当日配布資料（554KB）

γ-グルタミルトランスペプチダーゼ
（GGT）の新規阻害剤
京都大学化学研究所
生体機能化学研究系
生体触媒化学研究領域
助教
渡辺
文太
1
γ-グルタミルトランスペプチダーゼ
（GGT）とは
グルタチオン（-Glu-Cys-Gly）およびその抱合
体のγ-グルタミル結合を加水分解する酵素
-Glu-Cys-Gly + H2O  Glu + Cys-Gly (加水分解)
-Glu-Cys-Gly + X  -Glu-X + Cys-Gly (ペプチド転移)
X = アミノ酸、ペプチド、アミン類
ほ乳類や植物、微生物までほとんどあらゆる生物に
普遍的に存在
2
グルタチオン（GSH）とは
H 2N
CO2H GGT
H
N
O
グルタミン酸
O
N
H
SH
システイン
CO2H
グリシン
• イソペプチドの一種
• 重金属やアルキル化剤、活性酸素種など生
体異物の解毒
• 生体内の酸化還元バランスの調節
3
グルタチオン代謝酵素としてのGGT
‐Glu‐Cys‐Gly
（GSH)
GGT
Glu + Cys‐Gly
Glu
GSH
GST
GS‐X
X
γ‐
GCS
Cys +
Cys
‐Glu‐Cys
GSH/GSSG/G
S‐X
GR
Gly
GS
GSH
GSSG
Gly
GPX
MRP
GSH/GSSG/GS‐X
4
GGTの生理的意義
• グルタチオンを加水分解し、細胞のグルタチ
オン生合成に必要なシステインを供給する。
• グルタチオン抱合体を代謝し、生体異物を解
毒する。
• グルタチオン代謝により、生体の酸化還元バ
ランスを調節する。
5
GGTのpro-oxidant効果
グルタチオン（-Glu-Cys-Gly）の分解産物で
あるCys-Glyは極めて活性なチオールであり、
生理的条件下で金属イオンを介して容易に酸
素を還元し、活性酸素種を作り出す。
GGT活性の増大はかえって酸化ストレスを亢
進させることにつながる。
BioFactors, 17, 187 (2003).
6
GGTと疾病（１）
過度のアルコール摂取や薬物により、肝臓での
GGT発現および血中への漏出が顕著に起こる。
→肝疾患やアルコール依存症のマーカー酵素
（γ-GTP）
Crit. Rev. Clin Lab. Sci., 38, 263 (2001).
心筋梗塞や狭心症などの心血管疾患、２型糖尿
病において、血中GGT活性の上昇は危険因子で
ある。
Circulation, 112, 2130 (2005). Atherosclerosis, 194, 498 (2006). Eur. Heart J., 27, 2170 (2006).
J. Intern. Med., 258, 527 (2005).
7
GGTと疾病（２）
ピロリ菌のGGTは、病害性因子として胃壁細胞の
アポトーシスを誘導する。
Mol. Mocrobiol., 47, 443 (2003).
GGTは骨再吸収因子として関節炎や骨粗鬆症に
関与する。
Endocrinology., 148, 2708 (2007).
ガン細胞ではGGTを高発現するものが多く、抗が
ん剤や放射線療法に対する耐性獲得や転移活性
との関係が示唆される。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3070 (1992). Carcinogenesis, 20, 553 (1999).
Biochem. Pharmacol., 71, 231 (2006).
8
本研究の目的
GGTの生理的役割を明確にするため
選択的GGT阻害剤を開発する。
各種疾病とGGT
活性との具体的
な関係は？
グルタチオン代謝を通した
生体防御
酸化ストレスの亢進
9
従来のGGT阻害剤
CO2H
Cl
H2N
O N
アシビシン（AT-125）
• Streptomyces sviceusの産生する抗生物質
• グルタミン代謝拮抗剤として、グルタミンアミドトラン
スフェラーゼ（GAT）類に広く作用する。
• 多くのグルタミン依存性酵素を阻害し、強い細胞毒
性や中枢神経毒性を示す。
10
アシビシンの問題点
低いGGT選択性とそれに起因する毒性
→GGT阻害による影響を正確に評価できない
GGT選択性を向上させるための分子設計
GGTの触媒機構に着目
11
阻害剤の分子設計
GGTの触媒機構
CO2H
HO-GGT
CO2H
H2N
NHR
H2N
O
NHR
O
-
O
CO2H
O
H2N
GGT
H2NR
GGT
O
TS1
H2O
CO2H
H2N
O
O
-
CO2H
GGT
OH
H2N
NHR
+
HO-GGT
O
TS2
遷移状態アナログ阻害剤
CO2H
H2N
O
P
O
Me
CO2H
HO-GGT
O
X
H2N
O
P
OMe
O
HO
+
X
GGT
12
阻害剤の合成
Br
OE t
P
O
+
OE t
C O 2H
H 2N
OH
P
O
OH
E tO 2C
A c HN
Na +
(E tO) 2 C O, toluene
rfx
2) B nOH, S OC l 2
(64% )
O
O
(48~70%)
OH
X
OMe
P
O
O
O
Me
OE t
1) 6N HC l, rfx
2) propylene oxide
(97% )
C O 2B n
(C OC l) 2, DMF
P
C bzHN
C H 2C l2
