ITEA 株式会社 東京環境アレルギー研究所 ITEA ダニアレルゲン（Der f 1）ELISA キット（抗体固相化済） コード 10205 保 存 4 ℃ 内 容 A, 抗体固相化マイクロプレート(ブロッキング済) 48 ウェル×2 袋 B, Der f 1 標準液（凍結乾燥） 2 本 (4 測定分) C, 酵素標識抗 Der f 1 抗体 12 ml D, 発色基質液(3, 3’, 5, 5' -テトラメチルベンジジン：TMB) 12 ml E, 反応停止液（1Ｎ硫酸） 12 ml F, 検体希釈液 25 ml G, 洗浄液（10 倍濃縮液） 30 ml×2 本 マイクロプレート用シール 3枚 取り扱い説明書および SDS 各1部 使用目的 検体中の Der f 1 濃度の測定。なお、本品は研究用試薬です。 必要な試薬・ 精製水、ピペットおよびピペッター、マイクロピペット（2-20, 20-200 μl, 200-1000 μl） 器具 およびピペットチップ、リザーバー、マイクロプレートウォッシャー＊、マルチチャン ネルピペット、マイクロプレートリーダー (波長 450 nm) ＊ マイクロプレートウォッシャーがなくても、マルチチャンネルピペットで洗浄可能。 使用上の注意 測定前にはすべての試薬を室温に戻してから使用する。また、各試薬は良く撹拌して から使用する。 標準液を溶解する液量は Lot 毎に異なるので、確認の上溶解する。 検量線は測定毎に作製し、測定は二重測定で行う。 試薬調整 抗体固相化プレート 室温に戻してから開封する。開封後はできるだけ早く使用する。 洗浄液（10 倍濃縮液） 精製水で 10 倍に希釈し、1 倍洗浄液として使用。1 プレート分の測定には、300 ml の 1 倍洗浄液があれば十分です。 酵素標識抗 Der f 1 抗体 室温に戻して、希釈せずに使用する。 発色基質液 室温に戻して、そのまま使用する。 反応停止液 室温に戻して、そのまま使用する。強酸につき、使用の際には、目や皮膚、衣服な どに付着しないように十分に注意する。 〒113-0034 東京都文京区湯島 1-2-5 聖堂前ビル 5F [email protected] / www.itea.jp Tel 03-3526-2031 Fax 03-3526-2032 環境に配慮し、再生紙を使用しております。 ITEA 株式会社 東京環境アレルギー研究所 試薬調整 Der f 1 標準液の溶解 本ロット（Lot No. ＿＿＿＿＿）は精製水＿＿ l で溶解すると Der f 1 として 600 ng/ml となる。 検量線用の Der f 1 標準液 2 倍階段希釈液の調整 上記のように溶解した Der f 1 標準液（B）から 25 μl 取り、475 μl の検体希釈液 に加えると Der f 1 最終濃度 30 ng/ml の溶液となる。この 30 ng/ml の液から 250 l とり、250 l の検体希釈液に加える。この 2 倍階段希釈により、30, 15, 7.5, 3.75, 1.88, 0.94, 0.47 ng/ml の標準液を調整する。検体希釈液のみを陰性対照とする。 尚、Der f 1 標準液（凍結乾燥）1 本で 2 回測定分の量となる。溶解後の Der f 1 標 準液は 4℃で保管し 10 日以内に使用する。 図 1. Der f 1 標準液の 2 倍階段希釈作製の手順 25 μl 溶解した Der f 1 標準液(B) 475μl 30 ng/ml 標準液 30 ng/ml 250 μl 250 μl 250μl 250μl 15 ng/ml 7.5 ng/ml 250 μl 250 μl 250μl 250μl 250μl 1.88 ng/ml 0.94 ng/ml 3.75 ng/ml 添加する液 精製水＿＿ μl で溶解した Der f 1 標準液 25 μl 250 μl 希釈液 検体希釈液 475 μl 15 ng./ml 30 ng/ml の溶液 250 μl 検体希釈液 250 μl 7.5 ng/ml 15 ng/ml の溶液 250 μl 検体希釈液 250 μl 3.75 ng/ml 7.5 ng/ml の溶液 250 μl 検体希釈液 250 μl 1.88 ng/ml 3.75 ng/ml の溶液 250 μl 検体希釈液 250 μl 0.94 ng/ml 1.88 ng/ml の溶液 250 μl 検体希釈液 250 μl 0.47 ng/ml 0.94 ng/ml の溶液 250 μl 検体希釈液 250 μl 陰性対照 検体希釈液 250 μl なし 〒113-0034 東京都文京区湯島 1-2-5 聖堂前ビル 5F [email protected] / www.itea.jp Tel 03-3526-2031 Fax 03-3526-2032 環境に配慮し、再生紙を使用しております。 