日本語抄訳内容はこちら

Helicobacter pylori は NF B を介して
Sonic Hedgehog を活性化する
―― 3D 培養を用いた新たな研究法 ――
抄　訳
赤澤　祐子（長崎大学消化器内科）
Helicobacter pylori-induced Sonic Hedgehog Expression is Regulated by NF B
Pathway Activation: The Use of a Novel In vitro Model to Study Epithelial
Response to Infection
Michael A. Schumacher,*,1 Rui Feng,* Eitaro Aihara,* Amy C. Engevik,* Marshall H. Montrose,*
Karen M. Ottemann† and Yana Zavros*
*Department
†Department
of Molecular and Cellular Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, OH, USA,
of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz, CA, USA
要　約
背景：Helicobacter pylori（H. pylori ）感染は胃粘膜において速やかに Sonic Hedgehog (Shh) を誘導し、
胃炎を惹起するとされているが、その詳細は知られていない。Shh は転写因子 NFκB のターゲット遺伝子で
あることから、H. pylori が NFκB を介して胃粘膜に Shh を誘導するという仮説を検討した。
対象と方法：H. pylori 感染による Shh リガンドの発現を in vivo において検討するため、Green
florescent protein（GFP）と結合させた Shh（Shh::GFP）を発現するマウスを用いた。また、すべての胃腺
管を含む細胞集合体（オルガノイド）を発育させ、腺管構造をなす 3D 上皮を構築し in vitro における検討を
行った。オルガノイドは胃底腺領域の野生型マウスおよび胃壁細胞特異的 Shh ノックダウンマウス
（PC-ShhKO）胃から作製した。
結果：マウスへの H. pylori 感染 2 日後、マウス胃の壁細胞に Shh::GFP の発現増加が見られた。in vitro
の検討ではオルガノイドには壁細胞、H ＋、K ＋、ATPase を含むすべての主な胃上皮マーカーが発現してお
り、Shh の発現も見られた。培養オルガノイドに H. pylori を感染させたところ、Shh 発現増加を認めた。
オルガノイドにおける Shh 発現は NFκB の阻害によって抑制された。さらに PC-ShhKO マウスから作製した
オルガノイドに H. pylori を感染させたところ Shh の発現は見られなかった。
結論：胃オルガノイドは H. pylori における細胞別の反応を、宿主側の免疫反応抜きで観察できる。この
研究で、Shh が NFκB の活性化を介して壁細胞に発現しすることが判明した。
キーワード：NF-kB、Helicobacter pylori 、胃、Sonic Hedgehog
対象と方法
には 8 ～ 10 週齢のマウスを用いた。胃の摘出後大
内視鏡検査で得られた G27 Helicobacter
彎に沿って切開し、マグネシウムおよびカルシウム
pyloriH. pylori ）を実験に使用した。当菌は CagA
を除いた氷冷リン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で洗
を培養細胞に注入できるものであることが知られて
浄した。次に顕微鏡下に筋層を剥離し 5 mm2 大の
いる。G27 H. pylori を経口的にマウスに投与し、
切片を作製した。エチレンジアミン四酢酸を含む
2 日後にサクリファイスされた。オルガノイド作製
DPBS 中に 4℃で 2 時間ゆっくりと振盪した後、ス
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 20: 19–28
8
H. pylori infection was studied for the remainder of the
Total RNA was isolated from gastric organoids using TRIstudies. While Shh was expressed within the parietal
zol (Life Technologies, Carslbad, CA, USA) according to
cells of uninfected mice, we observed that Shh::GFP was
the manufacturer’s protocol. The High Capacity cDNA
not expressed in every parietal cell (Fig. 1B–E).
Reverse Transcription Kit was used for cDNA synthesis
Compared to the uninfected group, infected stomachs
from 100 ng of RNA following the recommended protocol (Applied Biosystems, Carslbad, CA, USA). PredeHelicobacter
pylori は
NFκpurchased
B を介して for
Sonic
signed real-time
PCR assays
were
theHedgehog を活性化する ― 3D 培養を用いた新たな研究法 ―
following genes (Applied Biosystems, Carslbad, CA,
USA):
Pepsinogen
C (Mm01278038_m1), Somatostatin
-ソルビトールを含む溶液に
クロース、D
2 分間浸し、 A
(Mm00436671_m1), H+,K+-ATPase (Mm01176574),
腺管を他の組織から剥離したのち遠心した。その後、
Gastrin
(Mm00439059), Muc5AC (Mm01276711),
Muc6
(Mm00725185),
Shh (Mm00436528_m1),
Ptch
腺管をマトリゲル（基底膜マトリックス）
溶液中に移
(Mm00970977_m1), and HPRT (Mm00446968_m1).
