発表資料

金属錯体を発光プローブとする生体内酸素
イメージング技術の開発
群馬大学大学院理工学府分子科学部門
教授飛田成史
1
生体内に適用可能な酸素測定法（従来技術）
1) 電気化学的方法
酸素電極を挿入（侵襲的）
測定中に酸素を消費
2) EPR オキシメトリー
プローブ（常磁性試薬）を投与
EPR 信号の線幅から算出
3) 細胞内還元反応を利用する方法
Nitroimidazole系薬剤、他
4) BOLD MRI
Blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI
電気化学的方法は、侵襲性が高いという欠点があり、その他の方法も
細胞レベルの酸素化状態を画像化することは難しい。
2
新たな酸素測定法
5) 光学的方法（酸素によるりん光消光を利用）
プローブ（りん光性試薬）
利点：低侵襲的
空間分解能が高く、リアルタイム計測が可能
細胞レベル、in vivoレベルでの酸素イメージングに適用可能
欠点：組織深部の測定は限定される
腫瘍
HeLa細胞内の発光
腫瘍組織内の発光
3
これまでに報告されている代表的な発光性酸素プローブ
R
R
ルテニウム錯体
O
O
HN
O
O
O
NH
O
R
R
HN
NH
2H2O
O
N
2Cl-
O
N
Pd
N
N
O
O
HN
N
H
R
R
O
HN
O
O
O
NH
O
O
R
R
ポルフィリン金属錯体
O
R1
R1
HN
O
NH
R=
O
O
H
N
HN
O
NH
R1 = HN
O
O
O
HN
O
n
Me
n = 21-22
R1
O
R1
これまでのプローブは細胞内に入りずらい
4
イリジウム錯体の特徴
１．配位子の構造を変えることで、細胞親和性や細胞内局在を制御できる
→ 細胞内で働く酸素プローブ
２．配位子の構造を変えることで、吸収・発光波長を制御できる
→ 発光波長を近赤外化し、組織への透過性を高めることが可能
３．Ru錯体に比べてりん光量子収率が大きく、りん光寿命が長い
→ 適度な酸素感受性
lmax = 615 nm
tp = 6.3 ms
Fp = 0.31
BTP
5
光学的酸素濃度測定法の原理
分子の発するりん光が酸素分子との衝突によって
消光される現象を利用
りん光性分子としてイリジウム錯体を利用
6
イリジウム錯体のりん光消光
BTPの構造式
酸素存在下でりん光強度、りん光寿命が減少
りん光強度、りん光寿命変化に基づいて酸素濃度計測
7
酸素濃度の定量法（溶液）
Stern-Volmerの式
10
DMPC 1mM
BTP 10mM
0
p
35 oC
1 k
/
p
15
0
0
0
p O2
p
p
15
5
0
q p
oC
Fp : りん光量子収率
酸素の分圧
tp : りん光寿命
0.1
pO2 / atm
0.2
kq : 消光速度定数
酸素分圧に対してりん光寿命の比をプロットし
消光速度定数(kq)を求めておけば、りん光寿命(tp)
から酸素分圧（酸素濃度）が求まる。
8
酸素濃度の定量法（細胞）
A
1000
Counts
培養器内の酸素分圧を基準にして
細胞内のりん光寿命のcalibrationを行う
0 mmHg
19
38
76
160
500
培養器
0
0
酸素分圧：pO2
10
Time ( s)
20
1
O2
< P>
[O2]
−1
6
−1
(10 s )
B
O2
0.5
0
0
発光寿命測定
50
100
150
pO2 (mmHg)
9
9
イリジウム錯体を用いた細胞内の酸素計測
イリジウム錯体は、配位子の構造を
変えると、細胞膜透過性や細胞内局在
が変化する
BTP-Mito
BTP-Mitoは細胞内のミトコンドリアに
集積して発光（りん光）を与える
ミトコンドリア内の酸素分圧に依存して
発光強度が変化する（酸素応答性）
T. Murase et al., Chem. Lett., 2012, 41, 262.
10
プローブの改良
吸収・発光特性
細胞特性
BTP
p電子系の拡張
カチオン化
N
Ir
S
O
O
2
BTPDM1
細胞内移行性の向上
O
OH
BTPHSA
長波長化（近赤外化）
+
N
Ir
N
N
PF6
-
N
S
S
2
長波長化（近赤外化）
長波長化（近赤外化）, 長寿命化
11
組織への光の透過
532 nm
1
532 nm
652 nm
652 nm
0
400
600
波長 (nm)
深部組織を観るには
近赤外光が必要
800
イリジウム錯体の細胞内局在
リソソーム
小胞体
細胞
BTP
BTPDM1
核
ミトコンドリア
+
S
N
N
PF6
Ir
S
(ppy)2Ir(tpphz)
N
N
NR2
R : H, CH3, CH2CH3
(btq)2Ir(phen-NR2)
S. Tobita and T. Yoshihara, Curr. Opinion
Chem. Biol., 2016, 33, 39.
