制御性 T 細胞選択的増幅メカニズムを利用した免疫疾患制御への

Cytometry Research 25（2）：7 ∼ 13，2015
総説
制御性 T 細胞選択的増幅メカニズムを利用した免疫疾患制御へのアプローチ
−新たな急性 GVHD 治療法開発の試み−
佐竹敦志
Therapeutic approach to immune-mediated diseases by utilizing the regulatory T cell
selective expansion mechanism
- The challenge for developing a novel treatment against acute graft-versus-host-disease Atsushi Satake M.D.,Ph.D.
First Department of Internal Medicine, Kansai Medical University, Osaka, Japan
Abstract
Strategies to expand regulatory T cells (Treg)s hold therapeutic potential for ameliorating T cell-mediated inflammatory
diseases. TCR signaling is partially dispensable for IL-2-induced Treg proliferation, as has been shown recently. In
contrast, conventional T cells (Tconv)s require TCR signal activation for their proliferation. Therefore, we can expect
that in conjunction with IL-2, pharmacological inhibition of TCR signaling may induce the expansion of Tregs while
simultaneously inhibiting Tconv proliferation. We hereby demonstrate that costimulation but not TCR-mediated
phospholipase Cγ (PLCγ) activation is required for the IL-2-induced Treg proliferation. Using Cyclosporine A (CSA) to
inhibit TCR signaling and rapamycin to suppress costimulatory signaling pathways, we also demonstrate that while both
agents attenuated antigen-specific Tconv proliferation, only CSA permitted IL-2-induced Treg expansion. Rapamycin,
however, did increase the Treg:Tconv ratio due to its negative effects on Tconv survival. Importantly, CSA synergized
with IL-2 in protection against experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). However, CSA abolished whereas
rapamycin augmented the beneficial effect of IL-2 in graft-versus-host disease (GVHD). These differences could be
potentially explained by the ability of rapamycin to promote inducible Treg generation and to allow TCR-enhanced Treg
proliferation, processes that were inhibited by CSA but are important for GVHD protection. Thus, depending on the
disease setting, different signaling pathways need to be targeted to increase the Treg:Tconv ratio for treatment of T cellmediated inflammatory disorders.
Key words : Regulatory T cell, IL-2, T cell receptor, GVHD, EAE
Ⅰ．はじめに
CD4＋CD25＋Foxp3＋制御性 T 細胞（Treg）は自己応
答性 T 細胞の活性化を制御し，免疫寛容を維持する
上で必須の T 細胞サブセットである。Treg のマス
ター遺伝子 Foxp3 の異常により Treg が欠損すると，
免疫寛容が得られず IPEX 症候群（X-linked immune
関西医科大学内科学第一講座
受付日：平成 27 年 6 月 29 日受理日：平成 27 年 9 月 29 日
dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked，
X 染色体連鎖免疫制御異常多発性内分泌障害消化器
7
Selective expansion of Tregs and acute GVHD