し、マトリゲル・ポリマーを作製した後、ダルベッコ
PCR amplifications were performed in a total volume of
20
lL containing 209 TaqMan Expression Assay prim改変イーグル培他を含む培養液で培養した。培養液
B
F
ers, 29 TaqMan Universal Master Mix (TaqMan Gene
に含まれた成分の詳細は以下のとおりである：WntExpression Systems; Applied Biosystems, Carslbad, CA,
conditioned
media（ 50％）、R-spondin-conditioned
USA),
and complementary
DNA template. Each PCR
amplification
was
performed
in duplicate
wells in a Stemedia（ 10％）、
［Leu15］
-Gastrin
I（ 10 nmol/L）
npOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) using
C
G
Acetylcysteine（
1 mmol/L）
、FGF10（
100 ng/
the
following conditions:
50 °C for
2 minutes, 95
°C for
10
minutes, 95 °C
for 15 seconds
(denature),
and 60 °C
mL、EGF10（
50 ng/mL）
、Noggin（
100 ng/mL）
、
for 1 minute (anneal/extend) for 40 cycles. Fold change
Y-27632
（培養開始から
。
was
calculated
as (Ct – Ct4 日間のみ、10 nmol/L）
high) = n target, 2ntarget/
2nGAPDH = fold change where, Ct = threshold cycle.
D
H
For experiments testing結　果
Shh induction, results were
expressed as average fold change in gene expression relaJ
マウスにおける胃粘膜
Shh
の発現
tive
to uninjected organoid
group.
HPRT was used as an
internal control. Data were calculated according to Livak
Shh::GFP マウスには、胃底腺領域の壁細胞（H ＋
E
I
and Schmittgen [32].
K ＋）に Shh 発現がみられたが、幽門線領域には発
現は見られなかった。このマウスに
H. pylori を感
Statistical
Analyses
染させたところ、約
2 日後に胃底腺領域の壁細胞に
The
significance of the
results was tested by two-way
ANOVA
using
commercially
available
Shh の発現増加が見られた（
図 1）。software (GraphPad Prism; GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A
p value < 0.05 was considered significant.
培養オルガノド中における Shh 発現
培養されたオルガノドは 4 日目に丸いのう胞状の
Results
形状となり、７日目には注入ができる大きさまで成
H. pylori Induces Shh Ligand Expression within
長した。胃底腺領域から採取されたオルガノイドに
the
Gastric Parietal Cells
は胃底腺、胃表層上皮、ソマトスタチン産生
D 細胞
To
visualize Shh ligand expression in response
to
H.
pylori infection in vivo, we used a mouse model that
などの発現が見られ、幽門線領域から得られたもの
にはガストリン産生 G 細胞などの、幽門線領域に特
異的なマーカーが発現していた（図 2）。マウスにお
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 20: 19–28
図 1． Parietal cell-expressed Shh. (A) Fundic and antral sections were
Figure 1 Parietal cell-expressed Shh. (A) Fundic and antral sections
collected from stomachs of Shh::GFP mice an immunostained
were collected from stomachs of Shh::GFP mice an immunostained
using antibodies specific for GFP (Shh-expressing cells, green),
using antibodies
specific for GFP (Shh-expressing cells, green), H+,K+H+,K+- ATPase (parietal cells, red), and UEAI (surface pit cells,
ATPase (parietal cells, red), and UEAI (surface pit cells, blue). Fundic
blue). Fundic sections collected from stomachs of Shh::GFP
sections collected from stomachs of Shh::GFP mice inoculated with
mice inoculated with (B–E) Brucella broth (controls) or (F–
(B–E) Brucella broth (controls) or (F–I) Helicobacter pylori were immuI) Helicobacter pylori were immunostained using antibodies
nostained using antibodies specific for GFP (Shh-expressing
cells,
specific for GFP (Shh-expressing cells, green), H +,K+-ATPase
green), H+,K+-ATPase (parietal cells, red), and UEAI (surface pit cells,
cells, red),
(surface pitShh::GFP
cells, blue).
