スローフードとその網羅的分析法 スロ フ ドとその網羅的分析法 (slow food) ジーエルサイエンス（株） ジ エルサイエンス（株） 宮川 浩美 スローフードを攻めの農業の一つに ～フレーバー（広義では香りと味）と機能～ フレ バ （広義では香りと味）と機能 TCA回路 生体 グルコバニリン 糖 糖―脂質 アミノ酸 3MH-S-cys 3MH S l t 3MH-S-glut 前駆体 3-MH(ﾒﾙｶﾌﾟﾄﾍｷｻﾉｰﾙ) 香り 酵素 唾液 味、舌ざわり 糖 アミノ酸 官能試験 脂質 難揮発性物質 極性物質 難揮発性物質、極性物質 GC-O, HS, P&T, TD-GC/MS 分析法は十分ではないかもしれ ないが進化をたどっている 網羅的分析法 GC/MS LC/MS, GC/MS, LC/MS SFC/MS 小林 弘憲, 生物工学89(12), 728-731(2011) 2 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～進展～ 進展 メトキシ化とTMS化をうけた代謝物の保持指標とマススペクトルが収録されたライ ブラリーと、そのライブラリーを使用してピーク同定を自動で行うことができ多変量 解析までをサポ トしているソフトウ アAI t tがフリ で公開された 解析までをサポートしているソフトウェアAIoutputがフリーで公開された （http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/AIoutput/index.） NISTの質量スペクトルデータベースにおいてメトキシ化とTMS化された成分の収 NISTの質量スペクトルデ タベ スにおいてメトキシ化とTMS化された成分の収 録数が増加、研究者がマススペクトルを共有することを目的としたデータベース MassBank（http://www.massbank.jp/）に基礎代謝、二次代謝物質の登録数が 増えている 3 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～進展～ 進展 AIoutputの機能 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～親水性化合物の抽出方法～ 親水性化合物の抽出方法 水/メタノール/クロロホルムの溶媒で抽出後、分層させ、水層をとる 抽出方法 試料 水/メタノール/クロロホルム（5/2/2, v/v/v）の混合溶媒を1000 µL入れる 振とうする 遠心分離する 上澄みを新しいマイクロチューブに800 µL入れる 超純水を400 µL入れる 遠心分離する 水層を新しいマイクロチューブに800 µL入れる ※サンプルによりマイクロチューブにとる水層の量を検討する 5 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～親水性化合物の誘導体化法～ 親水性化合物の誘導体化法 メタボローム分析での誘導体化法はメトキシ化とTMS化の二段で誘導体化する 誘導体化方法 試料 濃縮遠心機で溶媒をとばす 凍結乾燥機で水をとばす System: GC-MS Column: InertCap 5MS/NP 0.25 mm I.D. × 30 m df = 0.25 µm Inj. Temp.: 230ºC Column Temp.: 80ºC(2 min) - 15ºC/min - 330ºC(10 min) Inj.: Split 25:1 Carrier Gas: He Column inlet Pressure: 75 kPa, Constant Pressure Septum Purge: 5.0 mL/min Inj. Vol.: 1 L Ion Source Temp.: 200ºC Interface f Temp.: 250ºC ºC Scan Range: m/z = 85 - 500 Scan Speed: 5000 u/s ＜メトキシ化＞ 20 mg/mL メトキシアミン塩酸塩(ピリジン溶液)を100 µL入れる 振とうする(30 ºC, 90 min) ＜TMS化＞ MSTFAを50 µL入れる 振とうする(37 ºC, 30 min) 誘導体化物 6 3.0 2.0 1.0 6.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 7.0 8.0 9.0 10.0 http://www.gls.co.jp/technique/gc_technical_note/084.pdf 11.0 12.0 Isocitric acid + Citric acid 17.5 Arabito ol Ribito ol(I.S.) 15.0 Glutamic acid_3TMS Phenylalanine e_2TMS 4-Aminobutyrric acid 12.5 Errythritol Asp partic acid_3TMS Pyroglutamic acid_2TMS Unknown_Am mine like Threonine_3TM MS 10.0 Serine_3TMS + Alanine_3TMS MS + Isoleucine_2T TMS Threonine_2TM Proline_2TMS d(or anhydride) + Glycine_3TMS Succinic acid Pho osphate + Glycerol 9.0 Serine_2TMS Leucine_2TMS Valine_2TMS 7.5 20.0 (x100,000) TIC ＞＞ ＞ 0.0 5.0 Isoleucine_1TMS 5.0 Leucine_1TMS Lactic acid GCによる代謝物の網羅的分析法 ～味噌の分析～ 味噌の分析 (x1,000,000) TIC 3 0 3.0 2.0 1.0 0.0 22.5 25.0 27.5 糖の含有量が多すぎる 味覚は選択的・対数 フェヒナーの法則から刺激の量 Rと感覚量（人の情動反応)Eは 対数の関係にある） 代謝物の存在比 カラムと質量分析計の ダイナミックレンジを超 えている GCによる代謝物の網羅的分析法 ～糖の含有量が多いサンプルの問題～ 糖の含有量が多いサンプルの問題 Split 25:1 (x10,000,000) 2.0 TIC 20,21 1.5 48 13 4 31,32 33,34,35 25 1.0 17,18 9 27 40 7 00 0.0 5.0 56 8 6.0 11 10 12 16 7.0 19 29 30 22 24 26 28 23 8.0 57 49 38 39 38,39 0.5 23 (a) Silylation 52 37 14,15 1 68 51 53 54 9.0 45 46 47 43 44 42 36 10.0 56 50 55 41(I.S.) 11.0 12.0 59 61 58 63 60 13.0 14.0 15.0 16.0 67 65 17.0 18.0 19.0 Splitless (x10,000,000) TIC 7(I.S.) (b) Alk Alkylation lation 22 9 1.0 25 5 8 0.5 19 14,15 70 7.0 29 16,17 23 10,11 12 18 20 6 80 8.0 27 12 13 12,13 3,4 0.0 60 6.0 66 64 62 90 9.0 10 0 10.0 11 0 11.0 12 0 12.0 Chromatogram of YPD medium extract (a) Silylation(YPDx10), (b) Alkylation 21 26 24 13 0 13.0 14 0 14.0 15 0 15.0 16 0 16.0 30 28 17 0 17.0 18 0 18.0 19 0 19.0 20 0 20.0 20.0 Peak No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Compound_Name Lactic acid Glycolic acid Valine_1TMS_minor Alanine_2TMS Glysine 2TMS Glysine_2TMS Oxalate Leucine_1TMS Isoleucine_1TMS_minor Valine_2TMS_major Urea Serine_2TMS_minor 2-Aminoethanol Leucine_2TMS Phosphate Glycerol Nicotinic acid Threonine_2TMS_minor Isoleucine_2TMS_major Proline_2TMS Succinic acid Glycine_3TMS Glyceric acid Uracil Fumaric acid Serine_3TMS_major j Alanine_3TMS Threonine_3TMS_major Thymine Nicotinamide Malic acid Methionine_2TMS Aspartic acid_3TMS Hydroxyproline Pyroglutamic acid_2TMS 4-Aminobutyric acid Alanylalanine_1 Glutamic acid_3TMS Pipecolic acid Phenylalanine_2TMS Asparagine_3TMS Ribitol Putrescine Unknown_Sugar phosphate like O-Phosphoethanolamine Hypoxanthine Isocitric acid+Citric acid Methionine sulfoxide_3 Unknown_Sugar like Unknown_Sugar like Unknown_Sugar like Glucose_1 Histidine_3TMS Lysine_4TMS Glucose_2 Tyrosine Unkno n S gar like Unknown_Sugar Unknown_Sugar like Xanthine Unknown_Sugar like Hydroxylysine Inositol Guanine Tryptophan_3TMS Uridine_4TMS Inosine Adenosine Guanosine Trehalose YPDx10 518824 51317 53334 6706955 120963 18101 1103892 412653 3405867 14051 285173 135719 6399242 3087965 1517174 14259 205723 3684799 1178710 1797248 5774669 34889 58267 10052 2678944 395854 966860 5731 12505 84129 768443 2639898 602867 4709554 118854 32059 4225437 10510 2582509 808317 593550 54049 104332 7066 57468 188414 41274 271013 2206257 2170044 x100 54462 5931 3976 371662 2762 0 96607 47352 246126 8606 27062 10634 378300 153597 128388 0 13903 181892 54594 140060 371868 2124 3602 0 125772 38634 48052 0 0 6360 32607 115247 44436 245554 4956 1073 199341 0 130493 32686 348153 3378 0 0 2411 7584 2283 0 317470 2E+06 172098 x1000 29115 2851 0 37650 0 0 11176 5909 26297 8359 3304 1807 36815 15747 23204 0 1934 17780 4207 14477 39044 0 0 0 11657 3288 4930 0 0 0 0 11418 0 23010 0 0 17222 0 12432 3175 377691 0 0 0 0 786 0 0 24500 111170 12757 29423 1641 0 563066 439693 46325 1187001 67517 45364 243659 119053 5737797 0 23565 1831 34944 0 0 5971 2681 327344 0 0 0 2183 0 0 0 0 28105 (a) Silylation No Hit S/N <3 3< S/N <10 S/N >10 Overloaded (b) Alkylation Peak No. Compound_Name 1 Succinic acid 2 Lactic acid 3 Glycine 4 Malic acid_1 5 Alanine 6 Nicotinic acid 7 Adipic acid 8 Valine 9 Leucine 10 Serine_1 11 4-Aminobutyric y acid 12 Isoleucine 13 Threonine 14 Pyroglutamic acid 15 Malic acid_2 16 Asparagine 17 Proline 18 Citric acid_1 19 Aspartic acid 20 Citric acid acid_2 2 21 Serine_2 22 Glutamic acid 23 Methionine 24 Citric acid_3 25 Phenylalanine 26 Ornitine 27 Lysine 28 Histidine 29 Tyrosine 30 Tryptophan 結果 微量のアミノ酸を測定しようとすると、糖 のピークはサチュレーションをおこしてしま う。 メトキシ化とTMS化の結果とア キ 化 メトキシ化とTMS化の結果とアルキル化 の結果を組み合わせることが有効。 今後の課題 メトキシ化とTMS化のライブラリーだけで はなく、選択的に誘導体化するアルキル 化や、エステル化とアシル化を組み合わせ たライブラリ たライブラリーの充実が今後の課題となる 充実が今後 課題となる 。また、どのようにデータを解析するシステ ムをつくるか、前処理の煩雑さを軽減でき るかも課題となる。 Identificated peaks from YPD medium extract (a) Silylation, Silylation (b) Alkylation 宮川 浩美 他, 第66回日本生物工学会大会, 3P-049(2014) 9 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～アルキル化～ アルキル化 誘導体化後、有機層をとる 試料 1 M 水酸化ナトリウム溶液を200 µL入れる メタノールを167 µL、ピリジンを34 µL入れる MCFを20 µL入れる 振とうする MCFを20 µL入れる 振とうする System: GC-MS Column: InertCap 5MS/NP 0.25 mm I.D. × 30 m df = 0.25 µm Inj.j Temp.: p 230ºC Column Temp.: 40ºC(2 min) - 15ºC/min - 280ºC(7 min) Inj.: Splitless Carrier Gas: He Column inlet Pressure: 75 kPa, Constant Pressure Septum Purge: 5.0 mL/min Inj. Vol.: 1 L Ion Source Temp.: 200ºC Interface Temp.: 250ºC Scan Range: m/z = 35 - 500 Scan Speed: 5000 u/s クロロホルムを400 µL入れる 振とうする 50 mM 炭酸水素ナトリウム溶液を400 µL入れる 振とうする Na2SO4を入れる 誘導体化物 10 容器の課題～容器からの溶出物～ ほとんどのマイクロチューブの素材はポリプロピレン あり、 素系溶媒 対 耐性 な であり、塩素系溶媒に対しての耐性がない Chloroform 1mL Vortex 30s (x100,000) 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 30 min Conventional micro tube A Conventional micro tube B Developing micro tube Column: InertCap 5MS/NP 0.25mm x 30m, df=0.25um Inj. Temp.: 230ºC Column Temp.: 40ºC(2 min) - 15ºC/min - 280ºC(7 min) Inj.: Splitless Carrier Gas: He Column inlet Pressure: 75 kPa, Constant Pressure Septum Purge: 5.0 mL/min Inj. Vol.: 1 L Ion Source Temp.: 200ºC Interface Temp.: 250ºC Scan Range: m/z = 38 - 500 Scan Speed: 5000 u/s 2.0 1.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 容器の課題～マイクロチューブの観察～ 光学顕微鏡 観察部位 析出物 内面のキズ 12 食品の保存（熟成）と試薬の安定性 ～グルタミン酸、グルタミンを例に～ グルタミン酸 グルタミンを例に 自発的に環化 Glutamic acid 食品中での変化 酵素 Pyroglutamic acid 自発的に環化 日本うま味調味料協会HPより 25 2.5 Glutamine 2 グルタミンは 固体では安定 水溶液中では不安定性 液 安 1.5 1 Pyroglutamicacid_2TMS 0.5 Glutamic acid_3TMS 0 Glutamine 3TMS Glutamine_3TMS 0 5 10 15 20 25 誘導体化(TMS化)してから測定までの時間(h) 13 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～ライブラリーの充実～ ライブラリ の充実 AIoutputで使用するInertCapのライブラリーにあげている化合物について、保持 p p 情報とマススペクトルの他に以下の補足情報を追加することを現在進めています。 • TMSの数 ex. 2TMS, 3TMS • 立体異性 E, Z InertCap 5MS/NP 0.25 mm x 30 m, df=0.25 um • 分解・変性 ex. Oxaloacetic O l ti acidは常温では脱炭酸され、Pyruvic idは常温では脱炭酸され P i acidになる。 idになる N-Formyl glycineは3本のピークとして検出され、 内1本はGlycineの3TMS 体として検出される。 グルタミン グルタミン酸は 部がピログルタミン酸になって検出される グルタミン、グルタミン酸は一部がピログルタミン酸になって検出される。 • その他 ex 核酸塩基はカラムが劣化するとテ ex. 核酸塩基はカラムが劣化するとテーリングしやすい リングしやすい。 5-OxoplolineとPyroglutamic acidは同じ化合物。 14 GCによる代謝物の網羅的分析法 ～まとめ～ まとめ • GC代謝物分析の進展 大阪大学大学院福崎先生、馬場先生等のグループが高価な装置を必要としない で誰もが使用できる系をたちあげた ライブラリーとAIoutputがフリーで公開された、データベースが充実してきている • 糖が多いサンプルの課題 糖に埋まってしまうピーク 味覚は選択的で対数であるのに対し カラムと質量分析計のダイナミ クレンジ 味覚は選択的で対数であるのに対し、カラムと質量分析計のダイナミックレンジ は狭い →アルキル化とTMS化 • 容器の問題 →内面処理したものを近日リリース • 標準試薬の安定性 →試験中 • AIoutputで使用するInertCapのライブラリーにあげている化合物について補足 情報の追加することを進めています 15 謝辞 大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学専攻 福崎 英一郎 英 郎 先生、馬場 生 健史 先生 生 （独）理化学研究所 CSRS 津川 裕司 先生 ジーエルサイエンス（株） ジ ルサイ ン （株） 技術開発部 古野 正浩 様、本川 正規 様 16
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