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Reproduktionsmedizin
Vitrifikation
Frank Nawroth
Bei der langsamen Kryokonservierung
wird den einzufrierenden Zellen das intrazelluläre Wasser durch kryoprotektive
Lösungen entzogen, in der sie zur Vorbereitung mehrere Minuten verbleiben.
Dies soll die sonst beim langsamen Einfrieren ablaufende intrazelluläre Kristallisation des Wassers verhindern.
Die Vitrifikation einer Lösung ist definiert
als die „Solidifikation von Wasser ohne
Eiskristallbildung bei Temperaturen weit
unter 0 °C, verursacht durch eine extreme
Erhöhung der Viskosität der Lösung während des Abkühlens“ [8, 9]. Durch sehr
schnelles Abkühlen des Wassers konvertiert die Lösung in einen glasähnlichen
amorphen Aggregatzustand ohne kristalline Strukturen. Bei der Vitrifikation ist
kein vollständiger Flüssigkeitsentzug erforderlich, da durch die hohen Einfriergeschwindigkeiten (direktes Eintauchen
in LN2) der Vitrifikationsvorgang schneller abläuft als die Entstehung von Eiskristallen. Daher sieht die Flüssigkeit nach der
Vitrifikation – im Unterschied zum milchig-weißen Aussehen nach dem langsamen Einfrieren – klar und durchscheinend („vitriös“) aus, was zur Namensgebung der Methode geführt hat.
Ein standardisiertes Vitrifikationsprotokoll sowohl für Eizellen als auch Embryonen ist momentan nicht verfügbar, da
" Eizellen und Embryonen ein unterschiedliches Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen aufweisen,
" Eizellen, Zygoten, Teilungsstadien und
Blastozysten unterschiedliche Kühlund Erwärmungsraten erfordern und
" die verschiedensten Zellstadien eine
unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Kälte aufweisen.
Abb. 1 Durch die Dehydrierung (Äquilibrierung) deutlich geschrumpftes Zytoplasma
einer Zelle in Metaphase II in Vorbereitung auf
die Kryokonservierung (Abb. aus [22] mit
freundlicher Genehmigung der Springer Verlag
GmbH).
Vitrifikation von Eizellen
!
Die erste Lebendgeburt unter Verwendung von Vitrifikationsprotokollen gelang
Kuleshova et al. im Jahr 1999 [13]. Das
Einfrieren von Eizellen kann die Fertilität
von Frauen sichern, welche
" sich einer Chemotherapie unterziehen
müssen,
" ihren Kinderwunsch aufgrund von Karriere, Partnerschaftstatus oder psychologischen, emotionalen Gründen zeitlich verzögern („social freezing“)
" oder wenn am Tag einer Eizellentnahme zur In-vitro-Fertilisation (IVF) oder
intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) die Masturbation nicht gelingt bzw. akut eine Azoospermie vorliegt.
Im Folgenden wird anhand der Vitrifikation von Eizellen kurz die praktische
Durchführung der Methode inklusive der
späteren Erwärmung in einem der möglichen Protokolle dargestellt. Die Dehydrierung der Zelle beginnt mit einer Inkubation der Zellen in 7,5 % Ethylenglykol
(EG)/Dimethylsulfoxid (DMSO) und 20 %
Protein. Die Dauer der Inkubation ist je
nach Zelltyp unterschiedlich (von lang
nach kurz: Eizelle – Zygote – Tag-3-Embryonen – Tag-5-Blastozysten). Daran
schließt sich eine Inkubationsdauer von
60–70 s in 15% EG/DMSO, 0,5 M Zucker
und 20 % Protein an. Der Einsatz eines Zuckers unterstützt die Dehydrierung wäh" Abb. 1).
rend der Vitrifikation [22] (l
Anschließend werden die Zellen auf ein
Trägersystem („carrier“) aufgebracht und
direkt (offenes System) oder erst nach
Verschluss des Systems (geschlossenes
System) in LN2 eingetaucht. Dabei ist es
wichtig, dass die Zellen in einem kleinen
Volumen der Vitrifikationslösung auf das
Trägersystem aufgetragen werden [22]
" Abb. 2 a bis e).
(l
Nach der Überführung der Zellen in das
Trägersystem wird dieses in den mit flüssigem LN2 gefüllten Lagerbehälter ge" Abb. 3 a bis d).
bracht [22] (l
Für die Rehydrierung nach der Entnahme
aus dem LN2 sind 3 Schritte notwendig:
" Zuerst werden die Zellen in eine 1-MZuckerlösung gebracht.
" Daran schließt sich eine Inkubation in
0,5 M Zucker an,
" bis die Zellen letztendlich in einer zuckerfreien Lösung inkubiert werden.
