2015/6/29 第一薬科大学 3年生分子生物学 C 転写調節 (p43) 生命薬学講座分子生物学分野担当：荒牧弘範 (H27.6.29) a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 ` 大腸菌をグルコース（ブドウ糖）とラクトース（乳糖）の混合培地で培養すると、グルコースがまず消費され、大腸菌はいったん増殖を停止する。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 ` その後、しばらくすると再び増殖するが、ここではじめてラクトースを消費する。この増殖現象はジオキシーと呼んでいる。 β-gal D-Glucose a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 ` a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（図3・10) （グルコースが存在する場合、ラクトースがない場合）グルコースを消費している間、ラクトースを分解酵素（β—ガラクトシダーゼ、β-gal）の遺伝子(lacZ)の発現は抑制され、 β-gal × グルコースの欠乏とともにlacZが発現・誘導される。 β-gal β-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)の下流にはガラクトシドパーミアーゼ(lacY)、ガラクトシドトランスアセチラーゼ遺伝子(lacA),がある。 β-1,4ガラクシド結合 D-Glucose 1 2015/6/29 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（図3・10) （グルコースが存在する場合、ラクトースがない場合） a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（図3・10) （グルコースが存在する場合、ラクトースがない場合）リプレッサーによる転写の抑制が起っている。 lacZ遺伝子が転写され、Lacリプレッサーが作られる。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（グルコースが存在する場合、ラクトースがない場合） a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（グルコースが存在する場合、ラクトースがない場合）リプレッサーはlacZ遺伝子の上流に存在するオペレーター（21残基からなるパリンドローム配列）に結合しているため、RNAポリメラーゼによるプロモーターからの転写が阻害されている。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（グルコースが消費され、ラクトースがある場合） a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（グルコースが消費され、ラクトースがある場合） ` ` ` わずかに発現しているβ-galにより、ラクトースがインデューサー活性のあるアロラクトースに変換される。このインデューサーはリプレッサーに結合し、リプレッサーのオペレーターへの結合は阻害される。その結果、RNAポリメラーゼによる転写は阻害されなく低レベルの転写が起こる。 2 2015/6/29 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御（グルコースが消費され、ラクトースがある場合） ` ` アロラクトースはラクトースの異性体で、ラクトースのグルコースとガラクトースの結合がβ-1,4結合に対して、 β-1,6結合である。ラクトースの異性化によって生じる。イソプロピルチオガラクトシド（IPTG ）なども誘導物質である。 ①オペロン説と転写因子(p43) ` ` ` ①オペロン説と転写因子(p43) ① ② ③ 遺伝子は発現単位であるオペロンで構成されており、オペロンは１個または複数の遺伝子から成る。オペロンの発現はトランスに働くリプレッサーにより負の制御を受ける。リプレッサーはオペロンの特定部位であるオペレーターに作用する。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` ` このオペロンのプロモーターからの転写は十分でなく、高発現のためには、さらに転写活性化因子（アクチベーター）を必要とする。 1960年代初頭ジャコブとモノーは、大腸菌を用いた遺伝学的解析から、ラクトース代謝系に存在する構造遺伝子群（β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ガラクトシドパーミアーゼ、ガラクトシドトランスアセチラーゼ遺伝子）と、これらの発現を制御する塩基配列部分とを合わせたものが１つの単位であると考え、このような単位をオペロンとよんだ。彼らが提唱したオペロン説は、その後の多くの研究者による検証をへて、現在のような遺伝子構造の基本的概念へと導かれた。このオペロン説では、転写の負の制御は見事に説明された。 ①オペロン説と転写因子(p43) ④ リプレッサーは誘導物質（インデューサー）により不活化されオペロンの発現の抑制が解除される。後に、リプレッサーがタンパク質であり、オペレーターがDNA上の特異的配列であることも判明した。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` 転写活性化因子CRP（cAMP Receptor Protein）は細胞内小分子cAMP存在下で複合体をつくる。 3 2015/6/29 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` 転写活性化因子CRPは細胞内小分子cAMP存在下で複合体をつくり、プロモーター上流に存在するCRP-cAMP結合配列に結合する。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` ` 細胞内cAMP量は培地中にグルコースが存在すると抑えられているが、グルコース欠乏状態では多く存在している。この場合は、CRP-cAMP アクチベーターとRNAポリメラーゼが相互作用してプロモーターからの転写は誘導される。 a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` CRP-the catabolite activator protein (CAP) a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` a. 大腸菌ラクトースオペロンの転写制御 (p45) ` ` このオペロン説では、転写の負の制御は見事に説明された。