,K+blue). (J)(parietal
The number
of and
cellsUEAI
co-expressing
and( J)H+The
of cells co-expressing
Shh::GFP
and H +,K +Data
- ATPase
ATPase number
were quantified
and expressed
as cells/gland.
are
were
quantified
expressed
are
expressed
as the
mean and
SEM where,
*p < as
.05cells/gland.
compared toData
controls,
expressed
as the mean ± SEM where, *p < .05 compared to
n = 6 mice
per group.
controls, n = 6 mice per group.
23
ける結果と同じく、Shh は胃底腺領域の壁細胞だ
いると考えられた。野生型および壁細胞特異的
けに発現していて H. pylori により Shh 発現が増加
ShhKO マウス（PC-ShhKO マウス）からオルガノイド
することが確認された。胃底腺オルガノイドにおけ
を作製した。野生型マウスのオルガノイドには
る H. pylori コロニー形成も確認された（図 3）。
H. pylori による Shh 発現が観察されたが、
PC-ShhKO マウスから作製されたものには Shh 発現
NFκB は H. pylori 感染による Shh 誘導に寄与する
は見られなかった。NFκB 阻害剤を用いたところ
NFκB の活性化により IκB のリン酸化とデグラ
Shh 発現は抑制された（図 4C）。CagA 欠損
デーションが惹起される。胃底腺から得られたオル
H. pylori や E.coli によるオルガノイドへの刺激では
ガノイドに H. pylori を感染させたところ、IκB が減
Shh は発現されなかったことから、この現象は
少したことから（図 4A、B）、NFκB が誘導されて
CagA 陽性 H. pylori に特異的な反応であると考え
9
Shh and Gastric Cell Lineage Markers
B
C
Figure 2 documents an organoid culture system for the
fundic region of the mouse stomach using a modified
protocol based on conditions described by Barker et al.
[15] and optimized by our laboratory [16]. Fundic
A
D
B
C
D
cultured
mouse C
stomachs
or mice
(mucous from
neckeither
cells),control
pepsinogen
(zymogen/chief
expressing
a
parietal
cell-specific
Shh
deletion
(PCcells),
and somatostatin (D cells) (Fig. 2F). In contrast,
KO
Shh
mice).
While
Shh
expression
was
significantly
the expression of gastrin (G cells) was specific to antral
induced
in response
infection
in the
control
organoids,
whereas to
H+H.
,K+pylori
-ATPase
(parietal
cells)
was
organoids
(Fig.
4C),
H.
pylori-induced
expression
specific to fundic organoids
(Fig. 2F). In support ofwas
our
KO
absent
theusing
PC-Shh
-derived mouse
culturesmodel,
(Fig. 4D).
in vivo indata
the Shh::GFP
Shh
expression was not detected in antral gland-derived organoids
when compared Bto the fundic cultures
A
(Fig. 2F). Therefore, due to the lack of antral Shh
expression, regulation of Shh in response to H. pylori
infection was studied in fundic gland-derived organoids.
This expression profile indicated that our fundic organoids expressed the expected cell lineage genes repreC
senting the tissue from which they were derived.
Importantly, the organoid cultures expressed Shh
within the parietal cells that was consistent with the
expression pattern observed in the native tissue.
Fundic Gastric Organoids are Colonized by
H. pylori after Microinjection
E
Figure 3 Helicobacter pylori infection of fundic organoids. (A) Microinjection of H. pylori into fundic organoids. H. pylori appears as a
cloud within the organoid. H&E of organoid sections microinjected
with (B) culture media or (C) H. pylori. Arrows in C show H. pylori
attachment to epithelium of fundic gastric organoids. (D) quantitative
F
cultures of control (con) and H. pylori (HP) infected organoids.
NFjB Signaling Mediates H. pylori-induced Shh
Expression
Schumacher et al.
図 2． Parietal cell-expressed Shh within mouse-derived fundic gastric
Figure
Parietal
cell-expressed
Shh within mouse-derived
fundic gasUsing 2organoids.
the
fundic
organoid
(A) Gastric
glandsculture
grow intomodel
spheroidsdetailed
by day 7 in
in
A organoids. (A) Gastric
tric
glands
grow
into
spheroids
by
day
7 in culFig. 3,culture.
the role
NFjBwere
signaling
as a using
mediator
of
Fundic of
organoids
immunostained
antibodies
ture. Fundic organoids were immunostained using
antibodies specific
H. pylori-induced
wasH +identified.
Inhibispecific for (B)Shh
Shh expression
(green) and (C)
,K +-ATPase (parietal
for (B) Shh (green) and (C) H+,K+-ATPase (parietal cells, red). Merged
tory
IjBa
is
an
inhibitory
protein
that
complexes
with
cells,
red).
