No 14 0244-l 錦鯉特定疾病検査結果報告書 LABORATORY RESULTS REPORT 1 生産地 ■産者 2 : I PrOduce■ 養・.1芳名 Pll在 (Place of harvest) 地 (「 : 松田 ann namc,_:社〒 (MR MA rSし O MArSUDA) 松人田養鯉場 ,40- H17 ハウス (MATSUDA _横枕新潟県 KOI FARM,YC卜 IЭ MAKt∫ RA I10t∫ SE) 横枕町 2451 長岡市検体 (Sample) : =シ ● ヽヤl rt en,inol nmmc I Scに nine n■ n● キゴイ (KⅢ CaplC、り′ ″ ,■ 費 ′ ′ 0た υ ′ ′′ ) ( 8m● ■h■ P].!tE (.qrerage ol ti,rll l.rerhr l 10 5 cnl 平均体童 (Average or 60uγ 検査魚採取ヨ (Dac or san口 hR)1 204■ 12月 6日 (Dcc 6 2014) 検査魚 l■ 取叶の水温 (W“ cr tmpe lluだ誠 lmc or sann口 h■ ):18て ●す (A,c, : 181月 w■ ghl : 225 Ц 備考 {ヽ oo,:検 ■■ の上に ■ こイが行 ■■ ●長と体重は検査機関にて測定した .(S釧 ,Ⅲ Ⅲg wtt c証 led Out卜 p,odu● ● ,Tot,l en“ h and 「b。 ● W。 oた O in ll● labo巖 ■orv) Jl● =hi woc meaゞ 3 検査方法と結果 (Methods and rcsuLs of test) (1)コレ´ミスウイルス病 (Koi herpesvirus discasc,KHVD) イ ´ヽツヽヽデ /ユーDNA I'● 21い ==,イテ ,t. KHヽ 'ヽぃ1 Eま 5「 'ライマー =′ ￨■ ■ t PCRIユ lGrょ、P′ o72002 and Yuasa tr α′ 「 DelteJon● ra K{、 fenanic Dヽ Aヽヽ as,cnamtd卜、1'CR method、 usiЧ ヽ1lisa rF ●1 ■￨￨∫ 結果 (Resu Ls) : 陰 ,生 (2)コ「は試十ヽヽ hI-5p■ m er● 1(Gra、で,“ ′2012 and 「 (ヽ EC ATIVE) 試十1′ ￨■ ■ DIc ni、 ■■■ ■ =t,`,ヽ ●● 判定 ■ IDょき● u■ 。 ■: K : , 2011年ユ011■ 12月イ春ウイルス血症 (Sp面 ng OIE・ ManuJ or D● Tき 1、い !n゛ iさ 12月 24日 (Dec (Dee 25口 24 2014) 25 2014) vtemla orcarP,sVC) rmぼに Anim● s2014'の第 238■ 4条の記述に従つて t● ● した Chapttr 2 3 8 Anicle l) 結果 (Resu Ls): 陰性 (N EC ATIVE) ): 2014● : 12月 17日 (Dec 17 2014) (D■ ●0,Ⅲ dgen,e耐 ): 2014年 12■ 31口 l Dec 31 2014) raヽ・判定日 … 署名者名理学中士 ■ 凧 (Nallc ald T■ にo「 Ce■ い , 三木 IIF:検査員 (Dr Makoto M誦 :hlspector) 長部斎 :代表取締役ロイ寸 (Date) : 2015勺三 1月 tMI Hれ osh Osabe:DirectOn 6日 ( Jan 6 2015) 新潟県輸出錦鯉衛生証明書発行等取扱要領検査機関 (株 )県都食品環境分析センター〒 ,う 01022 ●潟県新鴻市東区キキ l丁目 72 Kento Food and Environment Analysis Center CO.Ltd l‐ 7 12 Kocl Hi3a、 11l ku,Nligata‐ stl. Ni gata,500022 ,apan Fn,ant kent088,0,■ 卜auone ntt,p l卜 [:+81252708890「 AX:+812,2708132 No 14 0244-2 結果証明書 CERTIFICAT10N RESULTS F■ ■ (Om nm“ 劇。