ペ ン 環 化 酵 素 が 機 能 し , 各 々 GGDP か ら e n t - C D P, e n t - C D P か ら e n t - k a u r e n e へ の 変 換 を 触 媒 す る 。 一 方 , 維 管 束 を 持 た な い 陸 上 植 物 で あ る コ ケ 植 物 で は 1 酵 素 で ２ 反 応 を 触 媒 す る 多 機 能 型 ent-kaurene 合 成 酵 素 (ent-CPS/KS) に よ っ て ent-kaurene 生 合 成 が 行 わ れ る 。 系 統 樹 解 析 な どから, 陸上植物の進化の過程で ent-CPS/KS か ら 遺 伝 子 重 複 ・ 変 異 を 経 て e n t - C P S や K S の よ う な 単 機 能 型 酵 素 へ 分 化 し て き た こ と が 示 唆 さ れ て い る 。し か し , 進 化 的 に コ ケ 植 物 と 顕 花 植 物 の 間 に 位 置 す る シ ダ 植 物 に 関 し , ent-kaurene 生 合 成 を 行 う ジ テ ル ペ ン 環 化 酵 素 は 同 定 さ れ て い な か っ た 。 本 論 文 で は 大 き く 分 け て 2 つ の 実 験 を 行 っ た （ 第 1 章 , 第 2 章 ）。第 1 章 で は シ ダ 植 物 モ デ ル 生 物 で あ る イ ヌ カ タ ヒ バ を 材 料 と し , ent-kaurene 生 合 成 を 行 う ジテルペン環化酵素の同定を行った。既に公開されているイヌカタヒバのゲノ ム 情 報 を も と に , イ ヌ カ タ ヒ バ cDNA ラ イ ブ ラ リ ー か ら 機 能 未 同 定 の 3 遺 伝 子 (SmDTC7, SmDTC3, SmTPS9) を 見 出 し た 。予 想 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら , SmDTC7 は 単 機 能 型 の KS, SmDTC3 は 多 機 能 型 の ジ テ ル ペ ン 環 化 酵 素 と 予 想 さ れ た 。 ま た , SmTPS9 に 関 し て は 既 に 単 機 能 型 CPS 活 性 を 持 つ と い う 報 告 が あ っ た が , 生 成 物 の 立 体 構 造 が ent-CDP か , あ る い は そ の 鏡 像 体 の normal CDP か 決 定 さ れ て い なかったので, その機能を調べた。これら 3 遺伝子をクローニングし, 大腸菌 を宿主とした異種発現, あるいは昆虫無細胞発現系により組換え酵素を作製し た 。こ れ ら の 酵 素 の 基 質 と 生 成 物 を 調 べ た 結 果 , S m D T C 7 が 単 機 能 型 K S（ S m K S ） で あ る こ と , SmTPS9 は 単 機 能 型 ent-CPS で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 一 方 , SmDTC3 に つ い て は 予 想 に 反 し GGDP を 直 接 基 質 に す る CPS 活 性 は 持 た ず , 単 機 能 型 の KS 様 活 性 し か 示 さ な か っ た 。 SmDTC3 は 天 然 に 存 在 が 知 ら れ る CDP 立 体 異 性 体 , ent-CDP， normal CDP 及 び syn-CDP の 全 て を 環 化 反 応 基 質 と し た 。 す な わ ち , ent-CDP か ら は ent-16-hydroxykaurane が , normal CDP か ら は sandaracopimaradiene が , syn-CDP か ら は 構 造 未 同 定 の 複 数 の ジ テ ル ペ ン 類 が そ れぞれ検出された。以上のように, イヌカタヒバは顕花植物と同じく単機能型 の e n t-CP S と KS を 持 つ こ と , ま た 生 体 内 の 機 能 は 不 明 で あ る が , in vitro に お い て 基 質 –生 成 物 多 様 性 を 示 す ジ テ ル ペ ン 環 化 酵 素 SmDTC3 を 持 つ こ と が 示 さ れ た。 SmDTC3 が 持 つ 基 質 の 立 体 認 識 の 緩 さ が 確 認 で き た の で , KS も 同 様 の 基 質 特 異性を示すのかどうかに興味が持たれた。第 2 章では, 成長制御物質生合成に 関 与 す る KS の 基 質 認 識 に に つ い て 調 べ た 。 SmKS に 加 え , 顕 花 植 物 イ ネ の KS (OsKS1), レ タ ス の KS (LsKS), そ し て コ ケ 植 物 ヒ メ ツ リ ガ ネ ゴ ケ の ent-CPS/KS で は , 点 変 異 導 入 に よ り ent-CPS 活 性 を 失 わ せ た Ppcps/KS を 実 験 材 料 に 用 い た 。 こ れ ら の 組 換 え 酵 素 を 各 種 CDP と 反 応 さ せ 反 応 生 成 物 を GC-MS で 分 析 し た と こ ろ , OsKS1 は ent-CDP の み を 基 質 と し た の に 対 し , SmKS, LsKS 及 び Ppcps/KS は SmDTC3 と 同 じ よ う に 3 種 の CDP 立 体 異 性 体 す べ て を 基 質 と し て 認 識 し 変 換 生 成 物 を 与 え た 。 そ れ ぞ れ の CDP に 対 す る 反 応 性 を 比 較 す る た め , ent-CDP を 基 質 と し た 場 合 に お よ そ 50%の 基 質 が 消 費 さ れ る 条 件 を 用 い , normal C D P, s y n - C D P を 用 い た 場 合 と の 反 応 効 率 を 比 較 し た 。 S m K S 及 び P p c p s / K S は 効 率 よ く す べ て の CDP 立 体 異 性 体 を 変 換 し た が , LsKS は ent-CDP に 対 す る 選 択 性 が 非 常 に 高 く , normal CDP や syn-CDP を 基 質 と す る と 著 し く 反 応 効 率 が 低 下 することが明らかとなった。 以 上 に よ り , 原 始 的 な 陸 上 植 物 の ent-kaurene 合 成 酵 素 は 比 較 的 基 質 認 識 が 緩 い の に 対 し , 高 等 植 物 で は 厳 密 な 基 質 認 識 を 持 つ 傾 向 が 明 ら か と な っ た 。K S の 厳 密 な 基 質 認 識 は , GA 生 合 成 を 厳 密 に 維 持 ・ 制 御 す る の に 寄 与 し , 陸 上 植 物 の 進化とともに獲得されてきた性質であると示唆される。
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