E t3 N
+
Cl
P
OE t
O
Cl
Cl
C O 2B n
C O 2H
H 2N
OH
HO
P
C bzHN
P
C bzHN
C O 2E t
O
C O 2B n
C O 2B n
H 2 , P d/C or A lC l 3
E tO 2 C
A c HN
–
1) C bz-C l, NaOH
MeOH
E t3 N, -65ºC
C O 2E t
X
0ºC
(31~54% )
P
C bzHN
O
O
O
Me
X
阻害活性の測定
CO2H
H
N
H 2N
O
O
GGT
OH
H2N
O
γ-Glu-AMC
H2N
CO2H
O
+
Me
O
Me
7-アミノ-4-メチルクマリン
（AMC）
30
100 mM コハク酸-Na (pH 5.5)
[I] = 0 M
10
25
20
20
AMC nM
• 4.0 or 0.2M -Glu-AMC
• 阻害剤
• ヒトGGT or 大腸菌GGT
O
30
40
15
60
10
蛍光測定
励起波長：350 nm
蛍光波長：440 nm
5
0
0
100
200
300
Time sec
400
500
600
GGTの時間依存的失活
14
阻害活性の評価
酵素と阻害剤との２次反応速度定数konを阻害活
性の指標とする。
E•S
E + P
Vinact = kon [E] [I]
E-I
[I] = 0 M
10
25
20
20
AMC nM
E + S
30
30
40
15
60
10
5
konが大きいほど酵素が速やかに失
活する強い阻害剤である。
0
0
100
200
300
Time sec
400
500
600
GGTの時間依存的失活
15
ヒトおよび大腸菌GGTに対する阻害活性
CO2H
H2N
No.
X
O
P
HO-GGT
O
pKa
H 2N
X
O
Me
CO2H
kon [M-1s-1]
ヒト
大腸菌
OMe
P
O
O
X
No.
+
GGT
pKa
HO
X
脱離基
kon [M-1s-1]
ヒト
1
4-OMe
10.40
0.16
19
8
4-CO2H
8.70
2
4-Me
10.21
0.24
24
9
4-CF3
8.51
12
2900
3
H
9.98
0.40
120
10
3-NO2
8.36
49
5100
4 4-CH2CO2H
9.84
0.33
210
11
4-CN
7.95
46
12000
5 3-CH2CO2H
9.71
150
12
4-NO2
7.15
130
35000
0.40
4200
6
7
4-Cl
3-CO2H
9.41
9.14
51
5.0
1.6
610
450
CO2H
Cl
H2N
O N
（アシビシン）
-6.18
（HCｌ）
5.2
大腸菌
3200
16
ブレンステッドプロット
ヒトGGT
大腸菌GGT
CO2H
H2N
O
P
O
CO2H
O
Me
pkon
pkon
化合物5
◆
pKa
pKa
17
活性中心についての考察
ヒトGGT
CO2–
H3N+
O
H
N
-
Oδ
δO
Thr
大腸菌GGT
N
H
SH
CO2–
P
O
O O
HO Me
Thr
X
+
H3N+
-
Oδ
δO
X
+
CO2–
N
H
SH
CO2–
H
CO2–
O
H
N
Thr
CO2–
H3N+
CO2–
H
H3N+
P
O
O O
HO Me
X
Thr
ヒトGGTはグルタチオンC末端の負電荷を厳密に認識している。
18
水溶液中での安定性
No.
kon
構造
D2O
（ヒトGGT）（室温/12時間）
備考
CO2H
5
H2N
O
P
O
CO2H
O
Me
51
分解せず
46
12%分解
• D2O中室温で1ヶ月後も安
定
CO2H
11
H2N
O
P
O
O
Me
CN
CO2H
12
H2N
O
P
O
O
Me
130
NO2
49%分解
• NaHCO3:100%分解
• CD3CO2D中：40%分解
• CF3CO2DまたはDCl：
24時間後も安定
（いずれも1M）
19
化合物5の特徴
GGT選択性
• GAT（アスパラギン合成酵素のグルタミナーゼドメイ
ン）を全く阻害しない（10 mM、2時間）。
アシビシンは0.1 mMの濃度でGATを90%以上失活させる。
安全性
• 雌雄マウスに対して急性毒性を示さない（100 mg/Kg、
単回静脈内投与、2週間観察）。
• エイムス試験において変異原性を示さない。
20
まとめ
CO2H
H2N
O
P
O
O
Me
CO2H
• GGTの新規阻害剤を開発した。
• 阻害活性（ヒトGGT）、選択性、安全性の面で
既存のGGT阻害剤であるアシビシンより優れる。
21
想定される業界
・試薬メーカー
用途：グルタチオン代謝に関する基礎研究全般に有用な生化学用試薬
22
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称：ホスホン酸ジエステル誘導体
およびその製造方法
• 出願番号：特願2007-549163
• 出願人
：国立大学法人京都大学
• 発明者
：平竹潤、坂田完三、韓立友
23
お問い合わせ先
関西TLO株式会社
アソシエイト大西
晋嗣
ＴＥＬ０７５－７５３－９１５０
ＦＡＸ０７５－７５３－９１６９
e-mail [email protected]
24

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