第67回分析化学討論会 67回分析化学討論会細胞内情報伝達の代表的なシグナルとしてプロテインキナーゼによるタンパク質リン酸化プロテアーゼによる限定分解に着目： Protein Kinase G protein-coupled receptor ： Protease ： Other Protein AC G G PLC 2+ Ca cAMP DAG Ras CaM PKA Sos P CaMK PKC P CREB P C-Myc MEK P P ERK P PKB P ELK Casp-3 Transcription Raf P Smad STAT P P PI3K P P Bcl-2 Casp-9 Tyrosine kinase receptor FAK Bad Apoptosis Grb2 Apaf-1 Cyt-c GSK3 Adhesion Extension JAK P Glycogen synthesis Ser/Thr kinase receptor Cytokine receptor Intracelular signal transduction system is a barometer to grasp cellular condition. 1 平行光（P 平行光（P偏光）をチップ全面に照射偏光）をチップ全面に照射反射光をCCD カメラでSPR SPR像として撮影像として撮影反射光をCCDカメラで Light Source Detector Polarized Light Prism Reflected Light Sensor Chip with gold film Analyte Flow Cell 相互作用が起こるとSPR 角度がシフトし反射光強度が変化相互作用が起こるとSPR角度がシフトし反射光強度が変化 SPR像の調べたい部分の反射光強度を解析することで SPR像の調べたい部分の反射光強度を解析することで複数の物質の相互作用解析が可能 2 HS NH2 S NH2 金蒸着ガラスプレート O O H H N H O O H2N HS O Cystein terminated peptide substrate N H N S BSAでブロッキングして固定化終了 BSAでブロッキングして固定化終了 3 洗浄 c-Src（ Src（精製酵素）によるリン酸化反応精製酵素）によるリン酸化反応,, ATP(+) ((-) SPR測定 SPR測定：抗リン酸化チロシン抗体 25min 送液 ATP (−） (−） 1 2 3 4 5 6 SPR signal 225 175 7 CGGEEIYGEFD 8 C (Lnk (Lnk)) (Lnk (Lnk)) EEIYGEFD 9 C (Lnk Lnk) ) (Lnk ( (Lnk)) IFGEFA 10 C (Lnk (Lnk)) (Lnk (Lnk)) IpYGEFA 11 PBS 12 back ground CGGIYGEFK CGGIYGEFKKA CGGIYGEFAAA CGGIYGEFAA CGGIYGEFA C(Lnk)(Lnk) C(Lnk)(Lnk) IYGEFA 125 0 500 1000 1500 O N H Lnk = Time / sec O O positive control EGリンカー導入 c-Src基質ペプチド EGリンカー導入c Src基質ペプチド ATP (＋） (＋） 100 ATPATP+ SPR signal SPR signal 225 175 50 125 0 500 1000 Time / sec 1500 0 1 2 3 4 5 6 7 probe 8 9 10 11 12 4 MCFMCF-7 lysateによるリン酸化反応 lysateによるリン酸化反応洗浄 SPR測定 SPR測定： 1ug/mL AntiAnti-phosphoTyr 15min 送液 2 3 185 SPR signal 1 1 C (Lnk) (Lnk) IFGEFA 2 C (Lnk) (Lnk) IpYGEFA 3 C (Lnk) (Lnk) IYGEFA 2 3 165 145 125 0 500 1000 1 Back ground Time / sec 基質ペプチドでのリン酸化が確認 SPR signal 50 25 0 1 2 3 probe back ground 5 リン酸化ペプチドの検出・・・一般的に抗リン酸化抗体を使用抗リン酸化抗体を使用した検出での問題点：リン酸化Ser を高感度に認識する抗体がないリン酸化Serを高感度に認識する抗体がないリン酸基を認識する新規機能性プローブであるPhos リン酸基を認識する新規機能性プローブであるPhos--tag（ビオチン標識亜鉛キレート化合物 tag（ビオチン標識亜鉛キレート化合物）を使用 Anal. Chem. 2005, 77,3979-3985 3種類のリン酸化アミノ酸を同時に認識 Phos-tag これまで困難だったリン酸化Ser の検出が可能！これまで困難だったリン酸化Serの検出が可能！ 