スフェロイドからの RNA 抽出

Application Note No. 13
スフェロイドからの RNA 抽出
目的
NanoCulture Dish で 3 次元培養して形成されたスフェロイドからトータル RNA を抽出する方法を紹介しま
す。
試薬材料
1. 細胞

HT-29（ヒト大腸がん細胞株）
: ATCC® HTB-38™
培地
: McCoy's 5a supplemented 10%FBS and antibiotics
2. 試薬

(FBS は非働化してください)

QIAshredder
: QIAGEN Cat# 79654 又は 79656

RNeasy Plus Mini Kit
: QIAGEN Cat# 74134 又は 74136
3. 材料

NanoCulture Dish MH pattern, 低接着, 35 mm
: SCIVAX LS Cat# NCD-LH35
実験例
【3 次元培養】
① NCD に培地（2 mL/dish）を加える。
② ピペッティングにて気泡を除去する。
③ 安全キャビネット内又は CO2 インキュベータ内で 15 – 20 分間静置する（ボトムのマイクロパター
ン内に発生したマイクロバブルの除去のため）
。
④ このディッシュから培地（1 mL/dish）を抜き取る。
⑤ 細胞懸濁液を調製する (密度：1x105 cells/mL)。
⑥ 細胞懸濁液を NCP に播種する (2x105 cells/2 mL/dish)。

トータル培養液量は 3 mL/dish となります。

ピペットチップでボトムに傷を付けないように注意してください。その部分だけ単層
培養になるなど培養状態に影響する可能性があります。
⑦ 播種した細胞が沈んでボトムに接着するまで 20 – 30 分間、安全キャビネット内で静置する。
⑧ ディッシュ付属のインサートをセットする。
⑨ 5%CO2, 37℃で任意の期間インキュベートし、スフェロイドの形成を確認する。
SCIVAX Life Sciences, Inc., Kawasaki, Kanagawa, Japan, http://www.scivaxls.com
SCIVAX USA Inc., Woburn, MA, USA, http://www.scivaxls.com/EN
1
【トータル RNA 抽出】
⑩ ディッシュ内の細胞をピペッティングでチューブに回収する。
⑪ 培地（1 mL）で洗い込み、計 4 mL の細胞懸濁液を得る。
⑫ 4℃、300 xg で 5 分間遠心後、上清を除去して細胞ペレットを得る。
⑬ RNeasy Plus Mini Kit を用いて total RNA を抽出する。

細胞ペレットに Buffer RLT Plus（β-ME 添加済み）を加えて可溶化する。

QIAshredder でスピンダウンしてライセートを調製する。

QIAGEN 社のプロトコールに従い RNA を精製する。
⑭ 抽出した RNA は次の濃度測定及び品質評価を行い、ディッシュあたりの RNA 回収量を求める

RNA 濃度

A260/A280 値

rRNA 比（28S/18S）
結果例
【各種容器による回収トータル RNA 量の目安】
35 mm dish
24-well plate
96-well plate
384-well plate
200,000
60,000
10,000
3,000
cells/dish
cells/well
cells/well
cells/well
トータル RNA 回収量
2–6
0.6 – 1.8
0.1 – 0.3
0.03 – 0.1
（一週間培養後の目安）
µg/dish
µg/well
µg/well
µg/well
標準播種細胞数
SCIVAX Life Sciences, Inc., Kawasaki, Kanagawa, Japan, http://www.scivaxls.com
SCIVAX USA Inc., Woburn, MA, USA, http://www.scivaxls.com/EN
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