Merged
image
is
shown
in
(D).
(E)
Z
stack
of
whole
image is shown in (D). (E) Z stack of whole mount organoid shown in
mount
organoid
shown
inof Dmultiple
demonstrating
the
presence
of
subunits
in presence
the
cytoplasm,
thus
preventing
transDNFjB
demonstrating
the
parietal
cells-expressing
multiple
parietal
cells-expressing
Images(F)
were
collected
at
location
ofwere
NFjB
subunits
to lm
theShh.
nucleus.
Activation
of
Shh.
Images
collected
at 1.5
intervals.
RNA
extracted
1.5
intervals.
(F)
RNA
extracted
from
fundic
organoids
was
mm
NFjB
signaling
from
fundic
organoids pathway
was used toresults
measure in
the phosphorylation
expression of major
usedlineages
to measure
the expression
major gastric
cell6 lineages
gastric
cell
including
mucin 5ACof(Muc5AC),
mucin
allowing
for
proteosome-mediated
degradation
of (Muc6),
IjBa,
+ +
including
mucin
5AC (Muc5AC),
mucin
6(GAST),
(Muc6),Hpepsinogen
,K -ATPase
pepsinogen
(PgC),
somatostatin
(SST),and
gastrin
removing Cthe
inhibitory
effect
allowing
NFjB
su+ +
(PgC),
somatostatin
(SST), gastrin (GAST), H ,K -ATPase
(HK), andCShh
using
RT-PCR.
bunits(HK),
to enter
the nucleus to regulate gene transduction
and Shh using RT-PCR.
(Brown et al., 1993). NFjB activation was confirmed by
B
C
24
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 20: 19–28
To identify the role of NFjB signaling as a mediator of
D pylori-induced Shh expression, 7-day old fundic orH.
ganoids were intraluminally microinjected with
2 9 105 bacteria/organoid using a Drummond Nanoject
II nanoliter injector (Fig. 3A). Figure 3A shows the
organoid prior to injection with the needle inserted.
The bacteria appeared as a hazy area within the organoid upon injection (Fig. 3A, arrow). Colonization was
documented by histologic evaluation using H&E staining. Bacteria appeared on the epithelium within the
NFjB Mediates H. pylori-induced Sonic Hedgehog Expression
lumen of infected organoids (Fig. 3C) compared to the
pylori-induced
NFκB
activation
andand
ShhShh
expression.
図 4．4Helicobacter
Figure
Helicobacter
pylori-induced
NFjB
activation
expresuninfected
organoids
(Fig. 3B).
Time
lapse
microscopy
(A)
NFκB
status
was
measured
using
protein
lysates
extracted
sion.
(A)
NFjB
status
was
measured
using
protein
lysates
extracted
Western
blot for infected
IjBa demonstrating
a reduction at
using from
organoids
with fluorescently-labeled
organoids
with H. pylori
2, 4,24and
24
from organoids
infected infected
with H. pylori
for 0, 2,for4, 0,and
2
postinfection
(Fig.IKKa,
4A,B).
Asthe
IjBa
is a hours.
target
H.hours
pylori
documented
colonization
of
organoid
epihours.
Changes
in
IκBa,
and
GAPDH
expression
were
Changes in IjBa, IKKa, and GAPDH expression were
measured
by
gene
ofblot.
canonical
NFjB
signaling,
re-expression
of
IjBa
thelium
by Quantification
motile
bacteria
(Video
S1).
Quantitative
culby Western
Quantification
of Changes
in IκBa
Westernmeasured
ofblot.
Changes
in IjBa relative
to GAPDH
is
at
4 hours
postinjection
further
indicates
pathway
tures
further
colonization
of NFjB
the
organoids
relative
to confirmed
GAPDH
is shown
in mean
B.
Data+ SEM,
are
expressed
shown
in
B. Data
are
expressed
as the
where
*pas< the
.05
+(Fig.
SEM,
where n*ppostinjection
<3 .05
compared
to time
0 hours,
n=
activation
data
show
that
H.Collecpylori
by H.mean
pylori
240 4A,B).
hours
(Fig.
3D).
compared
to time
hours,
=The
individual
organoid
cultures.
OrgaKO
3
individual
organoid
cultures.