病）患者や Scurfy マウスで見られるような重症の自
iTreg（iTreg には CD4＋iTreg と CD8＋iTreg が混在）が
己免疫病が発症する 1）2）。その他にも，Treg は多くの
ほぼ同比率で存在し（Fig. 1）
，さらに両者共に GVHD
生理的，病的な免疫応答の制御において重要な役割を
抑制効果を持つ事が分かっている 7）。このことから，
果たしている 3）。
急性 GVHD 抑制を目的とした Treg 選択的増幅を目指
Treg による免疫抑制作用は自己免疫反応に対して
のみならず，非自己抗原を標的とした同種免疫におい
す場合，nTreg あるいは iTreg に関わらず Treg が増幅
されれば，GVHD 抑制効果が期待出来ると考えられる。
ても発揮されることが分かっている 4）5）。同種造血幹
細胞移植は主として造血器悪性疾患に対する根治的
Ⅲ．Treg の維持・増幅メカニズム
治療法であるが，移植片対宿主病（GVHD）はドナー
マウスを用いた基礎研究により，定常状態では
由来の免疫細胞によって引き起こされる重大な合併
Treg の維持・増殖には樹状細胞（DC）などの抗原提
症である。GVHD は重症化すると致死的となるほか，
示細胞上の MHC クラスⅡ（MHC Ⅱ）から T 細胞受
GVHD を制御するために使用する免疫抑制剤の大量投
容体（TCR）を介する刺激や，IL-2 が重要であること
与は日和見感染症や，ドナー由来免疫細胞による抗
が示されている 8）9）10）。この IL-2 の供給源は通常 T
腫瘍効果を減弱させてしまう危険性がある。マウス
細胞（Tconv：CD4＋Foxp3− ）であるが，TCR シグナ
モデルを用いた基礎研究の結果から Treg は GVHD に
ル経路の PLCγのリン酸化が不可能な T 細胞あるい
5）
対しても抑制効果を持つことが示されており，Treg
は MHC Ⅱ KO マウスを用いた実験から，DC 存在下で
の免疫抑制作用を利用した GVHD 治療への応用が期
IL-2 が供給される場合，DC からの共刺激シグナルが
待されている。Treg による GVHD 治療の方法として
あれば，Treg の増殖は大部分維持されることが明ら
は，体外増幅した Treg を輸注する方法と，体内で
かとなった 11）12）13）。すなわち，Treg の増殖には TCR
Treg を増幅させる方法が考えられる。しかし，Treg
シグナル活性化は必要不可欠ではないことが解明され
は in vitro での増殖効率が悪く，凍結保存も困難であ
ている（Fig. 2）
。
ることから，必要時に十分な Treg を安定して得られ
一方，Treg に比較し Tconv の増殖には共刺激シグナ
ない可能性があり，体外増幅による治療運用には課題
ルだけではなく，強力な抗原刺激による TCR シグナル
がある。一方，生体内で免疫促進的に働く他の免疫細
活性化を必要とする。これらの違いから，PLCγ以下の
胞を増殖・活性化させること無く，同種抗原応答性の
活性化阻害と IL-2 供給を同時に行うことで，Tconv の
Treg を選択的に増幅させることが出来れば，効果的
活性化を抑制しつつ Treg だけを選択的に増幅させるこ
に GVHD を抑制する事ができると考えられる。
とが出来る可能性が考えられた。
本稿では，Treg の選択的増幅に必要なメカニズム
について得られた知見と，急性 GVHD モデルに加え
自己免疫疾患モデルでの Treg による疾患制御の試み
Ⅳ．薬剤による Treg 選択的増幅と自己免疫疾患
上述した Treg と Tconv 活性化における PLCγ活性
化への依存度の違いから，薬剤によって PLCγ以下
を紹介する。
のシグナル活性化を阻害しながら IL-2 投与を行えば，
Tconv の活性化・増殖を抑制しながら Treg を増幅でき，
Ⅱ．同種造血幹細胞移植後の Treg プール
通常生体内の Treg は，胸腺内での分化・成熟段
階の過程で Foxp3 を獲得した naturally occurring Treg
＋
より強い免疫抑制効果を得られることが期待される。
実際，PLCγより下流にあるカルシニューリンの阻害
＋
薬であるシクロスポリン A（CSA）を加え，IL-2 存在
Foxp3− ）から Foxp3 を獲得して Treg となる inducible
下で Treg を DC と共培養した場合，Treg 増殖はほと
Treg（iTreg）から構成されていると考えられている 6）。
んど抑制されなかった。一方，共刺激シグナルの主
同種造血幹細胞移植後の Treg プールもこの両者から
たるシグナル経路である AKT-mTOR 経路を阻害する
構成されていることが推測されるが，その比率やそれ
mTOR 阻害薬（ラパマイシン：Rapa）を使用した場合，
ぞれが GVHD 抑制に果たす役割は解明されていない。
Treg の増殖は著明に抑制されたため Treg 増殖におけ
これらは移植後の時期やカルシニューリン阻害薬の使
る mTOR 活性化の重要性が示唆された（Fig. 3A, B）
。
用等により影響を受ける可能性があるが，マウス急性
尚，AKT-mTOR 経路は DC からの共刺激シグナルだ
GVHD モデルを用いた検討では免疫抑制剤を使用しな
けでなく IL-2 シグナルの下流にも含まれ，Rapa はこ
い条件下で，移植後早期の Treg プールは，nTreg と
の経路も阻害すると考えられるが，Treg の維持・増
（nTreg）と，末梢組織で naive T 細胞（CD4 CD25
8
Cytometry Research 25（2）：7 ∼ 13，2015
Figure 1 nTreg and iTregs contribute equally to the total Treg pool during GVHD.