rtcied iξ (101d nШ ‖卜0げヽ体共 (1)コ I KHヽ i、 1),31足 an口 es,:6● lt賛い01劇に、 , :5 Ftを体 =d、 Lach sampに conSs卜 ol■ 、o■ 、hcs' ￨￨ヽ体とした (6、山加口 tゝイヘルペスウイルス (K● HcrlDesvrus KHV) ェじilc ailll」 lJCil● n、、,、 no1 0ゞ icさ lCJ I｀ P(Rl● .l、、1len teno〔 llic I)Nへ￨● ,1111ぃ a2JJcs、 01C Jヽじd レーンサンブル (anc) (sampに A B C D E F G H l」 A B ― m ―動 bp , イ占果 (,c、 ut、 ) ) C 分子量マーカー陰性対照 san11,lo l D samp e 2 ( ￨￨lp Dヽ A laddcr) (ncta、 c conto) じ) 陰旺 (neg面、 l― E sanlple 3 F C sample 4 sample S H sample` 工」 aSl=2⊇ ■さ旺 (■ ● C) =.l、ヽじ) ￨=￨■ (ncg■ 陰性 (negarve) C' ￨`に tne=a● 、 1菖陽性対照分子量マーカー lt tnc8an、 c) (Positiヽ c contiol) (1111「 DNヽ adder' 電気泳動黎 (い de.l ophore■ 、o「 PcR Plodutl、 :PCR 備考 ' Ⅲ宣 l Gra、 ′ ′ 2は 2a,J Yuaゞル ′ゴ 21い ``′ :Thc PcRぉ sav(Gr"′ ′α′2002 md Yuasa`′ INol● ,1 =ノキゴイ ′,で 1■ 11出した DNAを苛型七 Lて行 1,,■ t DNA Ⅸ●.lled flomおi cap■ lsな α′2005)wぉ oartd o● l osい g“ 。ollににol口血 s' (2)コイ春ウイルス血症ウイルス (SpHng Viremia of Carp Virus,SVCV) ニシキゴイ組織磨砕液を接種した FPC細胞において、細胞変性効果 (CPE)は観察されなかった。 ( C,oohahc cilcct(CPD w6 nOtObsewed h EPC edヽ Sヽ Cヽ分離 (Isointi。 ■●fsヽ Cヽ in i Pc cei tunurt) Ptate numberi 14-0244 Sampre samp e Sample Sampr. 判定 1000 E:]′ ]Oo00 :RI PCR法は F:ω ￨。 1 2 B Sample Samp e s,mpe samp e 3 4 5 6 ①①①①①① E 判定 ① ①①①① ① =II L■ ■￨ ■L =■ ■L (Ne9at ve,(Negat ve,(Ne9ol ve,(No9at vO'(Negai ve,(Negat v■ ■ClLコヽ共分に 1る神 ]ユつ ■■ lt、ま九oヽ c efI.α ●0た ot dcvd。。。 d' tスけ口￨● 、ぃpJlo●“ (PE■ ウイツ IF.ct d。 ,doped, `由メ lス陰 L(■ 。。、Юp‖ OPI■ ウイ ntrol } ① ① O① ①① D mogenae s田口。S) 16suc、 (BIndぃ、、) Samp e Samp e samp e 蔭性陰性陰性磨性陰性陰性 (Ne9atve,(Negatve)(Negai.e,(No9aWe)(Ne,at.e)(N"a,ve) 技極サンブル濃度 ind ditltiOn of ul・ A: ]′ 100 B: 1′ 1000 c:。。ndol “ “ 備考 e ① ① O① ①① C Dl l′ Samp ⅢIⅢ ∋Ⅲ〕 ∈)(● (● B 盲継代 PIne numle: 14-0244‐ ① ① OO① ① A hocu“ ed wih homo,ende of k● c岬細胞培贅によるウイルス検査において陽性を示した検体についてのみ行われる. (Not t RT― PCR is」二柿 lmed onLon DoSit Ve sa2回 e Of Virus s。 