Organoids
were
derived
from
noids
were
derived
from
the
fundus
of
(C)
control
or
(D)
PC-Shh
infection
activation
NFjBorganoids
signaling microinpathway
tively, weinduced
show that
fundic of
gastric
KO
the
fundus
of
(C)
control
or
(D)
PC-Shh
mice.
Organoids
mice.
Organoids
were
treated
with
vehicle
(veh),
NFjB
inhibitor
alone
in
the fundic
jected
with H.gastric
pylori organoid
maintaincultures.
motility postinjection and
with
vehicle (veh),
NFκB inhibitor
alone
(INH)
(INH) orwere
NFjBtreated
inhibitor
pretreatment
followed
by H. pylori
infection
To identify
the role
of
NFjB
signaling
as aside
mediator
adhere
to the
epithelial
cells
on
the luminal
at the
or and
NFκB
pretreatment
followed
by H. pylori
infection
(HP+INH),
H. inhibitor
pylori infection
alone (HP).
Shh and
Ptch expression
of
Shh expression, organoids were
timeH.ofpylori-induced
analysis.
was analyzed
by qRT-PCR
24 hours
postinfection.
*p < .05
(HP+INH),
and H. pylori
infection
alone (HP).
Shh compared
and Ptch
cultured
from
control
mouse
or mice
to
veh group,
n = 6either
individual
wells
group. 24stomachs
expression
was
analyzed
by per
qRT-PCR
hours postinfection.
expressing
a
parietal
cell-specific
Shh
deletion
*p < .05 compared to veh group, n = 6 individual wells(PCper
ShhKOgroup.
mice). While Shh expression was significantly
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 20: 19–28
induced in response to H. pylori infection in the control
25
organoids (Fig. 4C), H. pylori-induced expression was
KO
absent in the PC-Shh -derived cultures (Fig. 4D).
胃癌細胞株において知られている。今回の検討で
も、野生型マウスから作製したオルガノイドのみに
A
B
H. pylori による Ptch 上昇が見られた（図 4D）。
図 3． Helicobacter pylori infection of fundic
organoids. H. pylori appears as a cloud
within the organoid. H&E of organoid
sections microinjected with culture media.
考　察
C
Shh は胃上皮の分化と維持に関わる因子であり、
H. pylori 感染時には胃の免疫応答と胃上皮傷害に
D
られた。
Hedgehog signaling target genes patched（Ptch）
もまた、H. pylori 感染にて発現が上昇することが
寄与する。活性化された Shh はマクロファージを誘
導し、胃炎を惹起することが報告されている。今
回我々は、胃底腺特異的なオルガノイドを用いて、
D
Figure 3 Helicobacter pylori infection of fundic organoids. (A) Microinjection of H. pylori into fundic organoids. H. pylori appears as a
cloud within the organoid. H&E of organoid sections microinjected
with (B) culture media or (C) H. pylori. Arrows in C show H. pylori
attachment to epithelium of fundic gastric organoids. (D) quantitative
10
Helicobacter pylori は NFκ B を介して Sonic Hedgehog を活性化する ― 3D 培養を用いた新たな研究法 ―
H. pylori による壁細胞への Shh 発現の詳細とその
CagA は H. pylori の病原性発揮に重要な因子で
機序を証明した。これまで in vivo における検討や、
あり、今回の検討でも Shh の発現に CagA が必須で
不死化胃培養細胞において H. pylori 感染により
あることが証明された。オルガノイドを用いた当研
NFκB が発現することは知られていた。また、
究により、胃癌細胞を用いては不可能であった胃の
NFκB が Shh のプロモーターに直接結合し、活性化
分化した腺管における特定の蛋白や遺伝子発現を
されることは胃癌細胞株では知られていた。しかし、
検討することができた。また、H. pylori 感染時に
胃上皮内の特定の細胞種における観察はこれまで
見られる免疫細胞応答の影響を除いた胃上皮の変
検討が難しかった。
化を観察することを可能にした。
当研究のハイライトは、培養液に工夫を加えた新
ルガノイドの作製は今回初報告である。今回用いられ
たな 3D 培養法の開発である。胃上皮オルガノイドは
た幽門線領域や胃底腺領域が個別に再現できるオルガ
以前も報告されていたが、これまでのものは腺窩部領
ノイドを用いることで、Helicobacter pylori による
域への細胞へと分化する傾向にあった。筆者らによれ
胃上皮内での変化を、より細胞特異的に、より自然に
ば胃底腺、D 細胞、壁細胞などすべての細胞を含むオ
近い状態で観察できるようになることが期待される。
11

Download Report