6 OO P O- OH O S 細胞破砕液 H H O- O ペプチド固定化基板 P S H H NH HN O 2+ O- Zn O NH HN Zn2+ Zn2+ O Zn2+ 洗浄 SPR測定 SPR測定 PhosPhos-tag ストレプトアビジンを送液しリン酸化ペプチドを検出 7 代表的な Ser/Thr Ser/Thr kinase としてプロテインキナーゼA としてプロテインキナーゼA（PKA）をターゲットとして選択 PKA）をターゲットとして選択 ※ Forskolin （アデニル酸シクラーゼ活性化剤）→ 濃度が上昇（アデニル酸シクラーゼ活性化剤）→ 細胞内のcAMP 細胞内のcAMP濃度が上昇 Forskolin (-) lysate Forskolin (+) lysate 137 137 Anti-SA SA SPR signal SPR signal Anti-SA SA 127 PKA(pS) ( CGGLRRAS(PO3)LG ) PKA(S) ( CGGLRRASLG ) PKA(A) ( CGGLRRAALG ) 127 0 500 1000 0 Time [sec] 500 1000 Time [sec] Forskolin刺激することで PKA基質シグナル上昇基質シグナル上昇 Forskolin刺激することでPKA 9 Fsk(-) Fsk(+) SPR signal 2次元SPR により細胞内プロテイン次元SPRにより細胞内プロテインキナーゼ活性検出が可能であることを確認 0 PKA(Ser) PKA(Ala) probe PKA(pSer) 8 Streptavidin ビオチン標識プロテアーゼ基質ペプチド S H H NH HN 基質ペプチドではプロテアーゼによる切断が起こりビオチンが基板から離れる O Cell lysate 細胞破砕液を作用させプロテアーゼ反応を行う SAを送液した場合、コントロール配列と比較してSPRシグナルが減少 Streptavidin ビオチン標識ネガティブコントロールペプチド S S H H NH HN H H NH HN O O Cell lysate 9 モデルシステムとしてCaspase -3を標的プロテアーゼとして選択モデルシステムとしてCaspase- Caspase-3 substrate peptide C-Linker-DEVDGGSK(biotin) DEVD-biotin O N H O HN O 3 CaspaseCaspase-3基質配列 H N O O NH N H S O Lys Negative control sequence C-Linker-EVEEGGSK(biotin) EVEE-biotin 10 0∼10 units/100uL active caspase-3を基板上にアプライし反応後SPR測定 SPR測定条件： 1ug/ml SA 10min Active caspase unit / 100uL EVEE-biotin DEVD-biotin 0 5 7.5 Caspase-3 activity 2.5 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 10 2.5 5 7.5 10 10 + inhibitor Active caspase-3 (units / 100uL) CaspaseCaspase-3 activity = SPR signal (EVEE(EVEE-back) / (DEVD(DEVD-back) 10 + inhibitor (250uM) SPR difference image ・ Active caspase-3 の酵素量に依存してDEVD-biotinでのシグナルが減少 → 基板上でcaspase-3による切断反応が進行・阻害剤（Ac-DEVD-H）を添加することで反応の進行を抑制 11 Staurosporine で0h, 12h, 24h 刺激したCHO -3活性を検出刺激したCHO 細胞ライセートのCaspase 細胞ライセートのCaspaseSPR ： 1ug/mL SA 10min staurosporine 0h staurosporine 12h 147 0 100 200 300 400 500 EVEEEVEE-biotin DEVDDEVD-biotin SPR signal 125 125 staurosporine 24h 142 SPR signal SPR signal 142 600 Back ground 125 0 200 Time [sec] 400 600 Time [sec] 0 200 400 600 Time [sec] 刺激時間依存的にcaspase 活性が上昇刺激時間依存的にcaspase活性が上昇 Caspase activity 1.3 1.2 1.1 Caspase-3 activity = SPR signal (EVEE-back) / (DEVD-back) 1 0h 12h 24h staurosporine incubation time 13 2次元SPRにより細胞内Tyr kinase活性検出に成功リン酸基を認識する新規機能性プローブであるPhos-tagを利用することでこれまで困難であったリン酸化 Serの検出が可能となった 2次元SPRにより Forskolin に応答したMCF-7 ライセート中のPKA活性変化の検出に成功ビオチン標識 caspase基質ペプチドを使用することで2次元SPRにより Caspase活性を検出することが可能であることを確認した。また Staurosporine刺激に応答したcaspase-3活性を検出することに成功今後、未知遺伝子や薬物刺激に応答したシグナルを検出することが期待される 14