GFP+ Tregs（CD4+ and CD8+）were sorted from CD45.1+ Foxp3.GFP mice（H-2b）and mixed with GFP− Tconvs（CD4+ and
CD8+）sorted from CD45.2+ Foxp3.GFP mice（H-2b）
. The T cells were combined with T cell‒depleted BM（H-2b）and injected
into irradiated CD45.1/CD45.2 heterozygous B6D2F1 mice（H-2bxd）．Representative FACS plots of splenocytes harvested on
（host cells are also gated out by
day 8 after BMT are shown. The plots are gated on donor-derived Foxp3+ T cells（left plot）
CD45.1/CD45.2 double positivity）
, CD8+Foxp3+ T cells（top plot）and CD4+ Foxp3+T cells（bottom plot）.（文献７より一部改変し
引用）
Figure 2 Interactions among DCs, Tconvs, and Tregs.
IL-2-induced Treg proliferation occurs MHC class II/TCR and costimulatory molecule-dependent manner in the steady state（top）.
Exogenous IL-2 signals can induce Treg proliferation in an MHC class II/TCR-independent manner（bottom）.
9
Selective expansion of Tregs and acute GVHD
Figure 3 CSA permits and rapamycin inhibits IL-2-induced Treg division.
（A）
Schema of TCR and costimulation signaling pathway. CSA inhibits a signaling pathway downstream of PLCγ. Rapa inhibits
mTOR downstream of costimulation signaling pathway.（B）Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester（CFSE）-labeled
FACS-sorted Tregs were co-cultured with syngeneic DCs with IL-2 in the presence of CSA（100 ng/ml）or Rapa（10 ng/ml）.
Representative histograms gated on Tregs treated with or without CSA（100 ng/ml）or Rapa（10 ng/ml）are shown.
AKT: AKT8 virus oncogene cellular homolog, DAG: Diacylglycerol, Erk: Extracellular signal-regulated kinase, IP3 : inositol
trisphosphate, mTOR: Mammalian target of rapamycin, NFAT: Nuclear factor of activated T cells, NF-kB: Nuclear factor κ B,
PI3K: Phosphoinositide 3 kinase, PIP2 : Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate, PIP3 : Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PKCθ:
Protein kinase C-theta
殖には IL-2 シグナル経路のうち AKT-mTOR 経路とは
IL-2 を併用投与した場合，Treg の増殖が誘導され，疾
別経路に存在する STAT5 の活性化が重要であること
患発症に関わる IFN-γや IL-17 産生性 Tconv 細胞数が
12）14）
。従って，Rapa の作用は Treg の
減少する。CSA，IL-2 の単独投与と併用投与した場合
増殖に必要な IL-2 シグナルの阻害によるものではな
の EAE 重症度を未治療群と比較すると，CSA，IL-2
いと考えられる。抗原特異的 TCR を持つ T 細胞を輸
いずれも単独投与で重症度改善効果が得られるのに対
注した野生型マウスに抗原を投与し，CSA と IL-2 の
して，併用投与した場合，その効果に相乗作用が得ら
単独投与または併用投与を行った in vivo の実験でも，
れることが分かっている 15）。
が示されている
CSA と IL-2 の併用は抗原特異的 Tconv の増殖を抑制
しながら Treg を増殖させることが示されている 15）。
Ⅴ．同種造血幹細胞移植での CSA/IL-2 併用療法
一方，Rapa は Treg の増殖を促進しなかったものの，
それでは GVHD に対しても CSA，IL-2 併用療法は
Tconv の細胞数を減らすことで相対的に Treg 比率を
有効であるのであろうか。この解答を見出すために，
増加させた。さらに，
多発性硬化症モデル
（Experimental
MHC 不一致の急性 GVHD モデル（C57/BL6 → BDF1）
autoimmune encephalomyelitis：EAE）に対して CSA と
を用いて，IL-2 と CSA 又は Rapa を併用し各々の単独
10
Cytometry Research 25（2）：7 ∼ 13，2015
療法と GVHD 抑制効果や T 細胞に与える影響を比較
とで GVHD を増悪させた可能性が示唆された。一方，
