酵素を使わずに光で遺伝子を操作する方法の開発と遺伝子解析への

酵素を使わずに光で遺伝子を操作する方法の
開発と遺伝子解析への応用
北陸先端科学技術大学院大学
マテリアルサイエンス研究科
藤本健造
酵素を用いた遺伝子工学の中に「光を用いた遺伝子操作」という概念が
入ることによるパラダイムシフト
従来の遺伝子工学システム
•ハンドリングが難しい
（酵素固有の至適pH,温度等制限有り）
•機械化、自動化が難しい
（酵素活性の規格化、再現性に制限有り）
•コストがかかる
•in vivoでの操作に制限有り
•空間的時間的な局所操作に制限有り
新しい遺伝子工学システム
パラダイムシフト
•ハンドリングが容易
（光を照射するだけ、操作時間も短縮）
•機械化、自動化が容易
（規格化、再現性等も確保）
•低コスト（LED光源ならば寿命30,000時間）
•in vivoでも外部からのリモート操作可能
•狙った場所に狙ったタイミングで操作可能
光DNA操作
酵素を用いた遺伝子操作
○連結ーリガーゼ、ポリメラーゼ
○切断ー制限酵素
312 nm
366 nm
pH、塩強度、温度の至適条件下で使用
酵素を使わない遺伝子操作
光化学的連結法
O
5'
3'
緩和条件、制御容易
O
R
R
HN
O
酵素法←→光操作法
リガーゼ
366 nm
制限酵素
312 nm
HN
O
N
NH
3'
5'
N
O
template
O
3'
5'
366 nm
312 nm
5'
3'
O
N
NH
3'
5'
N
O
template
3'
5'
Modified Nucleosides Library for DNA Photoligation
光応答性人工DNA素子の設計・合成
O
O
O
O
HN
COOMe
HN
N
dR
O
O
COOH
HN
O
N
dR
O
CONH(CH2)3NH2
HN
N
dR
O
N
dR
O
CN
N
dR
HN
O
O
O
O
O
COOMe
HN
HN
H
O
N
dR
O
O
CH3
CN
HN
N
dR
O
O
N
dR
O
O
HN
N
dR
O
CN
HN
HN
O
N
dR
N
dR
CN
O
NH2
NH2
N
O
NH2
COOMe
N
N
dR
O
O
MeOOC
NH2
NH2
N
N
N
N N
dR
O
HO
O
OH
O
O
O
N
dR
N
OH
O
N
NC
OH
O
O
O
HO
OH
OH
HO
HO
O
OH
HO
O
OH
H
O
O
O
OH
OH
HO
H
O
O
CO2H
OH
O
OH
O
HO
O
O
CONH2
CO2H
HO
O
OH
OH
H
HO
O
CO2CH3
O
OH
O
HO
H
OH
O
O
OH
CONH(CH2)3NH2 OH
CO2CH3
OH
OH
N
O
O
NH
H2N(H2C)3HNOC
O
CN
O
O
O
O
O
O
H
NH
O
HO
H
HO
O
N
O
OH
HO
H3C
HO
dR
N
dR
H
O
N
CN
OH
CONH2
HO
O
NH
O
N
dR
HO
O
N
dR
O
HO
O
NH2
CH3 MeN
CONH(CH2)3NH2
OH
H
O
O
N
O
O
MeN
NH
O
O
N
H
dR
O
OH
O
N
N
dR
O
HN
NH
N
NH2
N
dR
O
H
O
O
N
H
HO
CO2CH3
HO
O
O
OH
O
H3CO2C
CONH2
HO
O
O
O
N
MeN
O
H
O
NH
O
H2NOC
N
dR
HO
H
OH
O
CO2H
HO
O
NH
O
HO2C
N
dR
O
O
CN
O
N
O
dR
COOMe
MeN
O
O
H
N
N
H
HOOC
N
NH2
O
HO
N
N
HN
NH
dR
CONH(CH2)3NH2
H
O
NH
O
dR
MeN
O
HO
NH
N
NH2
N
N
O
NH
O
COOH
N
dR
H
O
N
N
H2NOC
O
NH
dR
COOMe MeN
HO
H
N
N
dR
O
O
H
N
N
H
N
dR
O
MeOOC
O
N
dR
O
O
NH2
N
HN
N
N
dR
O
O
HN
H
O
N
N
N
N
dR
HOOC
NH2
N
MeN
N
dR
O
H2NOC
CN
N
N
dR
dR
MeN
O
CONH2
N
N
dR
NH2 O
NH2
O
H
O
CN
CONH(CH2)3NH2
HO
O
OH
O
CN
HO
O
OH
O
H
N
N
O
光応答型インテリジェント核酸を用いた新しい核酸の操作法開発
光を用いた新しいDNA,RNA操作
枝分かれ
環状
末端キャップ
クロスリンク
酵素では作れない核酸構造
DNA,RNAナノテク・核酸医薬
高感度を有する高速遺伝子解析
Angewandte Chemie Int. Ed. 2006, 45, 4512 特願2005-332424
Capture
Biotin-DNA
Target-DNA
Cy3
cv
V
3'
Probe
5'
(S)4-ACTTGGYC U CCGGGTAGGAGTGGTAGTAGT
ATGAACCXG--A--GGCCCATCC TCACCATCATCAC
A
C
Target (p53)
C
G
T
G
S : Hexaethyleneglycol
X = G (Wild-type),
5'
T, C, A, Deleted (Mutant)
Y = C, A, G,T, Deleted
B : Biotin
マッチ配列を検出
アデニンかどうかを識別
光連結させることで識別能が3桁増加
B
3'
Scheme 1
y ハイブリダイゼーション特異性
y 光連結の特異性
366 nm
cvU
cvU
Match
SNP
366 nm
Mismatch
Condition : Probe ODN (1 μM), Target ODN (1 nM) in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) and 250 mM
MgCl2. 366 nm for 1 h at r.t.
