研究報告 microRNA と GFP の融合遺伝子による Microprocessor の機能解析 Functional analysis of Microprocessor through fusion genes of microRNA and GFP 岩本隆司 Takashi IWAMOTO 要 Microprocessor に よ る 旨 pri-microRNA (pri-miRNA) か ら pre-microRNA (pre-miRNA) への切り出しは microRNA (miRNA)の生成の過程の大切なステップ であり、最近この過程が色々な分子により制御されているらしいことがわかってきて いる。今回我々は miRNA と GFP との融合遺伝子を NIH3T3 細胞に導入することに より、Microprocessor の働きをリアルタイムに鋭敏にモニター出来る細胞系を樹立 することに成功した。この細胞系により pri-miRNA から pre-miRNA への切り出し を簡便に定量的に測定することが出来る。 キーワード：microRNA, siRNA, DGCR8, Drosha, Dicer, はじめに microRNA (miRNA)は２２塩基程度の 小さなＲＮＡで、最初線虫で発見された Microprocessor, GFP れ、そこで別の RNaseIII である Dicer の作用により２２塩基の成熟した miRNA になる 4-6)。 が、今世紀になり哺乳類でも１０００近 今までこれらのプロセシングの過程は い種類が存在して発生・分化のみならず 放射線同位元素を用いた in vitro のシス 癌や糖尿病・肥満などの疾患や病態に関 テムで解析されてきた。この解析系は感 与している事実が明らかになってきてい 度は良い一方、手間と時間を要するのが る 1- 4)。 大きな欠点である 5,6)。これらのプロセシ miRNA は細胞核において pri-miRNA と ングは miRNA 生成に必須のイベントで 呼ばれる長い転写産物として作られ、そ あるため、細胞レベルでこれらの過程を れが核内で Drosha と呼ばれる RNaseIII 観察出来る系が樹立できれば、これらの により 70 塩基程度の中間産物である 研究に与える恩恵は多大であると考えら pre-miRNA として切り出される。この反 れた。そこで我々は蛍光発光体分子であ 応には RNA 結合タンパクである DGCR8 る Green Fluorescent Protein (GFP)の遺 が必須であり、Drosha と DGCR8 は 伝子と pri-miRNA との融合遺伝子を作 Microprocessor（MP）と呼ばれる複合体 ることにより、MP の活性をリアルタイ を形成する。pre-miRNA は細胞質に運ば ムに可視化できる細胞株を樹立したので 報告する 7)。 中部大学生命健康科学部生命医科学科－Department of Biomedical Sciences, College of Life and Sciences, Chubu University 15 生命健康科学研究所紀要 第 5 号 2009 岩本隆司 研究方法と実験結果 ヒ ト の miRNA で あ る miR-143 と miR-145 は我々が調べた範囲では培養細 胞での発現が非常に低かったため、これ ら を プ ロ ー ブ に 選 ん だ 。 miR-143 と miR-145 と GFP 遺伝子の融合遺伝子を 複数作成してレトロウイルスベクターの pMXspuro8)に挿入した。一つ（143/IRES） は pri-miR-143 の下流に転写産物の途中 からでも翻訳を誘導できるインターナル リボゾーマルエントリーサイト（IRES） をつないでその下流に GFP 遺伝子を挿 入した。これにより pri-miR-143 と GFP 染させた。さらに２日後に抗生物質であ 遺伝子が一つの転写産物として転写され、 るピューロマイシンを添加して、遺伝子 GFP 遺伝子は IRES シグナルにより強力 16 が導入されたクローンを選択した。 に翻訳されることを期待した。もし、 もし、これらの細胞において MP 活性 pri-miR-143 が MP により充分にプロセ を 抑 え る こ と が 出 来 れ ば 、 シングされれば、GFP 転写産物は 5‘末 pri-miR-143/145 のプロセシングが減少 端の cap サイトを失うことになり安定性 することにより、それぞれの GFP 遺伝子 を失いタンパクへの翻訳は抑制されてい が安定するはずである。つまり MP 活性 るはずである（図１Ａ）。さらに我々は と GFP の発現が負に相関するはずであ GFP 遺伝子の下流に pri-miR-143 および ると考えた。 pri-miR-145 遺伝子を直列につないだベ そこで MP の活性を抑えるために、そ クターも構築した（145/143）。このベク の構成ユニットである DGCR84-6)に対す ターから転写される産物にも GFP と る siRNA（RNA 干渉により標的遺伝子の pri-miR-143 と pri-miR-145 が同時に乗 mRNA を破壊する２１塩基程度の短い っていることになる。