（別添２） 平成 28 年度化学物質の内分泌かく乱作用に関する試験管内試験実施業務仕様書 １．業務の目的 環境省では、平成 28 年６月に「化学物質の内分泌かく乱作用に関する今後の対応― EXTEND2016 ―」を取りまとめ、化学物質の内分泌かく乱作用についての評価手法の確立と評価の実施を加速化 して進めており、化学物質の内分泌かく乱作用に関連する報告の信頼性評価を実施し、試験対象と なり得る物質の選定を行うとともに、試験及び評価の考え方や枠組みについて検討を行い、試験管 内試験及び生物試験を用いて、２段階で評価を行う枠組みを取りまとめたところである。 本業務は、環境省が別途実施した信頼性評価において試験対象物質となり得るとされた物質につ いて、内分泌かく乱作用に関する評価等に必要なデータを集積するため、第１段階試験管内試験で あるレポータージーン試験を実施するものである。 ２．業務内容 （１）試験対象物質のレポータージーン試験の実施 試験対象物質について、第１段階試験管内試験であるレポータージーン試験を実施し、内分泌 かく乱に関わる作用の有無及び EC50（最大転写活性の 50％の転写活性を示す濃度）又は IC50（最 大転写活性の 50％阻害を示す濃度）等のデータを取得する。なお、同試験に使用する消耗品等に ついては別表「消耗品等一覧」を参考にすること。 ア）試験対象物質 試験対象物質候補は、下記表１の 16 物質とする。 なお、試験対象物質（試薬）は、十分に純度の高いもの（おおむね 95％以上）を用いること とし、請負者が調達すること（契約締結後に試薬の入手が困難な特別な事情が生じた場合には、 その旨を速やかに環境省担当官に報告し、指示を受けること）。 イ）試験を実施する作用 各試験対象物質について、試験を実施する内分泌かく乱に係る作用については、下記の表１ のとおり。 表１ 試験を実施する内分泌かく乱に係る作用 作用 名称 エストロ 抗エスト アンドロ 抗アンド 甲状腺ホ 抗甲状腺 ゲン ロゲン ゲン ロゲン ルモン ホルモン １ ﾃﾌﾞｺﾅｿﾞｰﾙ ○ ○ ― ○ ○ ○ ２ ﾌﾞﾀｸﾛｰﾙ ○ ― ― ― ○ ○ ３ ﾌﾙｵﾗﾝﾃﾝ ○ ― ― ― ― ○ ４ ﾌﾟﾛｼﾐﾄﾞﾝ ○ ― ○ ○ ○ ○ ５ 2-ﾌﾞﾛﾓﾌﾟﾛﾊﾟﾝ ― ○ ― ○ ― ― -1- ６ 1-ﾌﾞﾛﾓﾌﾟﾛﾊﾟﾝ ― ― ― ― ○ ○ ７ ﾍﾟﾙﾌﾙｵﾛﾄﾞﾃﾞｶﾝ酸 ― ― ― ― ― ○ ８ ﾒﾁﾙ-t-ﾌﾞﾁﾙｴｰﾃﾙ ○ ○ ― ― ○ ○ ９ ﾒﾄﾗｸﾛｰﾙ ― ― ― ― ○ ○ 10 ｽﾁﾚﾝ ― ― ― ― ○ ○ 11 4-ﾋﾄﾞﾛｷｼ安息香酸ﾌﾟﾛ ○ ○ ― ― ― ― ― ― ― ― ○ ○ ﾋﾟﾙ(ﾌﾟﾛﾋﾟﾙﾊﾟﾗﾍﾞﾝ) 12 2-ﾒﾁﾙﾌﾟﾛﾊﾟﾝ-2-ｵｰﾙ (tert-ﾌﾞﾁﾙｱﾙｺｰﾙ) 13 ﾌﾟﾛﾋﾟｺﾅｿﾞｰﾙ ○ ○ ― ○ ○ ○ 14 酢酸ｸﾛﾙﾏｼﾞﾉﾝ ― ― ○ ○ ― ― 15 ﾁｵ尿素 ― ― ― ― ○ ○ 16 ｼﾞﾗﾑ ― ― ― ― ○ ○ 43 試験 ７ ５ ２ ５ 11 13 試験 試験 試験 試験 試験 試験 合計 ○：試験を実施する内分泌かく乱に係る作用 ウ）試験の方法及び条件等 (a) レポータージーン試験に用いるホルモン受容体の種類 各試験項目について実施するレポータージーン試験では、それぞれ表２に示すホルモン受 容体（生物種及びサブタイプ）を用いること。 表２ レポータージーン試験に用いるホルモン受容体の種類 試験項目 レポータージーン試験に用いる受容体 生物種 受容体の種類（サブタイプ） エストロゲン作用 メダカ エストロゲン受容体α 抗エストロゲン作用 メダカ エストロゲン受容体α アンドロゲン作用 メダカ アンドロゲン受容体β 抗アンドロゲン作用 メダカ アンドロゲン受容体β 甲状腺ホルモン作用 ニシツメガエル 甲状腺ホルモン受容体β 抗甲状腺ホルモン作用 ニシツメガエル 甲状腺ホルモン受容体β (ｂ)レポータージーン試験の方法 各ホルモン受容体を用いるレポータージーン試験は、以下の安定形質転換細胞系又は一過 性発現細胞系を用いる方法のいずれかの原理に基づく方法で実施すること。 ・安定形質転換細胞系を用いる方法 上記（a）の各ホルモン受容体の遺伝子及びレポーター遺伝子等を組み込んで安定的に 形質転換した動物細胞株（安定形質転換株）について CO2 インキュベーター内で適切に -2- 培養したものを用いて、化学物質へのばく露によりホルモン受容体に結合した化学物質 の転写活性能を測定（例えば、ルミノメーター等を用いて発光量を定量測定）する方法 ・一過性発現細胞系を用いる方法 上記（a）の各ホルモン受容体の遺伝子及びレポーター遺伝子等を動物細胞に一過的に CO2 インキュベーター内で適切に培養して導入し発現させ、化学物質へのばく露によりホ ルモン受容体に結合した化学物質の転写活性能を測定（例えば、ルミノメーター等を用 いて発光量を定量測定）する方法 なお、安定形質転換細胞系については、用いる動物細胞株の種類は特に問わない（酵母菌 は動物細胞に含まない） 。一過性発現細胞系については、用いる動物細胞株の種類は問わない が、ホルモン受容体遺伝子及びレポーター遺伝子等の細胞導入効率の変動を標準化できるデ ュアル・ルシフェラーゼ・レポーターアッセイ法等（ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ 等）を基本原理とする手法（別紙参照）を用いること。 (c) 試験濃度 各試験対象物質の試験濃度は、EC50（エストロゲン作用、アンドロゲン作用及び甲状腺ホ ルモン作用検出の各試験） 、又は IC50（抗エストロゲン作用、抗アンドロゲン作用及び抗甲状 腺ホルモン作用検出の各試験）を適切に算出できるように設定する（濃度設定において公比 は 10 以下とする） 。なお、転写活性能が小さく EC50 又は IC50 が適切に算出できない物質に ついては、可能な限り PC10（陽性対照物質の最大転写活性の 10％値相当の転写活性を示す濃 度）又は IC30（陽性対照物質の最大転写活性の 30％の転写阻害活性を示す濃度）を算出でき るように 10-4M を最高濃度として 5 濃度以上で試験を実施すること（ただし、最高濃度につい ては溶解度や細胞毒性等も考慮して設定すること）。また、試薬の調製に用いる溶媒（溶解 助剤）はジメチルスルホキシド（DMSO）とし、試験における使用濃度は 0.1％以下（エストロ ゲン作用、アンドロゲン作用及び甲状腺ホルモン作用検出の各試験）又は 0.2％以下（抗エス トロゲン作用、坑アンドロゲン作用及び抗甲状腺ホルモン作用検出の各試験）とする。 (d) 共添加物質及び添加濃度 抗エストロゲン作用、抗アンドロゲン作用又は抗甲状腺ホルモン作用検出の各試験において、 作用の確認及び IC50 の算出のために試験系にあらかじめ添加する陽性物質及び共添加濃度は 以下とする。 ・抗エストロゲン作用 ： （物質名）17βエストラジオール (CAS 50-28-2) （添加濃度）2×10-10M ・抗アンドロゲン作用 ： （物質名）11-ケトテストステロン (CAS 564-35-2) （添加濃度）1×10-8M ・抗甲状腺ホルモン作用： （物質名）3,3',5-トリヨード-L-チロニン (CAS 6893-02-3) （添加濃度）1×10-9M -3- (e) 試験結果の算出 各試験対象物質について、レポータージーン試験で得られた各試験濃度における転写活性 又は転写阻害活性の強さからエストロゲン作用、アンドロゲン作用及び甲状腺ホルモン作用 については EC50、抗エストロゲン作用、抗アンドロゲン作用及び抗甲状腺ホルモン作用につ いては IC50 を算出する。転写活性能が低く EC50 が算出できなかった物質については、参考 値として PC10 を算出し、転写阻害活性能が低く IC50 が算出できなかった物質については、 参考値として IC30（陽性対照物質の最大転写活性の 30％の転写阻害活性を示す濃度）を算出 する。なお、これらの試験結果の解析は専用の解析ソフトを用いて行うこと。 