●人工臓器 ─最近の進歩分子インプリント法によるバイオ分子認識表面の創製東京大学大学院工学系研究科マテリアル工学専攻深澤今日子，石原一彦 † Kyoko FUKAZAWA, Kazuhiko ISHIHARA 介する。はじめに 1. 特定の分子を認識する表面を有する材料は，医療・バイ 2. 分子インプリント法オ関連分野において広く利用されている。例えば，疾病マー分子インプリントの歴史は長く，1931 年に Polyakov がカーの検出や診断を行う医療デバイスでは，血中から微量報告した特異的な吸着挙動を示すシリカゲルが，分子インの標的分子を選択的に認識する表面が求められる。また，プリントの概念を提案した最初の論文とみなされていタンパク質や細胞の機能解析を行う分析デバイスでは，混る 3) 。現在のポリマー材料への分子インプリント法は，合溶液中から標的分子の構造を変化させずに捕捉する表面 1970 年代より Wulf f や Mosbach らにより精力的に研究さが必要とされる。生体内で恒久的に埋め込んで使用する人れてきた手法である 4),5) 。原理は，標的分子とそれに対応工血管やステントにおいても，血中から内皮前駆細胞を選する官能基を持つモノマーを共存させ，架橋剤を加えて重択的に捕捉し，早期に内皮層を形成させる表面創製が行わ合する。得られたポリマーから標的分子を取り除くことにれている 1),2) 。より，その分子に相補的な結合部位をポリマーネットワー混合物から標的分子を選択的に認識するためには，高感ク内に形成させるというものである（図 1）。この手法は薬度で信頼性のある表面創製が求められる。一般的に物質の物やアミノ酸誘導体，農薬などの低分子に対して適用され，選択的認識には抗原−抗体反応，基質−酵素反応，核酸のすでにこれらを吸着するテイラーメイドアフィニティーカ特異的複合体形成などバイオ分子の分子認識が利用されラムとして市販されている 6) 。一方で，タンパク質のようる。これらのバイオ分子を表面に固定することで，標的分な高分子量のバイオ分子を標的分子とした場合，認識部位子の選択的認識が効率よく行われる。一方で，バイオ分子を構築することが困難であり，高い選択性を得るためにはは温度や pH といった外部環境の影響により構造が変化多くの課題が残っている。これは，タンパク質の構造が柔し，分子認識機能が変動するため使用条件が限定されるとらかく，また外部の環境によって変化することに起因する。いう問題がある。そこで，バイオ分子のもつ分子認識機能さらには，タンパク質特有の弱い分子間相互作用の集積でを化学的に安定な合成ポリマーで再現する分子インプリン非特異的に吸着することが選択性を低下させる要因となっト法が注目されている。これは標的分子に対して特異的にている。バイオ分子を標的分子とした分子インプリントは相互作用する空間をテイラーメイドにポリマーネットワー 2005 年以降急速に注目を浴びており，従来の方法と異なるク内に構築する手法で，得られたポリマーはバイオ分子に様々な手法が提案されている 7),8) 。替わる分子認識素子として期待されている。本稿では，分子インプリント法を用いた分子認識表面の創製に関して紹 † 東京大学大学院工学系研究科マテリアル工学専攻 202 バイオ分子のための分子インプリント法従来のバルクインプリンティング（図 1）では，認識部位 ■著者連絡先（〒 113-8656 東京都文京区本郷 7-3-1） E-mail. [email protected] 3. を保つために比較的高密度のポリマーネットワークが形成される。しかしながら，サイズが大きくフレシキブルな構造を持つバイオ分子が標的分子の場合，この方法では重合人工臓器 43 巻 3 号 2014 年図 1 分子インプリント法の基本原理標的分子の化学的性質，形状を記憶した空間がポリマーネットワーク内に形成される。後にポリマーネットワークから標的分子を除去することがティング”という手法も報告されている 11) 。この手法は抗困難である。そこで，基材表面にごく薄いインプリントポ体−抗原反応の特異的相互作用を模倣している。低分子量リマー層を形成させる，または，標的分子を吸着させた担のペプチドはタンパク質と異なり高次構造を有さないため体（シリコンウエハー，ガラス，マイカなど）をスタンプと外部の影響を受けにくい。すなわち， “エピトープインプして用い，ポリマー表面にのみインプリントする“サーリンティング”ではバイオ分子特有の問題を回避し，低分フェイスインプリンティング”という手法が報告されてい子のようなインプリントが可能となる。Dechtrirat らはシる。この手法は標的分子をインプリントした基材表面をそトクロム C の表面に露出した C 末端由来の合成ペプチドのままセンサ素子として利用できる利点がある。