検討した（Fig. 4A）
。その結果，予想に反して CSA と
Syngeneic 移植（B6 → B6）では，CSA と IL-2 の併用
IL-2 の併用投与は GVHD 抑制に相乗効果が見られな
は IL-2 単独投与と同等の Treg 増殖効果を示したこと
かっただけでなく，GVHD を増悪させたため全てのマ
から，前処置後のリンパ球減少や前処置により惹起さ
ウスが死亡した（Fig. 4B）
。CSA と IL-2 の併用群では，
れる組織障害と炎症等は Treg の増殖抑制には関係し
Treg の増殖は nTreg，iTreg 共に阻害され，T 細胞中
ないことがわかった 16）。
の割合，細胞数共に低下していた（Fig. 5A-F）
。これに
定常状態や自己免疫疾患のような場合，CSA によ
対して，Rapa は過去に報告されていたように IL-2 と
る TCR シグナルの活性化阻害は IL-2 投与によって補
の併用により Treg を増幅させ GVHD 重症度改善に相
完され Treg 増殖は維持される。この時 Tconv の活性化・
乗効果が見られた 16）17）。
増殖は抑制されるため，結果的に強い免疫抑制を誘導
CSA と IL-2 の併用が急性 GVHD を増悪させた要因
できる。しかし，急性 GVHD モデルにおいては Treg
を調べるために，Foxp3-GFP reporter マウスをドナー
の選択的増幅，GVHD の抑制効果は見られなかった
に用いて移植後の nTreg，iTreg の比率や絶対数の解
16）
析を行ったところ，CSA の併用は nTreg，iTreg 共に
のか，非自己抗原であるのかによって Treg 増殖メカ
減少させていることが明らかとなった。CSA，Rapa
ニズムにおける TCR シグナルの重要性に違いがある
共に Treg の Tcov 増殖抑制機能に関しては影響を与え
と考えられる。
。このことから，病原となる抗原が自己抗原である
なかったため，CSA 併用は Treg の増殖を抑制するこ
Figure 4 CSA abolishes while Rapa keeps the beneﬁcial eﬀect of IL-2 ICs in protection against acute GVHD.
（A）
Schema of the experiments. B6 splenocytes and T cell-depleted BM cells were injected into irradiated BDF1 mice. The mice
were treated with either vehicle（PBS）,CSA（25mg/kg）or Rapa（0.5mg/kg）for 5 days（days 0-4）with or without concomitant
IL-2 ICs（1.5μg/mouse）for 3 days（days 0-2）.（B）GVHD score are plotted over days post transplant. Two independent
experiments were combined with a total of n=8 or 10 mice/group. *p<0.05 by ANOVA with Tukey s post hoc test. BMT: Bone
marrow transplantation
11
Selective expansion of Tregs and acute GVHD
Figure 5 CsA suppresses while Rapa promotes pre-existing donor-derived Treg expansion and iTreg generation during GVHD.
GFP −Tconvs （CD4 + and CD8 +） and GFP +CD4 +Tregs were FACS-sorted from CD45.1 +Foxp3 GFP-reporter mice and
, and injected into irradiated
CD45.2+Foxp3 GFP-reporter mice, respectively, combined with T cell-depleted BM cells（CD45.2+）
B6D2F1 mice. Host mice were treated as shown in Figure 3. Eight days after BMT, donor Tregs in the spleen were analyzed
by ﬂow cytometry.（A）The percentage and（B）absolute number of pre-existing donor nTregs,（C）the percentage and（D）
absolute number of CD4+iTregs,（E）the percentage and（F）absolute number of CD8+iTregs are plotted as mean ± SEM of
n=5‒6 mice/group from two independent experiments. *p<0.05; **p<0.001 by two-tailed Student t test compared with the group
treated with IL-2 ICs. （文献 15 より引用）
Ⅵ．おわりに
利益相反
IL-2 投与により Treg 増殖を誘導する場合，病因と
本論文発表内容に関連して特に申告なし。
なっている標的抗原に応じた併用薬剤を選択すること
は，Treg 増幅による免疫抑制効果を最大限得る上で
文献
重要である。しかしながら，同様のことがマイナー
1．Wildin RS, Ramsdell F, Peake J, et al: X-linked neonatal
抗原不一致の同種造血幹細胞移植により生じる急性
diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy
GVHD や，自己免疫疾患に類似する慢性 GVHD の場
syndrome is the human equivalent of mouse scurfy.