1● lion test) 騰県都食品環境分析センター Kento Food and Environment Analysis Center Co,Ltd ) 平成 26年 10月検査法概要 (Materials and methods of koi carp test) (1)コ・イヘルペスライルス病 DNA抽出 PCR検 (Detecthn of KIIVけ PCR test) 査 (DNA extractiOn) イた用試栞 (Rcagen,い :PuRFGLNE Core Kit A , Plot‐ inasc Q]ACEN TAKハ Jい BIO K 使用機器 (Equipmo■ s):ブロックインキュベーター (b10ck incubator)cHT 102HI SCNICS ,チュープミキサー (■ he nlixell ￢И2000 LMS ・ PCR反応 (PCR reac● o■ ) 使用試業 (Rea3cno l Tよ am EX laq H。 1ゝ讀 1走 TAKARA B10 v。 1■ 。 n 用機器 (Equipment):Tよ ara PCR Themal Cyc er Dice TP600 プライマーセッ￨(Pimer sel):ヽ HV sph I-5F 5■ 1■ KARA BI() CAC ACC ACA TCl CcA ACC AC-3 :KliV Sph I-5R 5‐ CAC ACA TGT TAC AAI CGT CCC 3. 反 lL条件 194℃ 30秒 (,4t30秒 (Reac■ on cOndi10n:94で 30、 cc、 63℃ 30秒 72℃ 30秒 )メ 40,イ (94℃ 30 sec、 63で 30,ec、 72℃ クル 30 sec)× ,2℃ 7分 40りdes 72℃ 7mい Gtty 2002 [)● tectiOn ofヽ。 i herpesvirus DNA in tissues OFinftcted nsh J F みllな . 25. 171-178 Yusa a′ ´′ ,2005 ora PCR ncthod wilh mc Sph l-5 primei set fOr the detec● (2)コイ春ウイルス血症ウイルス検査 ]mprovemcnt on ol kOi he,csvirus(KIW),,々 Pl力 ο′.4037-391 (IsOb● On OF SVCV ln cen curulF) レス分離 (Virus isolatiOn) ウイァ使用縞砲 li(Cm lne)iコィ上皮恒 ■ 来和胞株 (EpithenOma pゅ ulosum"pHnt EPC) 使用培泄および添力lr・ (Mcuium mo suPPに ments) イー ′ル MEM培地 (EAGL「 S ME" NISSul ウン i台児血清 (Fctd Bo■ ne Se■ m) L(+)‐ グルタミン (L(+)_c ulantinc) ペニシリンストレフトマイシンアンホテリシン B(Penicinin strepimyoin AmphOtencin B) HEPES緩衝液 (HEPEs buffer) 炭酸水素ナトリウム (sOdiunl ЫeurbOnale) lnvitrogen hvirtten invitrogen DOJN Wよ o 分離条件 : 一次分離試験としてコィ組織抽出腋を終濃度が V100 rlooo希釈となるように EPC細ヽ接種し、 20℃ で ,日胞′ 間培養を行う。培養 ,￨にウイルスの存在を示す細胞変性効果が確認されなかった場合一次分離試験の細施培養液を ,4o希釈した t.養液を新しい EPC細胞に接種しさらに 20℃ で ,日間片養する .全培養期間を通じ細胞変性効果が・認されなかった場合ウイルス陰 Eと判定する. l・ On cOndiion,Sanp es wじに lested accodin8 1o methOdS“ scribed in oIE・ Manual of Di“ nosic icsts fOr AЧ uaie Aninals 20[1・ chTte,2 3 8,Article 4 RT‐ PCR is Pclf● imed On,on poshive sample of virus is。 1■ iOn test) (Isola■ 粽県都食品環境分析センター〒 950‐ 0022 新潟県新潟市東区幸栄 1丁目 712 Kento FoOd and En価 onment AnavsiS Center Co,Lta ■12,Koel.Higふ卜hム Nttala sllt Nttatヽ 950■ 022.Japa Ema":kellto8890ob al10ne netJp.TEL;+8125,703891,さ滋 ;+812527● 8132 l‐ α α7.