エ）陽性対照物質による妥当性の確認 各試験項目（抗甲状腺ホルモン作用は除く）について、試験対象物質とは別に陽性対照物質 （エストロゲン作用：17βエストラジオール、坑アンドロゲン作用：2-ヒドロキシフルタミド、 抗エストロゲン作用：4-ヒドロキシタモキシフェン、アンドロゲン作用：11-ケトテストステロ ン、甲状腺ホルモン作用：3,3',5-トリヨード-L-チロニン（トリヨードサイロニン））による試 験（試験の方法及び条件等は試験対象物質と同じとすること）を実施し、適切な EC50 又は IC50 が得られることを確認すること。なお、陽性対照物質による試験は試験対象物質での試験と並 行的に実施し、試験結果については試験対象物質の結果と合わせて報告書及び別途作成する会 議資料等に記載すること。 （２）化学物質の内分泌かく乱作用に関する検討会等への報告 本試験管内試験の実施及び結果については、環境省が別途開催する化学物質の内分泌かく乱作 用に関する検討会（平成 29 年３月頃、東京都 23 区内にて１回程度開催予定）に提出するための 資料を、環境省担当官の指示に従い作成の上（Ａ４、10 頁程度） 、同検討会に請負者が１名程度出 席し、必要に応じて資料に関する説明、質疑応答を行う。なお、同検討会への出席に係る旅費は 請負者が負担すること。 （３）報告書の作成 （１）～（２）の成果をまとめた報告書（A４版、50 頁程度、３部）を作成する。 ３．業務履行期限 平成 29 年３月 31 日 ４．成果物 報告書 ３部（Ａ４版 50 頁程度） 報告書の電子データを収納した電子媒体（DVD-R）９式 報告書及びその電子データの仕様及び記載事項は、別添によること。 提出場所 環境省総合環境政策局環境保健部環境安全課 -4- ５．著作権等の扱い （１）成果物に関する著作権、著作隣接権、商標権、商品化権、意匠権及び所有権（以下「著作権 等」という。）は、環境省が保有するものとする。 （２）請負者は、自ら制作・作成した著作物に対し、いかなる場合も著作者人格権を行使しないも のとする。 （３）成果物の中に請負者が権利を有する著作物等（以下「既存著作物」という。）が含まれてい る場合、その著作権は請負者に留保されるが、可能な限り、環境省が第三者に二次利用すること を許諾することを含めて、無償で既存著作物の利用を許諾する。 （４）成果物の中に第三者の著作物が含まれている場合、その著作権は第三者に留保されるが、請 負者は可能な限り、環境省が第三者に二次利用することを許諾することを含めて、第三者から利 用許諾を取得する。 （５）成果物納品の際には、第三者が二次利用できる箇所とできない箇所の区別がつくように留意 するものとする。 （６）納入される成果物に既存著作物等が含まれる場合には、請負者が当該既存著作物の使用に必 要な費用の負担及び使用許諾契約等に係る一切の手続を行うものとする。 ６．情報セキュリティの確保 請負者は、下記の点に留意して、情報セキュリティを確保するものとする。 （１）請負者は、請負業務の開始時に、請負業務に係る情報セキュリティ対策とその実施方法及び 管理体制について環境省担当官に書面で提出すること。 （２）請負者は、環境省担当官から要機密情報を提供された場合には、当該情報の機密性の格付け に応じて適切に取り扱うための措置を講ずること。 また、請負業務において請負者が作成する情報については、環境省担当官からの指示に応じて 適切に取り扱うこと。 （３）請負者は、環境省情報セキュリティポリシーに準拠した情報セキュリティ対策の履行が不十 分と見なされるとき又は請負者において請負業務に係る情報セキュリティ事故が発生したとき は、必要に応じて環境省担当官の行う情報セキュリティ対策に関する監査を受け入れること。 （４）請負者は、環境省担当官から提供された要機密情報が業務終了等により不要になった場合に は、確実に返却し又は廃棄すること。 また、請負業務において請負者が作成した情報についても、環境省担当官からの指示に応じて 適切に廃棄すること。 （５）請負者は、請負業務の終了時に、本業務で実施した情報セキュリティ対策を報告すること。 （参考）環境省情報セキュリティポリシー http://www.env.go.jp/other/gyosei-johoka/sec-policy/full.pdf ７．