（様式５） 指導教員 承認印 主 副 副 ㊞ ㊞ ㊞ 学 位 （ 博 士 ） 論 文 要 旨 生物システム応用科学府 生物システム応用科学専攻 博士後期課程 論文提出者 循環生産システム学専修 平成 ２５ 年度入学 氏名 河野辺 雅徳 主指導教員 氏 名 論文題目 豊田剛己 ㊞ 副指導教員 氏 名 橋本洋平 副指導教員 氏 名 沖縄県のサトウキビ圃場に生息する植物寄生性線虫の同定・定量技術の確立と評価、及び緑肥 を用いた対策に関する研究 論文要旨（2,000 字程度） 第 1 章 緒言 サトウキビは世界で最も産出量の多い熱帯・亜熱帯地域の重要な作物で、日本の最大産地である沖縄県では 産出額第一位の農作物となっている。中でも離島地域経済はサトウキビ生産依存度が高く、大東地域では全 世帯の約 3 割がサトウキビ生産を行っているが、単位面積当たり収量（単収）は世界および日本の平均のそ れぞれ 6 割および 7 割と低く、生産性の向上が急務となっている。単収低迷の要因の一つとして、先行研究 で 3 割程度の収量減が報告されている植物寄生性線虫（PPN）の影響が考えられる。PPN 研究では、主と して顕微鏡下で形態的特徴による種の分類および密度測定（計数）が行われてきたが、土壌毎の線虫抽出効 率の違いや形態観察の困難さなどにより、結果が大きく変動するなどの問題が指摘され、DNA 解析を用い たリアルタイム PCR 法などによる定量技術が開発されてきている。本研究では、北大東島のサトウキビ圃 場を主な調査地とし、生息する PPN 種の解明、PPN 密度とサトウキビ初期成長との関係性の解明、PPN 抑 止性をもつ緑肥の探索、土壌抽出 DNA を用いたリアルタイム PCR 法による PPN の定量技術の開発を行っ た。 第 2 章 北大東島サトウキビ圃場の PPN 種および密度 北大東島の 15 カ所のサトウキビ圃場より採取した土壌から、ベルマン法および二層遠心法を用いて線虫を 抽出し、ribosomal RNA (rRNA)の配列から種の特定を行った。また、島の全域から、全線虫数（20 g 土壌 あたり平均 167 頭）の半分近くを占める PPN が検出され、モロコシネグサレセンチュウ（同 48 頭） 、リュ ウキュウイシュクセンチュウ（同 22 頭） 、ナミラセンセンチュウ（同 6 頭）が主要な線虫種であった。また、 ヤリセンチュウの一種である Hoplolaimus columbus やワセンチュウ類も散発的に見られた。 第 3 章 北大東島の PPN のサトウキビ生育への影響 PPN のサトウキビ生育への影響を確認するために、殺線虫剤であるネマトリン（有効成分：フォスチアゼー ト）を用いて主要な PPN を殺処理した土壌と、無処理土壌を使ってサトウキビの生育調査を行った。試験 供試前の土壌（処理前）では PPN は 20 g 土壌あたり 136 頭（ベルマン法）であったが、サトウキビ一芽苗 （芽だし後）を植えて 10 週間のポット試験の結果、無処理区は PPN が同 317 頭となったのに対し、処理区 で同 135 頭（①フォスチアゼート 4.5 kg/ha 施用区）から同 45 頭（②同 22.5 kg/ha 施用区）まで抑制され た。また、処理区のサトウキビのバイオマス（乾物重）は 73 g（①区） 、88 g (②区)と無処理区と比べてそれ ぞれ 3 割超、6 割超上回った。ネマトリンを用いた圃場試験では、サトウキビ二節苗（芽出し前）の植え付 け後 5 ヶ月で、モロコシネグサレセンチュウは処理区（フォスチアゼート 7.5 g/ha）で 28 頭となり、無処理 区（77 頭）と比べて 64％減と有意に低位となり、サトウキビ生育調査時の主要指標である茎数、仮茎長が 有意に無処理区を上回った。 第 4 章 サトウキビ圃場の PPN 対抗植物としての緑肥の探索 マメ科緑肥である Crotalaria juncea（ネマコロリ） 、タデ科ソバ（さちいずみ） 、サトウキビ一節苗をそれぞ れ北大東島の PPN 汚染土壌を入れたポットで 8 週間生育し、 土壌中の PPN の比較を行った。 自活性線虫 （害 を及ぼさない）は、無処理区も含めてほぼ初期密度と同程度であったが、PPN はネマコロリ区でサトウキビ 区より有意に少なくなった。 第 5 章 リアルタイム PCR を用いた北大東島の PPN の定量技術の確立 北大東島のサトウキビ圃場に生息している主要な PPN４種（モロコシネグサレセンチュウ、リュウキュウイ シュクセンチュウ、ナミラセンセンチュウ、Hoplolaimus columbus）について、リアルタイム PCR 法で使 用するプライマーを、GenBank に収載されている rRNA の遺伝子配列情報と、北大東島の土壌から採取し た各線虫種のサンプルから得た配列情報を基に設計した。近縁種の同じ遺伝子配列領域を確認したところ、 これらのプライマーはリアルタイム PCR でターゲット遺伝子の増幅を行う際に重要とされる 3’末端から⒑ 塩基の中に 2 塩基以上のミスマッチがあり、他の線虫種の DNA 増幅の可能性は僅少であることを確認した。 さらに、対象土壌中に存在しない線虫を用いて、土壌検量線と一頭の線虫から抽出した希釈 DNA テンプレ ートを用いた検量線とが近似することを示した。 第 6 章 総合的考察 北大東島のサトウキビ圃場に PPN が広範かつ高密度に生息していた。これらの PPN はポット試験および圃 場試験からサトウキビ初期生育に極めて大きな影響を与えることが分かり、最終的にサトウキビ収量減に結 びつく可能性が示唆された。また、サトウキビに対する殺線虫剤は現時点で登録されていない中、限定的で はあるが効果の確認できたクロタラリアなどの緑肥による PPN 抑止の可能性が示唆された。さらに、これ まで形態的特徴によって同定、密度測定が行われてきた PPN の診断法として、より簡易に行える可能性が あるリアルタイム PCR 法を開発することができた。
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