この遺伝子の導入 RNA）を合成して（siDGCR8）、リポフ 細胞（トランスフェクタント）では MP ェクション法で得られたトランスフェク が効率よく機能すれば GFP 転写産物は タントに導入した。また、コントロール polyA を失い、その結果、この場合もタ と し て 標 的 配 列 を 持 た な い siRNA ンパクへの翻訳は阻害されることになる (siNeg)を導入して２日後にフローサイト （図１Ｂ） 。 メトリー（FACS）にて GFP の発現量を そこでこれらベクターをパッケージン 定量的に解析した。その結果、siDGCR8 グ細胞である Plate-E 細胞にリポフェク の導入により、GFP の発現が強く低下す ション法で導入して、２日後に上清を回 るものから、ほとんど低下しないものま 収して、マウス線維芽細胞 NIH3T3 に感 で、クローンによりその応答性はまちま microRNA と GFP の融合遺伝子による Microprocessor の機能解析 ちであった。 ようにデザインした（c143/GFP、図１Ｃ） 。 143/IRES で最も高率に反応するクロ この融合遺伝子も同様に、レトロウイル ーンの場合、siDGCR8 に対して１．８９ スベクターに挿入して、NIH3T3 細胞に 倍（図２Ａ） 、145/143 で２．２３倍であ 感染させ、ピューロマイシン耐性クロー っ た （ 図 ２ Ｂ ）。 こ れ ら の こ と よ り ンを選択した。 siDGCR8 による MP 活性の低下により共 得られたクローンに siDGCR8 を導入 に約２倍程度に GFP タンパクの発現が して、FACS で解析した結果、今までよ 増強したと考えられた。しかし、これは りも高率に反応するクローンを複数個得 予想していたよりも低い効率であった。 ることに成功し、最も高率のクローンで この低効率の原因の一つに cap サイトや は約４倍にＧＦＰ発現量が増強した（図 polyA のない不完全な転写産物が翻訳さ ２Ｃ）。このベクターの pre-miR-143 配列 れるバックグランドに拠っていることが 部に変異を入れて、MP によるプロセシ 考えられた。 ングが起こらない変異遺伝子をいれた細 我々は使用している約３００塩基の 胞では、予想通り siDGCR8 によるＧＦＰ pri-miR-143 の遺伝子配列は偶然にもあ の増強は起こらなかった（図２D）。これ る読み枠では、終止コドンがなく、一つ らの事実より、得られたクローンで観ら のオープンリーデイングフレームを作る れるＧＦＰシグナルの増強は、MP プロ ことに気がついた。そこでこの セシング抑制により特異的に起こってい pri-miR-143 配列をＧＦＰ遺伝子の開始 ると推測された。 コドンの下流にインフレーム（アミノ酸 さらに siDGCR8 による抑制が MP 活 コドンのフレームが合うように）に挿入 性抑制特異的な効果を観ていることを確 して、pri-miR-143 から作られるアミノ酸 かめるために、DGCR8 の別の配列に対す とＧＦＰタンパクの融合タンパクを作る る siRNA(siDGCR8*), MP のもう一つの 重 要 な 分 子 で あ る Drosha に 対 す る siRNA (siDrosha) を 作 成 し た 。 ま た 、 pre-miRNA の生成とは関係がなく、次の ステップである pre-miRNA から miRNA へのプロセシングに関与する Dicer に対 する siRNA (siDicerI, siDicerII)もネガテ イブコントロールとして合成した。 これらの siRNA を c143/GFP 高反応性細 胞に導入して、FACS で解析した結果、 siDGCR8*、siDrosha ともに siDGCR8 と同様にＧＦＰ発現量が増強した。一方、 MP 活性を押さえない siDicer では二つと もＧＦＰシグナルの増強は全く認められ 17 生命健康科学研究所紀要 第 5 号 2009 岩本隆司 なかった（data not shown）。これらの事 が認められるが、c143/GFP 高反応性クロ 実より、この系で観ているＧＦＰシグナ ーンでその増強は最も顕著であった。 ルの増強はＭＰ活性と特異的に関連して いると考えられた。 次にこれらの細胞で確かに導入 pre-miRNA のプロセシングが起こって いるかどうかをノザンブロット法により 確認した。図３は各クローンの miR-143 の発現量を表している。 結語 最近 miRNA のプロセシングが重要な分 これから解るように、siDGCR8 に高率 子により制御されている事実が報告され に反応するクローンは、miR-143 を強く た。癌をはじめ多くの生命現象に関わる 発現している（レーン２、４）。反対に低 増殖因子である TGFβのシグナル伝達分 反応性クローンでは miR-143 の発現は相 子 で あ る Smad が MP と 結 合 し て 対的に低くなっている（レーン１、３）。 pre-miR-21 のプロセシングを増強するこ これは低反応性の細胞ではもともとプロ とが示された 9)。