合にも当てはまるかは不明である。実際，難治性慢性
Nat Genet 27:18-20, 2001
GVHD に対する IL-2 投与は Treg を増加させて GVHD
18）
2．Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, et al: The immune
，これらの
dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy,
症例のうち約半数がカルシニューリン阻害薬の投与を
X-linked syndrome（IPEX）is caused by mutations of
受けていた。以上のことから同種造血幹細胞移植後の
FOXP3. Nat Genet 27: 20-21, 2001
を軽減させることが報告されているが
Treg 増幅機構には炎症病態，併用薬や MHC の不一致
3．Sakaguchi, S. & Powrie, F. Emerging challenges in
など，様々な要因が複合的に関与して影響を及ぼして
regulatory T cell function and biology. Science 317:
いる可能性が考えられる。今後のさらなる研究により，
627-629, 2007
GVHD を含む様々な疾患ごとの Treg 増殖機構が解明
4．Joffre O, Santolaria T, Calise D, et al: Prevention
され，Treg 選択的増幅による新たな細胞療法が確立
of acute and c hronic allog raft rejection with
されることが期待される。
CD4 +CD25 +Foxp3 + regulatory T lymphocytes. Nat
Med 14: 88-92, 2008
12
Cytometry Research 25（2）：7 ∼ 13，2015
5．Hoffman P, Ermann J, Edinger M, et al: Donor-type
+
+
CD4 CD25 Regulatory T Cells Suppress Lethal Acute
to support regulatory T cell proliferation in vivo. J
Immunol 189: 28-32, 2012
Graft-Versus-Host Disease after Allogeneic Bone
13．Zou T, Satake A, Ojha P, et al: Cellular therapies
Marrow Transplantation. J Exp Med 196: 389-399, 2002
supplement: the role of granulocyte macrophage
6．Josefowicz SZ, Lu LF, Rudensky AY: Regulatory T
colony-stimulating factor and dendritic cells in
cells: mechanisms of differentiation and function.
regulato ry T-cell homeostasis and exp ansion.
Annu Rev Immunol 30: 531-564, 2012
Transfusion 51: 160S-168S, 2011
7．Sawamukai N, Satake A, Schmidt AM, et al: Cell-
14．Burchill, M. A, J. Yang, C. Vogtenhuber, B. R. Blazar et
autonomous role of TGFβ and IL-2 receptors in
al: IL- 2 receptor beta-dependent STAT5 activation is
CD4+ and CD8+ inducible regulatory T-cell generation
required for the development of Foxp3+ regulatory T
during GVHD. Blood 119: 5575-5583, 2012
cells. J. Immunol 178: 280-290, 2007
8．Bhandoola A, Tai X, Eckhaus M, et al: Peripheral
15．Satake A, Schmidt AM, Archambault A, et al:
expression of self-MHC-II influences the reactivity and
Differential targeting of IL-2 and T cell receptor
+
self-tolerance of mature CD4 T cells: evidence from a
signaling pathways selectively expands regulatory
lymphopenic T cell model. Immunity 4: 425-436, 2002
T cells while inhibiting conventional T cells. J
9．Gavin MA, Clarke SR, Negrou E, et al: Homeostasis
and anergy of CD4+CD25+ suppressor T cells in vivo.
Nat Immunol 3: 33– 41, 2002
Autoimmun 44: 13-20, 2013
16．Satake A, Schmidt AM, Nomura S, et al: Inhibition
of calcineurin abrogates while inhibition of mTOR
10．Setoguchi R, Hori S, Takahashi T, et al: Homeostatic
promotes regulatory T cell expansion and graft-
m a i n t e n a n c e o f n a t u r a l Fox p 3 + C D 2 5 + C D 4 +
versus-host disease protection by IL-2 in allogeneic
regulatory T cells by interleukin（IL）-2 and induction
bone marrow transplantation. PLoS One: 9（3）
，2014
of autoimmune disease by IL-2 neutralization. J Exp
Med 201: 723–735, 2005
17．Shin HJ, Baker J, Leveson-Gower DB, et al: Rapamycin
and IL-2 reduce lethal acute graft-versus-host disease
11．Swee LK, Bosco N, Malissen B, et al: Expansion of
associated with increased expansion of donor type
peripheral naturally occurringT regulatory cells by
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Blood 118: 2342-
Fms-like tyrosine kinase 3 ligand treatment. Blood 113:
6277-6287, 2009
12．Zou T, Satake A, Corbo-Rodgers E, et al: IL-2 signals
determine the degree of TCR signaling necessary
50, 2011
18．Koreth J, Matsuoka K, Kim HT, et al: Interleukin-2 and
regulatory T cells in graft-versus-host disease. N Engl
J Med. 365: 2055-66, 2011
13

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