LC Technical Note 161 MonoSpin PBAを用いた血清中リバビリンの精製 GL Sciences Inc. 抗ウイルス薬であるリバビリン(Ribavirin)は、 インターフェロンと併用することでC型肝炎治 療薬として用いられています。体内に蓄積す る性質があり、体内動態を解析することで治 療効果の予測や副作用との関連をみることが 可能です。 リバビリンは親水性の薬物であり、C18など の疎水性相互作用による前処理を適用するこ とが困難です。そこで精製にはリバビリンの持 つシス型ジオールを選択的に吸着することの できるMonoSpin PBAを用いました。 ヒト血清に0.25～25μg/mLの範囲でリバビリ ンを添加し、MonoSpin PBAで精製後、HPLCに よる評価を行いました。分析カラムは水を多く 含む移動相条件でも安定して分析を行うこと が可能なInertSustain AQ‐C18を用いました。 その結果、ヒト血清中のリバビリンを簡便か つ、選択的に測定することができました。 本報では、精製における注意点についても 記載しておりますので、メソッド構築時にご参 考ください。 ( Y.Yui, N. Iwanami ) ◆MonoSpin とは？ MonoSpin MonoSpin シリーズは、均一な連続孔を持つシリカ モノリスを用いたスピンカラムです。空隙率の高いシ リカモノリスを担体として用いているので、遠心操作 だけで通液させることができます。そのため、短時間 の簡便な操作で試料の精製・濃縮を行うことができ ます。また、ベッドボリュームが小さく液切れも良い ので、試料量が少ない場合にも適しています。 操作は遠心法で す。 使用方法の動画はこちら： http://www.gls.co.jp/flv/monospin/monospin.html シリカモノリスの 拡大図 シリカモノリス ディスク ◆MonoSpin PBAを用いた精製方法について 構造式 MonoSpin PBA L型 Ribavirin MW：244 pKa：12.25 シリカモノリスの表面にフェニルホウ酸を結 合させたカラムです。シス型ジオールを有す る化合物に高い親和性を示します。 MonoSpin PBAが 選択性を示す部位 精製手順 遠心: 2,300×g, 2min 遠心 1.Conditioning 0.6%アンモニア水溶液 400μL 遠心 2.Absorption サンプル溶液 400μL 遠心 3.Rinsing 0.6%アンモニア水溶液 400μL 遠心 4.Elution 1%ギ酸水溶液 200μL Purified sample サンプル溶液 0.6%アンモニア水溶液：ヒト血清：リバビリン（各濃度に水で希釈したもの）＝50：49：1で混合し、5,000×g、3min遠 心した上清をサンプル溶液としました。※予め遠心して微粉を除くことでスピンカラムの液通りが良くなります。 バックナンバーやアプリケーション検索はこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html GL Sciences LC Technical Note ◆標準溶液の測定例 1.Ribavirin 1 μg/mL 900000 R² = 0.999952 800000 700000 600000 mVolts 2 Area 1 500000 400000 300000 200000 0 100000 0 0 2 HPLC条件 カラム: 溶離液: 4 Time (min) 6 0 8 10 20 30 40 50 60 Concentration(μg/mL) InertSustain AQ‐C18 HP (3 μm, 150 × 2.1 mm I.D.) A) Solution* Time A(%) B(%) B) Solution */CH3CN=19/1, (v/v) 0 100 0 gradient (v/v) 6 100 0 0.3 mL/min 6.1 0 100 25 ℃ 11 0 100 UV 220 nm 11.1 100 0 5 μL 20 100 0 流量: カラム温度: 検出: 注入量: *Solutionの調製方法 無水硫酸ナトリウム 2 gを水300 mLに溶解し、リン酸8 mLを加えて2 Lに秤量したもの ◆添加回収試験結果①（日内再現性） 回収液クロマトグラム（1 μg/mL） 900000 R² = 0.999957 800000 1.Ribavirin 1 μg/mL 700000 600000 mVolts 2 Area 1 500000 400000 300000 200000 0 100000 0 0 0 2 4 Time (min) 6 8 各濃度における回収率および日内再現性（n=6） Spiked concentration,μg/mL Recovery,% 0.25 100.7 0.5 102 2.5 97.5 5 97.7 12.5 100.7 25 98.9 10 20 30 40 Concentration(μg/mL) RSD,% 2.4 3.5 1.7 2.5 0.9 1.2 各濃度n=6で分析した際の回収率および日内変動係数は、 回収率：97.5～100.7%、RSD：0.9～3.5%であり、良好な結果を得ることができました。 