Terreno di coltura “serum free” per cellule staminali mesenchimali In tempi recenti cellule staminali di varia natura hanno attratto l'interesse dei ricercatori per il loro potenziale terapeutico nell'ambito della medicina rigenerativa (Fig.1). Esse sono state ampiamente studiate e caratterizzate, ma la loro applicazione a livello clinico è ancora limitata sia da difficoltà legate alla loro amplificazione in vitro o alla loro crioconservazione, ma anche dalla necessità di rispettare i severi standard vigenti nell'ambito delle terapie su base cellulare. Le caratteristiche essenziali delle cellule staminali utilizzate nell'ambito clinico sono la capacità di espandersi e differenziarsi efficacemente in vitro, e di superare intatte le varie fasi di congelamento, crioconservazione e soprattutto la fase di scongelamento che riattiva i processi metabolici cellulari necessari all'espansione in vitro. Le cellule staminali mesenchimali sono cellule con caratteristiche fondamentali che permettono di rispondere a queste esigenze. Si tratta infatti di cellule immature e pluripotenti capaci di moltiplicarsi in vitro e di differenziarsi, in condizioni particolari, in una varietà di cellule specializzate tra le quali condrociti, osteociti, adipociti e cardiomiociti (Fig.1). Una popolazione di staminali mesenchimali inoltre può autorinnovarsi, mantenendo inalterato il proprio effettivo e il proprio potenziale staminale, grazie alla divisione asimmetrica, durante la quale la cellula si divide generando una cellula identica e un'altra maggiormente differenziata. Questo meccanismo permette di mantenere sul lungo termine una popolazione di cellule staminali che possono quindi essere trovate anche nell'organismo adulto. Le cellule staminali sono quindi una componente naturale del corpo umano e sono state identificate in varie nicchie come ad esempio nel midollo osseo, nel cordone ombelicale, nel fegato, pancreas e nel derma. Più recentemente si è scoperta la fonte forse più ricca, e cioè il tessuto adiposo, dove si situano abbondanti riserve di cellule staminali di tipo mesenchimale associate alla parete dei capillari sanguigni. Tali cellule possono essere facilmente isolate mediante trattamento enzimatico di tessuto adiposo prelevato attraverso liposuzione. Una volta ottenuta una frazione cruda (stromal vascular fraction, SVF), le cellule staminali mesenchimali possono essere ulteriormente purificate sfruttando le loro caratteristiche fenotipiche, morfologiche e la loro capacità di aderire alla plastica delle fiasche di coltura cellulare in laboratorio. Quest'ultima caratteristica è fondamentale poiché permette di espandere la popolazione isolata e ottenere le quantità necessarie alle applicazioni terapeutiche. Il tessuto adiposo infatti, pur essendo particolarmente ricco di cellule staminali, non permette di isolare quantità tali di cellule intatte da utilizzare direttamente a livello clinico. Le sfide principali nella produzione di sufficienti quantità di cellule per uso terapeutico risiedono nella necessità di sviluppare protocolli GMP (Good Manufacturing Practice) e di utilizzare reagenti "clinical grade" o "xeno-free", cioè reagenti liberi da componenti di origine animale. Lo sviluppo di terreni di coltura sintetici "xeno-free" comporta notevoli ostacoli soprattutto a causa dell'omissione di siero bovino, una componente tradizionale dei terreni di coltura che contribuisce in modo essenziale non solo alla crescita di cellule in vitro, ma anche alla protezione dell'integrità cellulare durante le varie fasi della crioconservazione. Pur essendo una componente fondamentale per la coltura cellulare di cellule mammifere, il siero bovino rappresenta contemporaneamente il problema maggiore per le terapie cellulari in quanto la sua effettiva composizione è generalmente sconosciuta, e viene considerato una delle maggiori fonti di potenziale contaminazione del paziente con microrganismi, virus, tossine o pirogeni. Scopo del progetto Sviluppare un protocollo d'isolamento, d'espansione in vitro e di crioconservazione compatibile con le procedure GMP, e svolto interamente in ambiente "xeno-serum-free". La composizione dei reagenti coinvolti dev'essere quindi interamente conosciuta e non comprendere alcun reagente di origine animale. Il medio inoltre deve essere completato da una serie di fattori di crescita accuratamente selezionati per permettere la crescita cellulare in ambiente limitante. Le cellule staminali devono essere vitali e poter crescere in quantità sufficienti da permetterne l'applicazione terapeutica. Attività svolta È stato formulato un terreno di coltura sintetico le cui componenti sono interamente conosciute e non includono costituenti di origine animale. Il terreno contiene nutrienti di base standard ed è completato da una serie di fattori di crescita specifici e ben definiti. A livello sperimentale abbiamo dimostrato che cellule staminali mesenchimali vitali possono essere isolate velocemente e con una buona resa dal tessuto adiposo (Fig. 2). In seguito le stesse cellule possono essere amplificate mediante il terreno di coltura sintetico oppure congelate per conservazione a lunga durata ed espanse in un secondo tempo, dopo il loro scongelamento. Dopo aver individuato e protetto la formula del medio di coltura serum free (patent pending) stiamo entrando nella fase successiva dove il medio sarà prodotto in quantità pilota di 50-100 L pronto per essere testato al di fuori dei laboratori di SSCF. Inoltre, la stabilità genomica (vedi progetto specifico) e le possibili alterazioni epigenetiche delle cellule staminali mesenchimali coltivate in vitro vengono studiate al fine di accertarne l’idoneità per l’applicazione terapeutica. Attualmente stiamo lavorando allo sviluppo e alla validazione tecniche analitiche da applicare alle linee cellulari mantenute in coltura per lunghi periodi. Fig. 1: Le cellule staminali mesenchimali vengono estratte dal tessuto adipose, coltivate in vitro, in condizioni particolari possono differenziarsi in cellule specializzate (adipociti, cardiomiociti, osteociti, condrociti e tenociti) ed essere quindi impiegate in vari ambiti della medicina rigenerativa. Fig. 2: cellule staminali mesenchimali coltivate in vitro.