光連結させることで識別能が3桁増加
Figure 10. Fluorescence image for each condition
Figure 11. Selectivity for each condition
Generality of Photoligation Method
High
５種の多型に対し識別
能は>103-fold
Low
Figure 12. Relative intensity and fluorescence image for all 25 possible combinations of captures and targets
従来の１００倍の感度を有する高速遺伝子解析
Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583
配列特異的な光ライゲーション反応によって高感度
なSNP解析に成功
RNAを鋳型にした光ライゲーション
ChemBioChem 2006, 7(4), 598
ODN T^ODN
ODN T
ODN
CVU
CVU
hν(366 nm)
3’
RNA template
5’
hν(312 nm)
RNA template
ChemBioChem誌に掲載された「光連結法を用いたRNAタイピングに関
する研究」がWiley誌から発行されるジャーナルの中よりHot topics in
RNA studyに選ばれました。
RNAの選択的なタイピングが可能
Figure. Fluorescence intensity (top) and images
(bottom) acquired on a microarray scanner for the
product of photoligation on matched and singly
mismatched target RNAs.
目的のRNAのみを選択的にラベリング可能
Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 139
Fig. Fluorescence intensity (top) and images (bottom)
acquired on a microarray scanner for the product of
photoligation. Lane 1, ODN(A), irradiation at 366 nm;
Lane 2, B-ORN(U), irradiation at 366 nm; Lane 3, BORN(U) + ODN(A), irradiation at 366 nm; Lane 4, BORN(A) + ODN(A), irradiation at 366 nm; Lane 5, BORN(G) + ODN(A), irradiation at 366 nm; Lane 6, BORN(C) + ODN(A), irradiation at 366 nm.
光ライゲーション法の特徴
•ハンドリングが容易
（光を照射するだけ、操作時間も短縮）
•機械化、自動化が容易
（規格化、再現性等も確保）
•低コスト（LED光源ならば寿命30,000時間）
•in vivoでも外部からのリモート操作可能
•狙った場所に狙ったタイミングで操作可能
•DNAは勿論、RNAに対しても操作可能
•PCRとの組み合わせも可能
想定される用途
DNA、RNAの解析診断
光で操作可能（UV-LEDならば軽量かつ長寿命）
装置化、自動化が可能
選択的DNA、RNAの光ラベリング
in vivo での利用可能（酵素法・化学法では困難）
狙ったところ、狙ったタイミングで操作可能
RNAi等の核酸分子のケージング、光操作
想定される業界
DNA及びRNA解析装置
光操作（単一波長）可能であることから機械化・
自動化が容易、解析装置への組み込み
核酸医薬
特にRNAi及びデコイ核酸等の光操作
バイオイメージング
顕微鏡での操作に組込むことで狙ったタイミン
グで狙った場所にピンポイント操作可能
本技術に関する知的財産権
•発明の名称
•出願番号
•出願人
•発明者
•発明の名称
•出願番号
•出願人
•発明者
：特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、
及び検出のための核酸類セット
：特願2005-33242
：独立行政法人科学技術振興機構
：藤本健造他２名
：フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体
および光応答性ヌクレオチド
：特許4015136
：独立行政法人科学技術振興機構
：藤本健造他２名
お問い合わせ先
科学技術振興機構（ＪＳＴ）
技術移転促進部シーズ展開課
技術移転プランナー栗本忠
ＴＥＬ：０３－５２１４－７５１９
ＦＡＸ：０３－５２１４－８４５４
e-mail：t2kurimo＠ｊｓｔ.ｇｏ.ｊｐ

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