In Situ 細胞死検出キット、フルオレセイン

In Situ 細胞死検出キット、フルオレセイン
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein
DNA 鎖分解物の標識（TUNEL）法に基づく一細胞レベルでの、アポトーシス（プログラムされた細胞死）の免疫組織化学的検出 / 定量キット：蛍
光顕微鏡 / フローサイトメトリーによる分析が可能。
Cat. No. 1 684 795　1キット（50テスト）
Ver. 16.0
1. キット内容
注　意　標識溶液はカコジル酸塩を含み、吸入したり飲み込んだりすると有
害です。塩化コバルト（II）は、発がん性のおそれがあります。環境へ
の放出を避けて、使用の前に特別な知識を得てください。
使用時は口に入れたり、飲んだり、吸ったりしないで下さい。皮膚
や目に付着したら、多量の流水で十分洗い流してください。不測の事
態や気分が悪くなった場合は、医師の診断を受けてください。
上清はラベリング反応液から回収し、壊れにくいしっかりと蓋の閉
まる容器にいれ、内容を表示した上で、有毒廃棄物として廃棄してく
ださい。
注：酵素溶液は、カコジル酸塩を含まず無害です。
代替処理
・浸透化溶液：（0.1 ％
Triton Ⅹ－100, 0.1 %
クエン酸ナトリウム）
新規調製物
・ペプシン（0.25％－0.5
％塩酸、pH2中）かト
リプシン　0.01規定　塩酸　ヌクレアーゼ
フリー
・0.1Ｍクエン酸バッフ
ァー、pH6　マイク
ロウェーブ照射用
キット内容
キットの内容は以下の表を参照してください。
バイアル
/キャップ
1
青
2
紫
ラベル
標識プロトコール（セクション3.3）
陽性コントロール
（セクション3.3.1）
内　容
・細胞懸濁液
（セクション3.3.2）
・接着細胞
（セクション3.3.3）
困難な組織
（セクション3.3.4)
酵素溶液・ターミナルトランスフェラーゼ、リコン
ビナント（保存バッファー中）
・10 倍濃度
・5 ｘ 50μl
標識溶液・ヌクレオチド混合液（反応バッファー中）
・1 倍濃度
・5 ｘ 550μl
必要な追加試薬
上記の試薬に加えて、いくつかの溶液を準備してください。表では、
異なる手順で必要とされる器材の概要を示しています。
手　順
器　具
試　薬
サンプルの前処理（セクション3.2）
・細胞懸濁液（セクショ・シェーカー
・洗浄バッファー：リ
ン3.2.1）
・96穴Ⅴ底マイク
ン酸バッファー
（PBS）
・接着細胞、細胞スメア、ロプレート
・固定液：パラホル
サイトスピン調製品
ムアルデヒド（PBS,
（セクション3.2.2）
pH7.4 中 4 ％）
・凍結切片（セクション
・浸透化溶液：クエン酸
3.2.3.2）
ナトリウム0.1 ％中 0.1
％ Triton X－100（6）
パラフィン包埋切片
・キシレンおよびエタ
（セクション3.2.3.1）
ノール（無水、95 ％ ,
90％ , 80％ , 70％ , －
再蒸留水で希釈）
・洗浄バッファー：
PBS
・プロテイナーゼ K（10
mMTris/HCl 中10～
20μg/ml）
・球菌ヌクレアーゼ
・DNase I, リコンビナ
ント
・パラフィルムも洗浄バッファー：PBS
しくはカバース
リップ
・湿式チャンバー
・プラスティック・0.1Ｍクエン酸バッフ
ジャー
ァー、pH6
・マイクロウェー・洗浄バッファー：
ブ照射装置
PBS
・湿式チャンバー・トリス－HCL,0.1M
pH7.5 3% BSA,20%正
常牛血清を含む
2. 序論
2. 1 製品概要
試験原理
アポトーシスにおける DNA の断片化は、二重鎖低分子量 DNA 断
片（モノ、オリゴヌクレオソーム）と、高分子量 DNA 中のニックなど
を生じます。
これらの DNA 断片はフリーの 3' －OH 末端に、酵素反応により修
飾核酸を標識することによって同定できます。
ステージ