BTP-Mito
13
測定例（培養細胞内の酸素濃度勾配）
T. Yoshihara et al., Anal. Chem.
2015, 87, 2710.
プローブ
bottom glass
cover slip
BTPDM1
O2
O2
Counts
1000
500
b
200 mm
0
SCC-7細胞の
エッジ付近の明視野像
同じ領域の
りん光顕微画像
0
a
内側 (6.9 mmHg)
b
外側 (166 mmHg)
a
10
Time ( s)
20
BTPDM1のりん光減衰曲線
カバーガラスの内側の細胞は低酸素状態になっている
14
測定例（正常組織と腫瘍組織の酸素化状態）
N
HN
O
S
Ir
N
りん光
寿命計
O
O
2
励起光
BTPDM1
パルス
レーザー
25 nmol, 1% DMSO/saline
1000
Counts
腫瘍のりん光寿命は
正常組織に比べて長い
腫瘍は低酸素状態
に陥っている
腫瘍（6.1 mmHg）
500
0
0
正常組織（50 ｍｍHg）
10
Time ( s)
20
15
吸収・発光波長の長波長化
吸収スペクトル
4
りん光スペクトル
BTP
1
BTP
Near IR
2
0
4
x 20
BTQ
BTQ
1
0
4
BTPH
Intensity / arb. unit
−1
cm
−1
x 20
4
3
/ 10 dm mol
BTIQ
2
2
Fp = 0.40
0
BTIQ
1
Fp = 0.14
tp = 1.4 ms
0
BTPH
1
Fp = 0.32
tp = 2.1 ms
x 20
0
BTBQ
BTBQ
1
x 20
400 500 600 700
Wavelength / nm
Fp = 0.08
tp = 0.9 ms
2
0
300
tp = 5.9 ms
tp = 3.3 ms
x 20
0
4
Fp = 0.33
0
2
0
4
溶媒：ジクロロエタン
0
600
700
800
900
Wavelength / nm
16
測定例（長波長化プローブによる深部組織の観測）
肝臓の裏に腫瘍を固定したマウスの尾静脈からBTPまたはBTPHSAを投与し、
in vivoイメージング装置（Maestro FL500）を用いて発光画像を観測
BTP
S. Zhang et al., Cancer. Res.
2010, 70, 4490.
BTPHSA
BTPHSAでは皮膚から
6 – 7 mmの深さの
腫瘍をイメージング可能
17
新技術の特徴・従来技術との比較
• 酸素電極を挿入する電気化学的方法に比べて、低侵
襲的に酸素計測が可能
• 細胞や組織のような微小領域の酸素濃度測定が可能。
• 寿命計測を行うことにより、細胞や組織中の酸素分布
をイメージングできる
• 目的に合わせてプローブをカスタマイズできる
18
想定される用途
• 酸素濃度測定試薬
• 低酸素腫瘍診断試薬
• 溶存酸素センサー
• 顕微鏡下でりん光寿命測定を行うことにより，細胞や
組織の酸素濃度を高分解能で画像化することが可能
となることも期待される
19
実用化に向けた課題
• プローブの投与量を抑え、計測時間を短縮するために、
プローブの吸収・発光効率をさらに向上させることが
望ましい
• プローブの酸素に対する感受性をさらに高める
• 細胞や組織の酸素化状態を定量するには、発光寿命の
キャリブレーション法を確立することが求められる
• プローブの生体に対する影響をできるだけ軽減する
20
企業への期待
• 細胞や組織の酸素化状態をイメージングするシステ
ムの開発に興味を持つ企業との共同研究を希望。
• 酸素濃度測定試薬，低酸素組織検出試薬、光学式
酸素センサーを開発中の企業，もしくは創薬，環境分
野への展開を考えている企業には，本技術の導入が
有効と思われる。
21
本技術に関する知的財産権
•発明の名称：酸素濃度測定試薬および酸素濃度測定方法
•出願番号
:特願2007-126518
特開2008-281467
•出願人
：国立大学法人群馬大学
•発明者
：飛田成史，吉原利忠，竹内利行，穂坂正博
•発明の名称：細胞・組織内酸素濃度測定のための高感度近赤外
りん光イリジウム錯体
•出願番号
:特願2013-244120
特開2015-101567
•出願人
：国立大学法人群馬大学
•発明者
：吉原利忠，小野寺研一，菊池俊毅，飛田成史
•発明の名称：新規化合物およびそれを利用した酸素濃度測定試薬
•出願番号
:特願2013-244186
特開2015-101570
•出願人
：国立大学法人群馬大学
•発明者
：吉原利忠，村山沙織，飛田成史
22
お問い合わせ先（必須）
群馬大学
産学連携・知的財産活用センター
ＴＥＬ０２７７－３０－１１７1～１１７５
ＦＡＸ０２７７－３０－１１７８
e-mail ｔｌｏ＠ｍｌ.ｇｕｎｍａ－ｕ.ａｃ.ｊｐ
23

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