250 μl 250μl 0.47 ng/ml ITEA 株式会社 東京環境アレルギー研究所 測定方法 ① 室温に戻したマイクロプレートに、あらかじめ用意していた各濃度の Der f 1 標 準液および検体を 1 ウェル当たり 100 l 加え、室温で１時間静置する。 ② プレートウォッシャーまたはマルチチャンネルピペットを用いてウェルを 3 回洗 浄する。マルチチャンネルピペットを用いて洗浄する場合、以下の方法にて洗浄 を行う。ウェル内の液を棄て、1 ウェル当たり 350 l の洗浄液を加え、その洗浄 液を捨てる。これを 3 回繰り返す。マイクロプレートを裏返しにして、重ねたペ ーパータオル上に何回か軽く叩きつけてウェル内に残っている液を除く。 洗浄後、酵素標識抗 Der f 1 抗体を 1 ウェル当たり 100 l で加え、室温で 1 時間 静置する。 ③ ②と同様の方法で 3 回洗浄した後、 発色基質液を 1 ウェル当たり 100 l 加えて、 室温で遮光しながら 15 分間静置する。 ④ ここでは洗浄はしない！ウェルに入っている液を捨てずに、その上から停止液を 1 ウェル当たり 100 l 加え反応を停止させる。 ⑤ 陰性対照をブランクとして、マイクロプレートリーダー（450 nm）で測定する。 リファレンスは 620 nm を使用する。※リファレンスが無くても測定は可能。 ⑥ 性 能 マイクロプレートリーダー付属の解析ソフトウェアで検体濃度を算出する。 測定範囲：30, 15, 7.5, 3.75, 1.88, 0.94, 0.47 ng/ml 定量下限：0.94 ng/ml 検出限界：0.47 ng/ml カーブフィット： 4-parameter logistic または 3 次式推奨 〒113-0034 東京都文京区湯島 1-2-5 聖堂前ビル 5F [email protected] / www.itea.jp Tel 03-3526-2031 Fax 03-3526-2032 環境に配慮し、再生紙を使用しております。 ITEA 株式会社 東京環境アレルギー研究所 性 能 再現性試験 濃度の異なる 5 検体の Der f 1 濃度を独立して 3 回測定し、本 ELISA の日差および日 内再現性を評価した。日差再現性の CV0.9～5.8%、日内再現性の CV0.3～2.9%と良好 な再現性を示した。 Der f 1 測定の特異性 本 ELISA においては、Der p 1（0.4、4、40、400、4000 ng/ml）に対する反応は認め られず、Der f 1 を特異的に測定できることが確認された。 〒113-0034 東京都文京区湯島 1-2-5 聖堂前ビル 5F [email protected] / www.itea.jp Tel 03-3526-2031 Fax 03-3526-2032 環境に配慮し、再生紙を使用しております。 ITEA 株式会社 東京環境アレルギー研究所 ELISA の原理 ① 抗 Der f 1 抗体固相化およびマイクロプレート（抗体固相およびブロッキング済） 抗 Der f 1 抗体 ブロッキング剤 ② 標準液および検体を添加 Der f 1 ③ 酵素標識抗 Der f 1 抗体の添加 酵素標識抗 Der f 1 抗体 ④ 固相化抗体と酵素標識抗体による Der f 1 のサンドウィッチ形成 ⑤ 発色基質(TMB)を添加すると酵素と反応し青く発色する。反応停止液を添加する と黄色に変化する。 発色基質(TMB) 青く発色した基質 2015．4．22 〒113-0034 東京都文京区湯島 1-2-5 聖堂前ビル 5F [email protected] / www.itea.jp Tel 03-3526-2031 Fax 03-3526-2032 環境に配慮し、再生紙を使用しております。
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