Karimian （96 ∼ 104 番目のアミノ酸残基）を標的分子とし，金基板上らは標的分子に心臓バイオマーカーであるトロポニン T をにスコプロチンの電解重合によりインプリントした 12) 。選定し，金電極表面に O- フェニルジアミンの電解重合によ標的ペプチドはインプリントポリマーに対して高い SPR 応りインプリントした 9) 。ここでは，O- フェニルジアミンの答を示した。一方で，アミノ酸シーケンスが 1 つ異なるペアミノ基が標的分子であるトロポニン T との認識部位を形プチドでは SPR 応答は低く，アミノ酸シーケンスの 1 つの成すると考えられている。トロポニン T の検出は緩衝液中違いを認識できることが明らかになった。さらに，その標および血清中で微分パルスボルタンメトリーにより行わ的ペプチドを有するシトクロム C はインプリント表面に選れ，校正範囲は 0.0009 ∼ 0.8 ng/ml，検出限界は 9 pg/ml と択的に捕捉され，またそれは C 末端（標的ペプチド）を通し報告されている。抗体を用いた他の検出方法〔酵素標識免ての捕捉であることが示唆された。疫測定法（ELISA），表面プラズモン共鳴（SPR）免疫センサ，水晶発振子マイクロバランス（QCM）免疫センサなど〕に比較して高感度検出を達成している。また，Schirhagl らは抗体レプリカを作製し，標的分子の認識を行った 10) 。抗 4. タンパク質インプリントの新戦略と細胞接着の誘導タンパク質が標的分子の場合，柔らかくフレキシブルな体レプリカはダブルインプリントによって作製する。まず，構造に対応した複合体（認識部位）を構築し，その複合体を標的分子であるインスリンの抗体をインプリントしたナノ重合中も維持することが課題となる。また，インプリント粒子（鍵型）を作製し，続いてそのナノ粒子を QCM 基板上の過程での変性を抑制すること，認識部位以外への非特異にインプリントする。すなわち，インスリン抗体のポジ像的吸着を抑制することが極めて重要である。を QCM 基板上に構築した。作製したレプリカは標的分子ここでは物質の選択的認識を行う細胞膜構造に着目したのエピトープに対して親和性を有する。直接抗体を表面に例を紹介する。細胞膜はリン脂質二分子膜にタンパク質や固定化する，または標的分子をインプリントする場合に比糖鎖が埋め込まれた構造をしている。中性のリン脂質は，べ，表面積の大きいナノ粒子（抗体インプリント粒子）をイバイオ分子の非特異的吸着を抑制し，分子認識素子としてンプリントするため，表面におけるインプリント密度を高働くタンパク質や糖鎖の機能を最大限に高めている。そこくすることができる。さらにこの手法は，標的分子の直接で，この細胞膜構造を模倣し，バイオ分子の非特異的吸着使用を避けられるので，標的分子に毒性がある場合や希少を抑制する表面に分子認識部位を構築する手法が検討されな場合，または非常に不安定な物質の場合に有効な手段でた。具体的には，標的分子にリガンドとしてドデシル硫酸ある。ナトリウム（SDS）を吸着配向させ，タンパク質の非特異的標的分子であるタンパク質全体ではなく，ペプチドシー吸着を抑制することで知られる 2- メタクリロイルオキシエケンスの一部をインプリントする“エピトープインプリンチルホスホリルコリン（MPC）を一成分とした光反応性ポ人工臓器 43 巻 3 号 2014 年 203 図 2 新規分子インプリント法による分子認識界面の創製リマー（PMPAz）13)（図 2）で架橋した 14) 。タンパク質と板上ではライン上に細胞の接着が観察された。FN-MIP 基界面活性剤の相互作用は良く研究されており，相互作用は板上では，培養液中から細胞接着タンパク質の FN が選択段階的に起こることが知られている。SDS の濃度が高いと的にインプリントされた場所に再吸着し，細胞接着を誘導タンパク質の構造変化を引き起こすが，非常に低濃度では，したと考えられる。この細胞接着挙動を明らかにするため，タンパク質の構造変化を引き起こさずに，特定の位置に静インプリント表面に再吸着した FN の量を ELISA 法により電的相互作用および疎水性相互作用により吸着する。標的測定した。N-MIP，BSA-MIP 基板ではほとんど FN が吸着分子に対して最適な位置に吸着配向した SDS は，フレキシしていないのに対し，FN-MIP 基板では多量の FN が吸着しブルな構造に対応するリガンドとして働くと考えられた。ていた。これにより，細胞接着は細胞培養液中の FN の再標的分子に細胞接着タンパク質であるフィブロネクチン吸着に起因することが証明されている。このように，マイ（FN）を選定し，細胞の接着を誘導する表面が研究された。クロファブリケーションと分子インプリンティングを組みまず，シリカビーズに FN を固定化し，プロテインスタン合わせることにより，細胞を所定の位置に接着誘導するこプビーズを作製する。