一方、正の制御の発見は遅れ、ラクトースオペロンなどでcAMP receptor protein (CRP)が発見され、転写の正の制御も広く認められるようになった。 CRP-cAMP結合配列（パリンドローム構造をもつ約24塩基）表 3・3 にcAMPの有無、インデューサーの有無によるラクトースオペロンの転写制御の概要を示す。 ①オペロン説と転写因子 ` このような歴史的背景を基に、転写制御における膨大な数の転写因子による負や正の調節機構が原核・真核生物で知られるようになった。 4 2015/6/29 今日の誕生花アザミ（薊）ｂ. トリプトファンオペロンの転写制御 (p45) ` ` リプレッサーの中には、インデューサーでなくコリプレッサー（抑制補助因子）に結合するものがある。例として、大腸菌のトリプトファンオペロンがあげられる（図3・11）。 ` ` ラクトースオペロンと同様に、リプレッサー・オペレーターの系による転写調節が行われる。ただし、ラクトースオペロンの転写調節と異なり、オペロンの遺伝子発現調節はオペロンを構成する遺伝子による反応でできた最終産物、トリプトファンによる調節。復讐ｂ. トリプトファンオペロンの転写制御 (p45) トリプトファンが存在する場合ｂ. トリプトファンオペロンの転写制御 (p45) トリプトファンが存在しない場合 5 2015/6/29 ポイント ` ` アラビノースオペロン(正の調節) 遺伝子転写調節には転写因子であるリプレッサーやアクチベーターが関わり、それらの因子の活性は環境の変化や刺激に応答している環境変化や刺激に応答するために、遺伝子の転写の制御にはRNAポリメラーゼに加えて様々な転写因子が加わることがあり、正や負の転写制御がなされている。 ` ` ` アラビノースオペロンの発現にはaraCというタンパク質が必要になる。ただし、araCは条件によってはリプレッサーとしてもアクティベーターとしても働く。アラビノースが存在するならaraCはアクティベーターとして働き、アラビノースが存在しないならリプレッサーとして働く。 http://kusuri-jouhou.com/creature2/expression.html アラビノースオペロン(正の調節) araCがリプレッサーとして働くときはaraC二量体がO1 とI1O2に結合し、立体障害によってアラビノースオペロンの発現が抑えられている。アラビノース存在下ではaraCタンパク質二量体にアラビノースが結合する。この複合体はI1O2 ループをほどき、I1,I2 と結合して転写を活性化させる。問1 http://kusuri-jouhou.com/creature2/expression.html 問1 問２ 6 2015/6/29 問２問３問３ ②転写因子の機能ドメイン(p46) ` ` DNA結合ドメイン転写制御ドメイン ` ` 転写因子 • • 転写因子間で共通にみられる構造で、一定の機能を有するドメイン構造を有する一連のタンパク質群はファミリーと呼ばれることもある。転写因子のDNA結合ドメインはX線やNMRでの構造解析がなされている。 – – – – ヘリックス-ターン-ヘリックス Znフィンガーロイシンジッパーヘリックス-ループ-ヘリックスコファクターなどと結合するリガンド結合ドメイン他のタンパク質と相互作用するドメイン a. ヘリックス-ターン-ヘリックス (HTH) 構造 ` ` 大腸菌などの細菌類にみられるリプレッサーやCRPをはじめとする転写のアクチベーターの多くは、2量体として働き、またこれらが認識するDNA配列はパリンドローム構造を有した特異的塩基配列である。 X線解析によってDNA認識に関わるヘリックス-ターンヘリックス(helix-turn-helix; HTH)構造がみつけられた（図3.12）。 7 2015/6/29 a. ヘリックス-ターン-ヘリックス (HTH) 構造 • 2つのαヘリックスが短いβ ターンで結ばれており、C 末端側のαヘリックスが標的となるDNAの塩基配列を認識して、その主溝 (major groove)に入り込み、N末端のαヘリックスは DNAの主溝の外側に斜めに交差してC末端のαヘリックスと相互作用しその安定化に働いていると考えられている。 c. 塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス (bHJH) 構造 ` 動物細胞の筋分化制御因子MyoDや原癌遺伝子 Myc等に共通する構造として、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス(basic helix-loop-helix; bHLH)モチーフが見いだされた (図 3.14)。 b. • ` b-Zip構造はエンハンサー結合転写因子C/EBP、哺乳類の転写因子CREB(cAMP応答性エレメント結合タンパク質 )や癌遺伝子産物Fos, Junなどで同定された。b-Zip構造は２つのサブドメインから成る(図 3.15)。動物細胞の核内に存在するレチノイン酸レセプター転写因子などではタンパク質中の４つのシステイン残基に１個のZnイオンが結合した２つのZnフィンガーからなるDNA結合ドメインがあり (図 3.13)、１つ目のZnフィンガーが特異的塩基配列を認識していると考えられている。レチノイン酸とはビタミンA(レチノール)の誘導体で、生理活性はビタミンAの約50-100倍であり、ビタミンA類の体内での生理活性の本体そのものである。レチノイン酸は米国ではしわ・にきびの治療医薬品として、FDAに認可されており、非常に多くの患者さんに皮膚の若返り薬として使用されているが、日本では認可されていない。 c. 塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス (bHJH) 構造 • • • • d. b-Zip (basic-region leucine zipper)構造 Znフィンガー構造 bHLHは、塩基性アミノ酸に富むα-ヘリックス（H1）とループを隔てたαヘリックス (H2)よりなる。 H2は一方の面に疎水性アミノ酸をもち、２つのHLH分子間で相互作用し、２量体を形成する。２量体は２つの塩基性領域でパリンドローム配列 (CANNTG)に結合する。 bHLHのN末端とC末端には転写活性化ドメインがあると考えられている。 d. b-Zip (basic-region leucine zipper)構造 • • ２量体形成に関わるロイシンジッパーを構成するα-ヘリックス構造と塩基性アミノ酸に富むα-ヘリックス構造から成る。ロイシンジッパー構造はα-ヘリックスの片面にロイシンなどの疎水性アミノ酸が位置して疎水性相互作用により２量体を形成する。 DNA結合活性にはロイシンジッパー構造のN末端側にあるアルギニンやリジン等の塩基性に富むα-ヘリックス領域が関与する。このα-ヘリックスは DNAの主溝にはまる込み特異的DNA配列を認識している。 8