Die Verwendung einer Zuckerlösung während des Erwärmens erlaubt einen kontrollierten Austausch von Kryokonservierungsmittel und Wasser. Die Zelle kann
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Die Kryokonservierung bezeichnet die Lagerung vitaler Zellen und Gewebe in flüssigem Stickstoff bei
− 196 °C (liquid nitrogen, LN2). Da sie unter natürlichen Bedingungen nie solch niedrigen Temperaturen
ausgesetzt sind, werden spezielle Kryokonservierungsmethoden und kryoprotektive Lösungen benötigt,
damit die Zellen und Gewebe diesen Prozess sowie das spätere Auftauen überleben. Seit dem letzten
Jahrzehnt ist ein eindeutiger Trend von der zeitintensiven, langsamen Kryokonservierung mit programmierbaren Einfriergeräten hin zur Vitrifikation, einem zeiteffektiven, ultraschnellen Einfrierverfahren
ohne kostenintensive Gerätetechnik, zu beobachten [16].
GebFra Magazin
Nach der Vitrifikation wurden Überlebensraten reifer Eizellen von ca. 95 % beschrieben [26]. Mittlerweile lassen sich
unbefruchtete Eizellen – allerdings nur
mit einem modifizierten Einfrierprotokoll
und in einem darauf spezialisierten Zentrum – auch im „slow freezing“ ebenfalls
mit besseren Ergebnissen einfrieren. Die
publizierte Implantationsrate pro injizierter Oozyte lag hier bei 11,8 % (Alter ≤ 34
Jahre), 7,5 % (35–39 Jahre) bzw. 7,5 % (≥ 39
Jahre) [3].
Generell wird die Vitrifikation heute als
Methode der Wahl angesehen [4]. Obwohl
im Vergleich zu geborenen Kindern aus
langsam eingefrorenen Eizellen die Geburt des ersten Babys aus vitrifizierten Eizellen erst ca. 13 Jahre später gelang, hat
die Zahl geborener Kinder mittlerweile
die nach langsamer Kryokonservierung
übertroffen. Die längste bisher publizierte
Lagerungsdauer und nachfolgende Geburt
liegt bis dato für langsam eingefrorene
Oozyten bei 13 Jahren [29] und für vitrifizierte Zellen bei 6 Jahren [5].
Abb. 2 a bis e Offenes Trägersystem (KITAZATO Cryotop®, Fa. Dibimed) (Abb. aus [22] mit freundlicher Genehmigung der Springer Verlag GmbH).
Tab. 1 Ergebnisse des nationalen italienischen Registers 2007–2011 [14].
Slow Freezing
Zyklen (n)
Vitrifikation
p
–
8 927
5 401
Überlebensrate/aufgetauter EZ
51,1 %
63,1 %
Fertilisierungsrate/injizierter EZ
68,9 %
68,0 %
0,037
Schwangerschaftsrate/Zyklus
12,0 %
14,4 %
< 0,001
Schwangerschaftsrate/Transfer
14,8 %
18,0 %
< 0,001
8,1 %
9,5 %
< 0,001
Implantationsrate/aufgetauter EZ
geborene Kinder (n)
Fehlbildungsrate
778
560
0,5 %
1,3 %
< 0,001
–
0,145
EZ – Eizelle
Die Neugeborenen zeigten kein erhöhtes
Risiko kongenitaler Anomalien [23]. Das
bestätigte eine weitere Auswertung aus
dem italienischen Register sowohl für die
langsame Kryokonservierung als auch für
die Vitrifikation von Eizellen. Die Erfahrungen aus Italien sind besonders umfassend, da hier für IVF-Programme gesetzlich seit Längerem vorgeschrieben ist,
dass nach der Follikelpunktion lediglich
3 Oozyten für die weitere Verwendung
zur IVF oder ICSI genutzt werden können
und alle überzähligen Zellen unbefruchtet
eingefroren werden müssen. Erstaunlich
in deren Statistik sind lediglich die im
Vergleich zur Literatur niedrigeren Überlebensraten sowohl für das modifizierte
langsame Protokoll als auch für die Vitrifi" Tab. 1).
kation [14] (l
Den Studiendaten Rechnung tragend, haben die amerikanischen Fachgesellschaften in ihrer aktuellen Leitlinie aus dem
Jahr 2013 empfohlen, die Methode der Vitrifikation von reifen Oozyten ab sofort
nicht mehr als experimentell anzusehen
[28].
Vitrifikation von Vorkernstadien
dadurch nur langsam expandieren und
anschwillen, was sich positiv auf die Überlebensrate auswirkt. Der nicht membrangängige Zucker wirkt außerdem als osmotischer Puffer – er reduziert den osmoti-
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schen Schock auf die Zelle. Völlig verhindern kann die hohe Zuckerkonzentration
das Anschwellen der Zelle nicht; Geschwindigkeit und Ausmaß werden aber
reduziert [21].