作製したスタンプビーズと SDS，おとができた。培養液中から特定のタンパク質を選択的に捕よび PMPAz を混合し，ポリエチレン基板に展開する。UV 捉することで細胞の接着を制御する表面は，新しい細胞工照射後，ポリマー層からスタンプビーズを取り除くことで，学デバイスとしての利用が期待できる。 FN の認識部位をポリエチレン基板上に構築する手法である（図 2）。この手法ではポリマー層に光反応性ポリマーを 5. おわりに使用しているので，フォトマスクを用いてインプリント部タンパク質や DNA または細胞などのバイオ分子を対象位を制御することが可能である。100μm のフォトマスクとした分子インプリンティングの分野は近年急速に広がっを用いて，標的 FN をライン上にインプリントした表面た。抗体や DNA などのバイオ分子に替わる分子認識素子（FN-MIP）が作製された。比較として，タンパク質を固定として汎用的に使用するためには，リガンドの選択やインしていないビーズをインプリントした表面（N-MIP）およプリント方法などさらなる工夫と最適化が必要といえる。びウシ血清アルブミン（BSA）をインプリントした表面しかしながら，化学的に安定で，また工業的に大量生産が（BSA-MIP）を作製し，これらの基板上における HeLa 細胞可能な合成ポリマーを用いた分子認識素子は，分離・分析の接着挙動が観察されている。図 3 に示すように，N-MIP 用のツールとしてだけでなく，バイオマーカーの探索・診および BSA-MIP 基板上ではタンパク質の吸着が抑制され断，センシング素子，細胞工学デバイスとして医療分野にたため，細胞接着が観察されなかった。一方，FN-MIP 基おける期待は大きい。 204 人工臓器 43 巻 3 号 2014 年図 3 様々な表面での HeLa 細胞の接着挙動本稿のすべての著者には規定された COI はない。文　献 9) 1) 山岡哲二：人工血管 ─脱細胞組織をベースにした再生型小口径血管─．人工臓器 42: 184-7, 2013 2) Pereira-da-Silva T, Bernardes L, Cacela D, et al: Safety and ef fectiveness of the genous endothelial progenitor cellcapture stent: follow-up to 5 years. J Invasive Cardiol 25: 666-9, 2013 3) Polyakov MV: Adsorption properties and structure of silica gel. Zhur Fiz Khim 2: 799-805, 1931 4) Wulf f G, Sarhan A: The use of polymers with enzymeanalogous structures for the resolution of racemates. Angew Chem Intl Ed Engl 11: 341, 1972 5) Mosbach K: Molecular imprinting. Trends Biochem Sci 19: 9-14, 1994 6) Kryscio DR, Peppas NA: Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers. Acta Biomater 8: 461-73, 2012 7) Schirhagl R: Bioapplications for molecularly imprinted polymers. Anal Chem 86: 250-61, 2014 8) Li S, Cao S, Whitcomebe MJ, et al: Size matters: challenges 10) 11) 12) 13) 14) in imprinting macromolecules. Prog Polym Sci 39: 145-63, 2014 Karimian N, Vagin M, Zavar MH, et al: An ultrasensitive molecularly-imprinted human cardiac troponin sensor. Biosens Bioelectron 50: 492-8, 2013 Schirhagl R, Latif U, Podlipna D, et al: Natural and biomimetic materials for the detection of insulin. 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