その他 （１）請負者は、本仕様書に疑義が生じたとき、本仕様書により難い事由が生じたとき、あるいは 本仕様書に記載のない細部については、環境省担当官と速やかに協議しその指示に従うこと。 -5- （２）「平成 28 年度化学物質の内分泌かく乱作用に関する試験管内試験実施業務」を行うに当たっ て、入札参加希望者は、必要に応じて「平成 27 年度化学物質の内分泌かく乱作用に関する試験管 内試験実施業務」に係る資料を、所定の手続きを経て環境省内で閲覧することを可能とする。 資料閲覧を希望する者は、以下の連絡先に予め連絡の上、訪問日時及び閲覧希望資料を調整す ること。 ただし、コピーや写真撮影等の行為は禁止する。また、閲覧を希望する資料であっても、各業 務における情報セキュリティ保護等の観点から、提示できない場合がある。 連絡先：環境省総合環境政策局環境保健部環境安全課 立石、大木 03-3581-3351（代） 内線 6352 -6- （別添） １．報告書等の仕様及び記載事項 報告書等の仕様は、「環境物品等の調達の推進に関する基本方針」（平成 28 年２月２日閣議決 定。以下「基本方針」という。）の「印刷」の判断の基準を満たすこと。 なお、「資材確認票」（基本方針 204 頁、表３参照）及び「オフセット印刷又はデジタル印刷の 工程における環境配慮チェックリスト」（基本方針 205 頁、表４参照）を提出するとともに、印刷 物にリサイクル適性を表示する必要がある場合は、以下の表示例を参考に、裏表紙等に表示するこ と。 リサイクル適性の表示：印刷用の紙にリサイクルできます この印刷物は、グリーン購入法に基づく基本方針における「印刷」に係る判断の基準にしたが い、印刷用の紙へのリサイクルに適した材料［Ａランク］のみを用いて作製しています。 なお、リサイクル適性が上記と異なる場合は環境省担当官と協議の上、基本方針 （http://www.env.go.jp/policy/hozen/green/g-law/kihonhoushin.html）を参考に適切な表示を行 うこと。 英語サマリーについては、以下により作成すること。 （１） 以下の対訳集等を参考に、ネイティブチェックを経ること。 ① 環境用語和英対訳集(EIC ネット http://www.eic.or.jp/library/dic/) ② 法令用語については、日本法令外国語訳データベースシステムの標準対訳辞書 （http://www.japaneselawtranslation.go.jp/） （２）海外で参照されることを念頭に入力は半角で行い、全角文字や全角スペースは使用しないこ と。特に以下に注意すること。 ・丸数字は使用不可。「℃」→「degrees C」又は「degrees centigrade」 ・記号はすべて半角。例：「“ ”」→「" "」、「`」「’」→「'」、「－」→「-」 ・化学物質は英文名＋化学記号（半角の英数字）。1/4 文字にしない。二度目以降は化学記号の みでも可。例：carbon dioxide (CO2) ・環境省の略称は「MOE」（大文字） ２．電子データの仕様 （１）Microsoft 社 Windows7 SP1 上で表示可能なものとする。 （２）使用するアプリケーションソフトについては、以下のとおりとする。 ・文章；Microsoft 社 Word（ファイル形式は Word2010 以下） ・計算表；表計算ソフト Microsoft 社 Excel（ファイル形式は Excel2010 以下） ・画像；BMP 形式又は JPEG 形式 （ ３ ） （ ２ ） に よ る 成 果 物 に 加 え 、 「 PDF ファイル形式」による成果物を作成すること。 （４）以上の成果物の格納媒体は DVD-R とする。事業年度及び事業名称等を収納ケース及び DVD-R -7- に必ずラベルにより付記すること。 （５）文字ポイント等、統一的な事項に関しては環境省担当官の指示に従うこと。 ３．成果物の二次利用 （１）納品する成果物（研究・調査等の報告書）は、オープンデータ（二次利用可能な状態）とし て公開されることを前提とし、環境省以外の第三者の知的財産権が関与する内容を成果物に盛 り込む場合は、①事前に当該権利保有者の了承を得、②報告書内に出典を明記し、③当該権利 保有者に二次利用の了承を得ること。 第三者の知的財産権が関与する内容の一部または全部について、二次利用の了承を得ること が困難な場合等は、当該箇所や当該権利保有者等の情報を、以下の URL からダウンロード出来 る様式に必要事項を記入し提出すること。 （２）環境省が保有するオープンデータの情報を政府が運用するオープンデータのポータルサイト 「データカタログサイト DATA.GO.JP（http://www.data.go.jp/）」に掲載及び更新情報を反映 させるためのデータに関する説明（メタデータ）について、成果物と併せて以下の URL からダ ウンロード出来る様式に必要事項を記入し提出すること。 http://www.env.go.jp/kanbo/koho/opendata.html ４．その他 成果物納入後に請負者側の責めによる不備が発見された場合には、請負者は無償で速やかに必要な 措置を講ずること。 -8- 別紙「デュアル・ルシフェラーゼ・レポーターアッセイ法の原理」 -9- 別表 消耗品等一覧 品 名 テブコナゾール標準品 ブタクロール標準品 フルオランテン標準品 プロシミドン標準物質 2-ブロモプロパン 1-ブロモプロパン ペルフルオロドデカン酸 メチル-t-ブチルエーテル メトラクロール標準品 スチレン 4-ヒドロキシ安息香酸プロピル 2-メチルプロパン-2-オール プロピコナゾール標準品 酢酸クロルマジノン チオ尿素 ジラム標準品 17βエストラジオール 11-ケトテストステロン 4-ヒドロキシタモキシフェン 2-ヒドロキシフルタミド 3,3',5-トリヨード-L-チロニン 培養細胞 HEK293 培養細胞 HepG2 トリプシン EDTA溶液 Dulbecco's Modified Eagle Medium チャコールデキストラン処理FBS ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 L-グルタミン-200 mM セルカルチャーディッシュ pGL4 Luciferase Reporter Vector pGL4 Luciferase Reporter Vector FuGENE 6 Transfection Reagent FuGEN HD Transfection Reagent Passive Lysis Buffer Dual-Luc Reporter Assay System セルカルチャープレート 96wellマイクロプレート ディスポーザブルピペット コニカルチューブ マイクロピペットチップ マイクロピペットチップ マイクロピペットチップ マイクロピペットチップ クライオチューブ クライオボックス 規 格 残留農薬試験用, 200mg 残留農薬試験用, 200mg 環境分析用, 100mg TraceSure®, 100mg 特級, 25g 特級, 25g 1g 特級, 25g 残留農薬試験用, 100mg 特級, 25mL 特殊用, 5g 99%, 250mL 残留農薬試験用, 200mg 生化学用，1g 特級, 25g 残留農薬試験用, 200mg 生化学用、250mg 5mg 10mg 10mg 500mg 1×106cells/vial T-25フラスコ 100mL 500mL 500mL 100mL 100mL 100mm（200枚） [luc2/minP] Vector 20μg [hRluc/TK] Vector 20μg 1mL 1mL 30mL 100回 24well（50枚） ホワイト（100枚） 5mL（200本） 5mL（200本） 0.1-10μL、滅菌済（1000本） 2-200μL、滅菌済（960本） 200-1000μL（960本） 10mL（200本） 1.8mL、丸底（500本） 1-2mLバイアル用 - 10 -
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