!
Ca. 1,5 h werden für die Kryokonservierung von Zygoten mit dem traditionellen
langsamen Protokoll benötigt. Im Gegensatz dazu erfordert die Vitrifikation nur
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Abb. 3 a bis d Überführung des Trägersystems in den mit flüssigem LN2 gefüllten Lagerbehälter (Abb. aus [22] mit freundlicher Genehmigung der Springer
Verlag GmbH).
ca. 10–15 min. Die Überlebensrate vitrifizierter Zygoten liegt bei > 90 % mit einer
Teilungsrate von 80% am Tag 2 und einer
Blastozysten-Formationsrate am Tag 5
von > 30% [1, 11, 17, 24].
Vitrifikation von Teilungsstadien
!
Abhängig von der Wahl des Trägersystems demonstrierten Liebermann und Tucker [18] Überlebensraten von 80–90 % sowie Teilungsraten und eine Morulabildung von > 30 %. Die Überlebensrate von
Embryonen nach langsamem Einfrieren
oder Vitrifikation liegen vergleichbar um
die 75–80 % [12]. Erfolgreiche Schwangerschaften und Lebendgeburten von vitrifizierten Teilungsstadien wurden beschrieben [6, 7, 25, 27]. Loutradi et al. [20] publizierten eine Metaanalyse und einen systematischen Review zur Kryokonservierung
von Teilungsstadien unter Verwendung
des traditionellen langsamen Protokolls
im Vergleich zu den Vitrifikationsprotokollen und fanden eine Überlebensrate
von 84 bzw. 97 %. Vitrifikationsprotokolle
zeigten sich auch hinsichtlich klinischer
Schwangerschafts- (48 vs. 35 %) und Implantationsraten (39 vs. 15%) deutlich
überlegen [2, 6, 15, 25]. Schlussfolgernd
kann festgestellt werden, dass Vitrifikationsprotokolle für Teilungsstadien einen
positiven Einfluss auf das gesamte weitere
Outcome besitzen.
on des Kryokonservierungsmittels sein,
sodass intrazellular Restwasser verbleibt,
welches dann kristallisiert. Als hilfreich
beschrieben einige Arbeitsgruppen die artifizielle Reduktion der Blastozoele vor
der Vitrifikation [10, 19]. Nach der Vitrifikation menschlicher Blastozysten unter
Anwendung verschiedener Trägersysteme
betrug die Überlebensrate 72–90%, die
klinische Schwangerschaftsrate 37–53 %
und die Implantationsrate 22–30 % [21].
Vitrifikation von Blastozysten
Fazit für die Praxis
!
!
Die Blastozyste ist ebenso wie die unbefruchtete Eizelle besonders empfindlich
gegenüber niedrigen Temperaturen. Ihre
Besonderheit liegt im flüssigkeitsgefüllten
Blastozoel. Es ist bekannt, dass die Überlebensrate nach Vitrifikation mit zunehmendem Volumen des Blastozoels abnimmt. Eine mögliche Ursache dafür
könnte eine nicht ausreichende Permeati-
Mit der Vitrifikation steht eine einfache
Technologie zur Verfügung, die sich
schnell in ein IVF-Labor integrieren lässt.
In Anbetracht der beschriebenen Daten
kann unschwer prognostiziert werden,
dass die Vitrifikation sich als Alternative
zu den langsamen Einfrierprotokollen
weiter etablieren bzw. diese zunehmend
verdrängen kann.
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Aktuell diskutiert
GebFra Magazin
Der Diskussion über die Anwendung von
offenen Trägersystemen und die mögliche
Gefahr der Kontamination der Zelle mit
Bakterien, Pilzen oder verschiedenen Virustypen in LN2 kann durch den Einsatz
eines geschlossenen Trägersystems begegnet werden [21]. Seit 2015 existiert
auch erstmals ein automatisiertes Gerät
für die geschlossene Vitrifikation, das den
Arbeitsaufwand noch weiter reduzieren
und die Abläufe ggf. noch konsistenter gestalten könnte.
Interessenkonflikt
!
Der Autor gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagung
!
Mein Dank gilt Frau Dr. rer. nat. Beatrice
Maxrath für ihre Hilfe bei der Bereitstellung der Abbildungen.
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Korrespondenz
Prof. Dr. Frank Nawroth
Facharzt-Zentrum für
Kinderwunsch, Pränatale
Medizin, Endokrinologie
und Osteologie, Hamburg
Frank.Nawroth@
amedes-group.com
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