50 60 GL Sciences LC Technical Note ◆添加回収試験結果②（日間再現性‐連続3日間） 検量線1日目 検量線2日目 900000 900000 700000 600000 600000 500000 500000 Area Area 700000 400000 400000 300000 300000 200000 200000 100000 100000 0 0 10 20 30 R² = 0.999957 800000 R² = 0.999957 800000 40 50 0 60 0 Concentration(μg/mL) 10 20 30 40 50 Concentration(μg/mL) 検量線3日目 900000 R² = 0.998690 800000 700000 Area 600000 各濃度n=6で3日間分析した際の回収量お よび寄与率を示します。 寄与率0.998690～0.999957であり、良好な 結果を得ることができました。 500000 400000 300000 200000 100000 0 0 10 20 30 40 50 60 Concentration(μg/mL) 各濃度における連続3日間の回収率および日間再現性 Spiked concentration, μg/mL 0.25 0.5 2.5 5 12.5 25 1st day 2nd day 3rd day RSD(%) 100.7 102 97.5 97.7 100.7 98.9 99.4 99.3 98.5 101.9 101.4 99.5 95.7 98.9 98.9 99.3 94.7 100.8 3.1 3.0 1.6 2.5 3.4 1.9 各濃度n=6で分析した際の回収率および日間変動係数は、 回収率：94.7～101.9%、RSD：1.6～3.4%であり、良好な結果を得ることができました。 60 GL Sciences LC Technical Note MonoSpin PBAの物性と仕様 S型 品名 官能基 MonoSpin PBA スルーポア メソポア (µm) (nm) フェニルホウ酸基 5 10 表面積 (m2/g) 350 使用製品 MonoSpin S型 MonoSpin® 回収用チューブ （1.7 mL） 廃液用チューブ （2 mL） MonoSpin S型と、回収用チューブ（1.7 mL）、廃液用チューブ（1.7 mL）がセットになっています。 品名 MonoSpin PBA 入数 Cat.No. 50本 5010-21715 100本 5010-21716 MonoSpin® （S型）トライアルキット、カスタムキット 初期メソッド調整用に、各種パッケージ化したトライアルキットとカスタムキットです。 品名 構成内容 Cat.No. MonoSpin トライアルキット 1 C18,TiO,SCX,SAX 各10本 5010-21740 MonoSpin トライアルキット 2 C18,Amide,CBA,NH2 各10本 5010-21741 MonoSpin トライアルキット 3 SCX,SAX,CBA,NH2 各10本 5010-21742 MonoSpin カスタムキット 20 ＊ ＊ お好みの2種 組み合わせ 各10本 5010-01001 MonoSpin Trypsin, MonoSpin ProA, MonoSpin ProG は対象外です。 ジーエルサイエンスでは、分析ノウハウときめこまやかなフォローもお付けしたシステム提案を行っております。 お近くの営業所や カスタマーサポートセンター までお気軽にお問い合わせください。 データに起因し、直接的または間接的に生じたいかなる損害に対しましても、当社が責任を負うものではありません。 また、記載事項につきましては、予告無しに改訂する場合がありますので、あらかじめご了承ください。 ホームページはこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html 〒163-1130 東京都新宿区西新宿6丁目22番1号 新宿スクエアタワー30F TEL.03(5323)6611 FAX.03(5323)6622 TEL.03(5323)6611 TEL.06(6357)5060 TEL.045(985)7900 TEL.024(534)2191 TEL.029(858)3700 TEL.043(248)2441 TEL.048(667)1611 TEL.052(931)1761 TEL.082(233)1101 TEL.092(738)6633 FAX.03(5323)6622 FAX.06(6357)4580 FAX.045(985)7901 FAX.024(536)1518 FAX.029(858)3780 FAX.043(248)2485 FAX.048(667)1656 FAX.052(931)1814 FAX.082(233)1110 FAX.092(738)6636 ｶｽﾀﾏｰｻﾎﾟｰﾄｾﾝﾀｰ T E L . 0 4 ( 2 9 3 4 ) 1 1 0 0 FAX.04(2934)3361 東 大 東 筑 千 北 横 名 広 九 京 営 業 阪 支 北 営 業 波 営 業 葉 営 業 関 東 営 業 浜 営 業 古 屋 営 業 島 営 業 州 営 業 部 店 所 所 所 所 所 所 所 所 ジーエルサイエンス LC テクニカルノート
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