7° Convegno Nazionale ARNA Cagliari 2-4 Ottobre 2014 QUALITA’ DEGLI ALIMENTI E SALUTE Il microbiota intestinale di orate: biomarcatore di origine ambientale e sorgente di composti bioattivi R. Floris1, G. Scanu1, S. Manca1, J. Kuegler2, R. Malavenda3, N. Fois1 1AGRIS-Sardegna, Dipartimento di Produzioni Animali, Bonassai, Olmedo, Italy. Proc. Engineering Life Science, Sect. Tech. Biol., Karlsruhe Inst. of Technol., Karlsruhe, Germany. 3Dip. Scienze Biologiche ed Ambientali, Università di Messina, Messina, Italy. 2Inst. email: [email protected] Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Introduzione Il microbiota intestinale dei pesci Si instaura nelle prime fasi di sviluppo larvale La composizione dipende: • caratteristiche chimico-fisiche dell’ambiente acquatico (temperatura, salinità, etc.), stagione • tipo di alimentazione • specie ittica, stadio di sviluppo, anatomia intestinale, pH, presenza di attività antibatteriche, enzimi digestivi, sali di bile etc. Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Introduzione Il microbiota intestinale dei pesci Nutrizione Apporto acidi grassi (SCFAs, EPA; 20:5 n-3 etc.), vit. B12, biotina, minerali, enzimi Salute Stimolazione del sistema immunitario, tolleranza a stress (probiotici) Qualità del prodotto Conservazione caratteristiche sensoriali Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Introduzione Composti bioattivi: biosurfattanti (BS) Varie specie batteriche producono oltre 10.000 sostanze organiche tipo BS (glicolipidi, lipopeptidi, lipoproteine, lipopolisaccaridi, fosfolipidi, acidi grassi, lipidi neutri), Biodegradabili “environmental friendly” Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Introduzione Composti bioattivi: biosurfattanti (BS) • Attività di superficie (tensioattivi), detergenti naturali • Attività biorimediatrici (legano i metalli pesanti, solubilizzano gli idrocarburi, inquinanti organici) • Attività antifungina, antifouling • Attività emolitica, antitumorale, antiaggregante, antiadesiva • Attività di stimolazione del sistema immunitario, antibatterica (probiotici), antivirale Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Scopo del lavoro • Caratterizzare il microbiota intestinale di orate selvatiche e di allevamento Biomarcatore di origine • Saggiare la capacità di produrre composti bioattivi Biosurfattanti Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Materiali e Metodi 3 Aziende Laguna T Laguna P Gabbie galleggianti off-shore M M T 25 Orate Taglia commerciale Stagione Invernale 2009-2011 P Siti di campionamento Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Sparus aurata Linnaeus, 1758 Materiali e Metodi Analisi microbiologiche Rimozione dell’intestino Intestino • Analisi quantitative convenzionali (conte su terreni di coltura) • Analisi qualitative (profili di restrizione ARDRA, sequenza 16S rDNA) Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Materiali e Metodi Produzione di composti bioattivi Biosurfattanti (BS) 114 isolati batterici intestinali E24 (in terreno Bushnell-Hass con 2% olio di girasole), saggi qualitativi: microplate e “drop collapse”, CTAB. TLC Thin-layer Chromatography Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Sparus aurata Linnaeus, 1758 Risultati Risultati Conte batteriche (medie ± es) 2600 2400 2200 a 2000 1800 1600 1400 Laguna T 1200 Gabbie a Laguna P 1000 800 600 a 400 a b 200 b a a b 0 Batteri eterotrofi Enterobatteriacee Coliformi P<0,05 Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Sparus aurata Linnaeus, 1758 Risultati Taxa batterici identificati (%) Laguna T 3% 3% 3% 3% Laguna P 8% 3% 2% 2% Gabbie off-shore 1% 16% 33% 1% 1% 29% 13% 5% 5% 1% 5% 9% 10% 90% Pseudomonas spp. Sphingomonas paucimobilis Pseudomonas spp. Proteus spp. Chriseobacterium spp. Janthinobacterium spp. Arctic soil bacterium A1T3 Sphingobacterium spp. Psychrobacter maritimus Psychrobacter spp. Psychrobacter maritimus Leucobacter spp. Yersinia bercovieri Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Aeromonas spp. Aeromonas molluscorum Erwinia persicina Agris 19% 19% Pseudomonas spp. Rainbow trout intestinal bacterium Myroides profundi Cryseobacterium spp. Brevundimonas diminuta Pseudochrobactrum saccharolyticum Psychrobacter spp. Acinetobacter spp. Risultati Produzione di BS 9 ceppi formavano emulsioni stabili e compatte del kerosene (E24 da 16% a 58%) 6 ceppi su 114 (5%), appartenenti a Pseudomonas spp. producevano metaboliti bioattivi tipo BS alla fine della fase logaritmica e durante la fase stazionaria - Crescita in terreno BH “Drop collapse” test Emulsione cherosene E24 % + - Microplate’s assay 60 50 40 30 20 10 0 55 54 50 41 45 45 35 26 16 + Risultati Caratterizzazione chimica dei BS Le prove di crescita su CTAB hanno permesso di stabilire la natura anionica dei prodotti batterici e le analisi cromatografiche TLC di identificare due spots caratteristici di composti glicolipidici e in particolare di ramnolipidi, descritti in letteratura come BS tipici del genere Pseudomonas. ST ST ST a Crescita su CTAB Colorazione con anisaldehyde (a) e ammonium molibdate (b)TLC a Agris Agris b Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Conclusioni La biodiversità microbica intestinale delle orate è influenzata dall’ ambiente di provenienza, dall’intensità di alimentazione e dalla composizione della dieta (de Paula Silva et al., 2011) Il microbiota intestinale rappresenta un ecosistema complesso e “peculiare”, un possibile biomarker di origine ambientale Identificazione batteri intestinali di origine ittica capaci di produrre molecole naturali bioattive Risorsa per applicazioni biotecnologiche in acquacoltura Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura Ringraziamenti Margherita Addis, Myriam Fiori, Riccardo Di Salvo Elisabetta Daga, Ilaria Dupre Mario Deroma Grazie per l’attenzione ! Agris Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura