資料１－４ライフサイエンス委員会幹細胞・再生医学戦略作業部会平成27年7月15日 iPS細胞を利用した疾患克服及び創薬研究の加速～バンクの役割～国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターセンター長小幡裕一目次 1. 理研BRCのiPS細胞バンクの現状 2. 利用促進のための付随情報及び発信 3. 疾患iPS細胞バンクに求められる品質管理 4. 品質検査のための分化確認用マーカー発現iPS細胞 5. バンクの機能拡充による将来像（参考）幹細胞・再生医学戦略作業部会委員からのご意見について（参考）iPS細胞分化検査：分化誘導・確認方法の例 1 1. 理研BRCのiPS細胞バンクの現状 2015.6.30.時点の収集状況疾患数試料提供者数株数指定難病（306疾患） 61 195 671 指定難病ではないが重要な疾患 29 53 134 - 39 132 コントロール健常人指定難病306疾患のうち、 61疾患のiPS細胞を収集済。【参考】「疾患特異的iPS細胞を活用した難病研究」における整備目標疾患数：200疾患以上既に寄託されている疾患特異的iPS細胞の例指定難病：パーキンソン病、ライソゾーム病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、筋ジストロフィー、心筋症、原発性免疫不全症候群等指定難病ではないが重要な疾患：統合失調症、アルツハイマー病、QT延長症候群等課題：研究開発（スクリーニングを含む）に求められる種類・量・質の整備強化対象疾患の種類と患者数・株数ニーズを把握し、応えるため、利用者コミュニティ、医療機関、iPS細胞作製機関の協力年齢と性別をマッチングさせた、コントロール健常者iPS細胞の整備が必要分化細胞を大量培養し、安定供給が必要品質検査と付随情報 iPS細胞必須検査の加速 iPS細胞分化検査（分化能確認、分化細胞の機能確認等）が必要診療情報、全ゲノム配列情報等、より高度な付随情報が必要 2 2. 利用促進のための付随情報及び発信細胞特性情報現状：寄託者情報：元細胞の種類、樹立法、維持培養法、論文情報等品質検査情報：汚染検査、誤認検査ニーズ：核型検査、未分化マーカー検査目的細胞への分化能確認、分化細胞の機能確認細胞提供者（患者）の診療情報現状：疾患名・年齢・性別ニーズ：問診内容：家族歴・既往歴等病歴：診断年齢、診断からの経過・治療歴等検査結果：血液検査、画像検査、内視鏡検査、心電図検査病理組織学的検査、遺伝子検査等全ゲノム配列情報利用者への情報発信･技術移転課題ニーズの把握試料提供機関の協力利用者への情報開示方法匿名化済しかし、希少疾患においては、情報の付加により試料提供者が特定されることがないように、配慮が必要利用者への情報開示の方針の策定情報管理体制の構築と実施現状： iPS細胞培養に関する基本的技術：凍結融解法の研修を実施中ビデオプロトコール（動画）公開中ニーズ：分化誘導法等に関する情報発信および研修 3 3. 疾患iPS細胞バンクに求められる品質管理 iPS細胞必須検査誤認検査マイコプラズマ、真菌、細菌汚染の検査 Short Tandem Repeat PCR 遺伝子多型解析による細胞誤認（他の細胞の取り違え、混入）検査未分化性染色体異常の検査各種未分化マーカーを用いて検査 iPS細胞分化検査：方法の“標準化”が必要、確立されればそれに沿って実施分化能確認目的とする細胞に分化できるかを、分化誘導実験＊にて確認分化マーカー発現iPS細胞を用いて確認＊寄託者情報、発表された論文情報等に基づき、至適条件を設定し、実施分化細胞の機能確認分化誘導した細胞が、報告されている機能を有するか検査コントロールとして健常人由来iPS細胞から誘導した分化細胞が必要全ゲノム配列情報要拡充核型検査既存細胞材料基本品質検査汚染検査患者間で異なる病態や治療反応性等に関与する遺伝子要因の研究に必須 4 4. 品質検査のための分化確認用マーカー発現iPS細胞 iPS細胞を用いた疾患研究・創薬を実施するために、目的とする組織、細胞への分化の確認が必要分化誘導の可否を簡便に判定できる分子マーカーが必要分化確認用「組織特異的プロモーター」と蛍光タンパク質の融合遺伝子をiPS細胞に導入し、分化誘導後、蛍光タンパク質の発現を観察することで確認準備状況目的とする細胞（例） (1) 導入用の遺伝子材料 300のヒト「組織特異的プロモーター」を整備済蛍光タンパク質遺伝子も多数整備 (2) 遺伝子導入技術・ツール遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを整備済取扱い技術も保有 (3) 細胞の分化確認技術 ES細胞において、神経、上皮、血液細胞等への分化誘導実験に実績 LTR Ψ 特異的プロモーター GFP等蛍光タンパク質 pA 運動神経細胞（モーターニューロン） MAP2 骨格筋細胞 MyoD1 MCK 心筋細胞 Myosin light chain 2 Nppa, α MHC, Ryr2 インシュリン産生細胞（膵ラ氏島β細胞） INS NGN3, PDX1 ネフロン構成細胞（中胚葉＋内胚葉） Osr1 肺 T (brachyury homolog) LTR マーカー発現レンチウイルスベクターの例遺伝子 5 5. バンクの機能拡充による将来像創薬スクリーニング用iPS細胞バンクを大幅拡充疾患特異的iPS細胞整備方針：・難病を中心に、分化誘導した疾患細胞において病態が観察可能と想定される疾患・200 疾患以上・各疾患 10 患者以上・患者数が多く、疾患原因も多岐にわたることが判明している疾患（筋委縮性側索硬化症や統合失調症等）は 100 患者規模・ 3 株/患者疾患数200種類以上、患者5,000人に由来する、15,000株のiPS細胞を整備健常者iPS細胞：コントロール細胞整備方針：・各年代及び性別を考慮して整備・20, 30, 40, 50, 60歳台の男女別に、各10人・既存の健常人コホート等と連携 100人由来、300株の健常者iPS細胞を整備ゲノム編集技術の活用・原因遺伝子が特定されている疾患について、健常者iPS細胞とゲノム編集技術との組合せにより、人工的に疾患特異的iPS細胞を創出 iPS細胞の分化能検査を新規に導入 ⇒ 品質管理の質の向上 ⇒ 分化誘導した分化細胞を大量培養、バンク化アカデミア：病態解明研究、診断・治療・予防法の開発企業など：創薬研究、創薬スクリーニング（毒性評価、薬効・薬理評価）など 6 以下、参考 7 幹細胞・再生医学戦略作業部会委員からのご意見についてもっとも効率的に目的細胞に分化するのか分らず、使い勝手が悪いので、ノウハウの付加が必要ではないか iPS細胞株ごとに培養プロトコール、個別のTipsなどの情報が付与された状態で頒布すべきではないか論文情報を整理・公開するとともに、分化検査を行い、その情報やノウハウ（培養プロトコール等）を付加して提供（3、4ページ参照）技術移転のための研修を実施しているが、拡充が必要コントロールとなるiPS細胞の充実が必要ではないか病因解明研究や創薬研究のためには、年齢と性別をマッチングした健常者由来コントロールiPS細胞の整備が必要（6ページ参照）理研BRCでは健常者のiPS細胞を整備しているが、不十分（2ページ参照）企業がサインするだけで利用できるようなiPS細胞バンクにできないか利用を促進するように、寄託者（寄託機関）には寛大な条件をお願いしている理研BRCからの提供条件は、国の法令・指針、試料提供者へのインフォームド・コンセントの内容及び寄託機関の寄託条件に拘束されている 8 iPS細胞分化検査：分化誘導・確認方法の例目的とする細胞例対象疾患例文献：分化誘導法と同定法、機能確認運動神経細胞（モーターニューロン）筋萎縮性側索硬化症球脊髄性筋委縮症原発性側索硬化症 Egawa N & Inoue H et al. Sci Transl Med (2012) SB431542の存在下にて SFEBq 法で初期分化誘導。その後、 B27, Retinoic Acid, Sonic Hedgehog, FGF-2存在下で培養して得た細胞集団をマトリゲル上に移し、 neurotrophic factors, NT-3の存在下で培養。MAP2, SMI-32の発現を確認。骨格筋細胞筋ジストロフィー多発性筋炎・皮膚筋炎封入体筋炎先天性ミオパチー Shoji E, Woltjen K, Sakurai H. Methods Mol Biol (2015) iPS細胞にテトラサイクリン誘導発現系にてMYOD1を発現するコンストラクトを導入。分化誘導時にMYOD1を発現状態にする事で、細胞集団の70-90%が筋細胞に分化。同細胞集団に電気刺激を与えることで、成熟筋細胞の特徴である cell fusion 及び cell twitching を観察し、確認。心筋細胞 QT延長症候群特発性拡張型心筋症肥大型心筋症拘束型心筋症 Fuerstenau-Sharp et al. PLoS One (2015) H1152, bFGFの存在下で分化誘導後、bFGF, Activin A, BMP-4の存在下で分化誘導を行い、心筋のマーカーcardiac troponin T, alpha-actinin, MLC2Vの発現を確認。電気生理学的な解析にて、action potential を確認。糖尿病 Shahjalal HM & Kume S et al. J Mol Cell Biol (2014) 高濃度NOGGIN 存在下でPDX1陽性の膵前駆細胞及びNGN3陽性の膵内分泌細胞前駆細胞を誘導し、IBMX, exendin-4, nicotinamide の存在下で誘導。細胞内にCpeptideを確認、かつ、高濃度の糖に反応してC-peptideを分泌。若年性ネフロン癆多発性嚢胞腎 Taguchi A & Nishinakamura R et al. Cell Stem Cell (2014) Activin, Bmp4, CHIR, retinoic acid, Fgf2, Fgf9の存在下にて、胚様体と脊髄神経との共培養系で３次元組織として分化誘導。組織学的構造確認、及び、免疫組織染色にてnephrin陽性細胞を確認。特発性間質性肺炎 Ghaedi M et al. J Clin Invest (2013) Activin A, SB431542, NOGGIN, EGF, FGF, KGF, WNT3aの存在下で肺胞前駆細胞（AETII）を分化誘導し、 surfactant protein B, surfactant protein C, CD54の発現を確認。インシュリン産生細胞（膵ラ氏島β細胞）ネフロン構成細胞（中胚葉＋内胚葉）肺 9