La coltivazione dei microrganismi 1 TERRENO DI COLTURA Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un ambiente adatto alla crescita di un particolare tipo di microrganismo A) In base allo stato fisico 1) TERRENI LIQUIDI 2) TERRENI SOLIDI B) In base alla composizione chimica Classificazione dei terreni di coltura 1) TERRENI MINIMI: contengono in composizione nota solo sali inorganici 2) TERRENI SINTETICI: contengono in composizione nota sia composti organici sia inorganici 3) TERRENI COMPLESSI (RICCHI): ricchi di substrati organici di cui non tutti I componenti sono noti (estratti di lievito o di organo). Sono usati per l’isolamento di microrganismi nutrizionalmente esigenti C) In base alla funzione 1) TERRENI SELETTIVI 2) TERRENI DISCRIMINATIVI 3) TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO 2 TERRENI DI COLTURA: classificazione in base allo stato fisico LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) SOLIDI: contengono AGAR L’AGAR è estratto dall’alga marina agar-agar ed è costituito dal polisaccaride AGAROSIO L’AGAROSIO è un polimero lineare con peso molecolare di 120 kDa, costituito da D-galattosio e 3,6-anidro-Lgalactopiranoside alternati e uniti da legami glicosidici α-(1→3) e β-(1→4) - Non è un nutriente, ma viene utilizzato come agente solidificante nei terreni di coltura - L’agar è ottimale per la preparazione dei terreni di coltura solidi perché ha una temperatura di liquefazione di 100°C e di solidificazione a 45°C 3 TERRENI DI COLTURA: classificazione in base alla funzione TERRENI SELETTIVI: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione di uno specifico microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita di altri microrganismi campione contenente il microrganismo da studiare (un alimento, del suolo, un tampone faringeo o cutaneo, un campione fecale, etc…) Il terreno selettivo sfavorisce (o impedisce) la crescita dei batteri che non voglio isolare Quali agenti selettivi sono solitamente sfruttate le esigenze nutrizionali (capacità di metabolizzare specifici substrati), la capacità di resistere alla presenza di antibiotici o altre molecole antimicrobiche, la capacità di sopravvivere a bassi pH o elevate concentrazioni di sali o zuccheri… Esempi Salmonella-Shigella Agar (SS-agar): utile all’isolamento dei batteri patogeni Gram negativi dei generi Salmonella e Shigella; questo terreno inibisce la crescita della maggior parte dei batteri a causa dell'elevata concentrazione di sali biliari e di citrato di sodio Bifidobacterial Selective Medium: utile all’isolamento dei bifidobatteri; contiene come agenti selettivi il sale litio cloruro, l’acido propionico e alcuni antibiotici a cui i bifidobatteri sono naturalmente resistenti 4 TERRENI DISCRIMINATIVI: rendono possibile alle colonie di un dato microrganismo di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciuto e distinto a prima vista dalle colonie degli altri microrganismi ESEMPIO Agar sale mannite: contiene lo zucchero MANNITOLO (come unica fonte di carbonio) e rosso fenolo (indicatore di pH); permette di discriminare gli stafilococchi patogeni (Staphylococcus aureus) dagli altri stafilococchi (per es. Staphylococcus epidermidis) LA CRESCITA DEL MICRORGANISMO DA UNA COLORAZIONE GIALLA poichè la fermentazione del mannitolo produce acidi che fanno virare il colore dell’indicatore di pH (rosso fenolo) al giallo; esempio: S. aureus LA CRESCITA DEL BATTERIO NON CAMBIA IL COLORE DEL TERRENO: il batterio non fermenta il mannitolo; le colonie batteriche rimangono del colore iniziale del terreno; esempio: S. epidermidis 5 TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni liquidi in cui la presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici ESEMPIO Terreno di coltura al selenio per l’isolamento delle salmonelle dalle feci Batterio che voglio isolare (per es. Salmonella typhi) Altri microrganismi presenti nel campione Dopo circa 6/8 ore il numero di cellule del batterio di interesse sarà di molto cresciuto rispetto al numero di cellule degli altri microrganismi (il batterio di interesse è stato arricchito!) 6 PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA - pesata dei vari costituenti Terreno di coltura NUTRIENT (terreno COMUNE) - dissoluzione in acqua - sterilizzazione in autoclave peptone Idrolizzato di proteine del latte, della carne o della soia con pepsina estratto di carne 1 g estratto di lievito 2 g X BATTERI nutrizionalmente poco esigenti sodio cloruro acqua dist. Terreno di coltura BRODO MALTO o AGAR MALTO estratto di malto 20 g saccarosio 40 g estratto di lievito acqua dist. 5g 5g 1000 ml 5g 1000 ml X LIEVITI E MUFFE TERRENO MRS (per lattobacilli) Sono microrganismi nutrizionalmente esigenti (detti per questo FASTIDIOSI); affinché possano essere coltivati, quindi, necessitano di un terreno colturale più ricco in nutrienti 7 de Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI Peptone from casein 10.0g; meat extract 8.0g; yeast extract 4.0g; D(+)-glucose 20.0g; dipotassium hydrogen phosphate 2.0g; ® Tween 80 1.0g; di-ammonium hydrogen citrate 2.0g; sodium acetate 5.0g; magnesium sulfate 0.2g; manganese sulfate 0.04g; agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g acqua dist. 1000 ml 8 CONCETTO DI STERILITÀ STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente, (comprese le endospore di Bacillus e Clostridium) In un laboratorio di microbiologia la sterilità DEVE essere assoluta. Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (si pensi alle leggi di BIGELOW, che rappresentano la cinetica della distruzione termica dei microrganismi) Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORE PERCHÉ? Principalmente perché le proteine (e quindi anche gli enzimi) denaturano Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è: L’AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione (assai più efficace del CALORE secco) 9 L’AUTOCLAVE - Il ciclo di sterilizzazione prevede una sovrapressione di 1 atm (≡ 121°C) per un tempo di15 min (oppure 20 min x ¾ atm ≡ 116°C; oppure 30 min x ½ atm ≡ 111°C) - P/T minori e tempi maggiori per limitare il danno ai composti organici (imbrunimento, caramellizzazione) - il vapore deve poter entrare in contatto con le soluzioni (tappi di cotone; bottiglie aperte) N.B.: Molti zuccheri e gli antibiotici devono essere sterilizzati per filtrazione (cut-off del filtro di 0,45 o 0,22 µm) perché altrimenti il 10 calore dell’autoclave distruggerebbe queste molecole 10 Lavorare in sterilità Ansa Pipetta Spatola Becco Bunsen Si lavora con fiamma ossidante (azzurra, più calda, più stabile), NON si lavora con la fiamma riducente (gialla, instabile) 11 riducente ossidante LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA Consiste nel trasferire sterilmente le cellule del microrganismo allo studio in un brodo colturale o in una piastra di terreno colturale agarizzato SEMINA DI TERRENO SOLIDO STRISCIO SPATOLAMENTO INOCULO IN BRODO Trasferimento in sterilità di cellule nel terreno liquido con ansa o pipetta INGLOBAMENTO O INCLUSIONE 12 INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con cui si sta lavorando Esempi: Geobacillus stearothermophilus G+, anaerobio facoltativo, termofilo Incubazione a 60°C per 8-12 h Bifidobacterium bifidum G+, anaerobio stretto, mesofilo Incubazione a 37°C per 36-48 h Giara di anaerobiosi Agitatore 13 Gas-pak per l'allevamento colturale di batteri anaerobi: si notino la giara a chiusura ermetica, la busta generatrice di anaerobiosi e la cartina indicatrice di anaerobiosi 14 14 Determinazione della carica microbica MISURAZIONE DIRETTA CONTA TOTALE AL MICROSCOPIO (con camere di conta) CONTA VITALE (piastramento di diluizioni seriali) MISURAZIONE INDIRETTA Misura della torbidità (spettrofotometro) Misura della conducibilità (conduttimetro) Misura della variazione di pH (per es. per un batterio lattico che cresce con metabolismo fermentativo producendo acido lattico) 15 DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA CARICA MICROBICA TOTALE Conta diretta con microscopio delle cellule contenute in un volume noto di campione, attraverso l’impiego di CAMERE DI CONTA (camera di Thoma o di Burker o Neubauer) In queste camere il vetrino portaoggetto è inciso in superficie con un reticolo quadrettato di cui è nota l’area di ogni riquadro Dato che lo spessore tra il reticolo ed il vetrino coprioggetto è noto, è possibile determinare il volume di sospensione batterica contenuta in ogni riquadro 16 La sospensione cellulare è aggiunta qui. Lo spazio tra il vetrino portaoggetto ed il coprioggetto è noto Osservazione microscopica e conta delle cellule Calcolo del nr di cellule per ml LIMITI: - impossibile distinguere le cellule morte dalle vive; - difficoltà di conta di cellule mobili o molto piccole, come molti batteri; - inadeguato per campioni a densità cellulare bassa (circa <106) (a meno di concentrare il campione ) 17 Determinazione della carica microbica VITALE DILUIZIONI SERIALI DECIMALI 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml soluzione fisiologica o una soluzione tampone adatta a preservare la sopravvivenza dei microrganismi Campione da analizzare 9 ml Diluizione 9 ml 9 ml 9 ml 1:10 1:100 1:1000 10-1 10-2 10-3 9 ml 9 ml 1:10000 1:100000 1:1000000 10-4 10-5 10-6 Semina per spatolamento (0,1 ml) * NON CONTABILI 159 159 x 103 = 1,59 Fattore di diluizione 2 0 colonie colonie *, le colonie sono visibili x 105 ufc / ml ESCLUSIVAMENTE DOPO INCUBAZIONE Unità Formanti Colonia delle piastre all’adeguata temperatura 18 colonie Semina per inglobamento o inclusione (1 ml) 17 colonie Determinazione della carica microbica VITALE attraverso il piastramento di diluizioni seriali Permette di ottenere i migliori risultati possibili circa il numero di cellule vitali in un campione ed è perciò ampiamente utilizzata Permette di contare solo le cellule vive, dove per viva si intende una cellula capace di dividersi e di dare origine a una progenie È adatta ad individuare anche un numero molto ridotto di cellule in un campione Con l’uso di opportune condizioni o opportuni terreni selettivi è possibile ottenere la conta vitale di specifici gruppi microbici Talvolta non è facile trovare condizioni di crescita (terreno, temperatura, tempo di incubazione) adatti a tutti i microrganismi di un campione microbiologicamente complesso. Inoltre, certi microrganismi crescono più rapidamente di altri Questa tecnica si basa sul PRESUPPOSTO che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale. Sorgono pertanto problemi per cellule legate fra loro, ad esempio in catenelle come gli streptococchi. Per questo, il risultato di questo analisi di conta microbica non è indicato come numero di cellule, ma come UNITÀ FORMANTI COLONIA (UFC) per unità di peso o di volume 19