また、Viswanathan らは セシングの効率が何らかの理由により低 ES 細胞の維持に重要な Lin-28 が pri-let7 くなっているので、siDGCR8 による MP と結合して、pre-miRNA へのプロセシン 活性抑制の効果が表れず、ＧＦＰシグナ グを抑制することを報告した ルの増強が見られないと考えられる。同 我々も今回樹立したベクターや細胞株を 様な現象は miR-145 の発現に関しても認 使って国内外の研究室との共同研究によ められた（data not shown）。 り miRNA プロセシングに関与する大変 最後にこれらの細胞を蛍光顕微鏡で観察 興味深い知見を得ている（論文作成中）。 した像を示す。それぞれの高反応性クロ 今後 miRNA のプロセシングの異常とヒ ー ン に siDGCR8 と コ ン ト ロ ー ル の トの疾患についての研究が世界中で活発 siRNA (siNeg)をそれぞれ導入した。図４ に行われると考える。 が示すように、すべてのクローンで siDGCR8 によりＧＦＰシグナルの増強 18 10) 。実際 microRNA と GFP の融合遺伝子による Microprocessor の機能解析 参考文献 1) 2) Oki, T., Nakajima, H., Nosaka, T. Chang, T.C. and Mendell, J.T. (2007) and Kumagai, H. (2003) Retrovirus- microRNAs in vertebrate physiology mediated and expression cloning: powerful tools in human disease. Annu Rev and functional genomics. Exp Hematol, Bushati, N. and Cohen, S.M. (2007) 31: 1007-1014. 9) Davis, B. N., Hilyard, A. C., Lagna, G. Dev Biol, 23: 175-205. and Hata, A. (200 8) SMAD proteins Zhang, W., Dahlberg, J.E. and Tam, control W. microRNA maturation. Nature, 454 : (2007) MicroRNAs in 10) 171: 728-738. DROSHA-mediated 56-61. tumorigenesis: a primer. Am J Pathol, 4) transfer Genomics Hum Genet, 8: 215-239. microRNA functions. Annu Rev Cell 3) gene Viswanathan, R., Daley, G..Q., and Iwamoto, T. (2008) microRNA and Gregory, R.I. (2008) Selective Cancer. Annual Report of Research blockade of microRNA processing by Institute of Life and Health Sciences, Lin28, Science, 320: 97–100. 4: 55-58. 5) 6) Denli A.M.i, Tops B.B., Plasterk R.H., Ketting R.F., and Hannon G.J., 岩本隆司 (2004) Processing ofprimary 中部大学生命健康科学部生命医科学科教 microRNAs by the Microprocessor 授。 complex. Nature, 432: 231-235. １９８４年名古屋大学医学部卒業。１９ Gregory R.I., Yan K.P., Amuthan G., Takashi IWAMOTO ９０年名古屋大学大学院医学研究科博士 Chendrimada T., Doratotaj B., Cooch 課程修了。名古屋大学医学部助手、米国 N., and Shiekhattar R., (2004) The ＤＮＡＸ分子細胞生物学研究所ポストド Microprocessor complex mediates the クトラルフェロー、名古屋大学医学部助 genesis of microRNAs. 教授を経て２００６年より現職。現在、 Nature, 実験動物教育研究センターにて miRNA 432: 235-240. 7) 著者 Tsutsui M, Hasegawa H, Adachi K, に関する遺伝子改変マウスを作成して解 Miyata M, Huang P, Ishiguro N, 析中である。専門：実験動物学、分子生 Hamaguchi M, 物学、眼科学。 and Iwamoto T. (2008) Establishment of cells to monitor Microprocessor through fusion genes of microRNA and GFP. Biochem Biophys Res Commun, 372: 856-861. 8) Kitamura, T., Koshino, Y., Shibata, F., 19
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