説　明
1
ターミナルトランスフェラーゼ（TdT）はテンプレートに
依存せずに 3' － OH DNA 末端への核酸の重合を触媒し、
DNA 断片の標識に用いられます（TUNEL 反応）。
2
取り込まれたフルオレセインは、蛍光顕微鏡あるいはフ
ローサイトメトリーで検出、定量化されます。
36
注：TUNEL 反応混合液は使用直前に準備し、保存しないで下さい。
TUNEL 反応混合液は、使うまでは氷上に置いて下さい。
利点
利　点
高感度
特異性
図1：ターミナルトランスフェラーゼにより固定された細胞の DNA 断片にフル
迅　速
簡便性
オレセイン標識 dUTP が付加されます。
アプリケーション
この in situ 細胞死検出キットは、細胞や組織のアポトーシスによ
る細胞死を一細胞のレベルで検出する正確、迅速、簡便なノンラジオ
アクティブ技術としてデザインされています。それ故、多くのアッセ
イシステムで使用可能です。例としては、
・基礎研究における、凍結及びフォルマリン　固定組織切片での個別
のアポトーシス細胞の検出
・癌研究における、薬品誘導アポトーシスへの腫瘍細胞の感受性の測
定
・不均一細胞群中で細胞死を起こしている細胞の二重染色によるタ
イピング（6、7）
汎用性
機能試験済み
特　徴
蛍光顕微鏡による一細胞レベルでの観察や、FACS
による細胞群レベルのアポトーシス細胞の検出（1, 2、6）。
ネクローシスに対して、アポトーシス細胞の選択的
標識（3,4）。
短い測定操作時間（1～2 時間）
・二次検出システムは必要ありません
・1回のインキュベーションと1回の洗浄だけです。
・試薬は安定化、至適化されています
・希釈操作は必要ありません。
・固定細胞、組織に適しています。これは、試料の
蓄積、　保存、輸送を容易にします（2, 5）。
・二重染色によりアポトーシスを起こしている細胞
の分化の状態や、タイプの同定を可能にします（6）。
全てのロットはマスターロットと比較して、アポト
ーシス細胞により機能試験がされています。
2. 2 背景情報
細胞死
細胞死の二つの形態である、アポトーシスとネクローシスは形態学
上、生化学上、死細胞の分子変化などの差異に基づき区別することが
できます。プログラムされた細胞死 / アポトーシスは、真核細胞の死
の最も一般的な形態です。これは、恒常性を維持する生理学的自殺
のメカニズムで、正常組織の成長過程において自然に起こります（8, 9）。
一般的に、アポトーシスを起こしている細胞は細胞膜に泡状の突起が
でき、核の崩壊を含む、核及び細胞質の構造変化の特徴的なパターン
を示します。核の崩壊は、クロマチンへの広範な傷害や、Ca2+ 依存
性内在性エンドヌクレアーゼの活性化によるオリゴヌクレオソーム単
位の長さの DNA 断片化を伴っています（10, 11）。しかしながら、形態学
的なアポトーシス像がオリゴヌクレオソーム DNA 断片化を伴なわな
い、ごく希な例外が知られています（37）。
特異性
TUNEL 反応は、アポトーシスにより生成する DNA 鎖分解物を優
先的に標識しますのでネクローシスや、放射線治療や細胞静的薬品に
より誘導される一次 DNA 鎖分解物と判別できます（3, 4）。
試験への干渉要因
偽陰性：ある形態のアポトーシスにおいては DNA 断片化がないか不
完全な場合があります（37）。TdT の DNA 断片への接近を邪魔する
細胞間マトリックス複合体などによる立体障害。どちらの場合にも
偽陰性の結果が生じます。
偽陽性：ネクローシスの後期段階で起きる広範囲な DNA 断片化（4, 38）。
細胞死のアポトーシス様式を確認するためには、それぞれの細胞の
形態学的研究を注意深く実験しなければなりません。アポトーシス
における形態学的変化は特徴的なパターンを持っています。従って
細胞の形態学的評価は、結果が曖昧な状況では重要なパラメーター
となります。
アポトーシス
アポトーシスは免疫系の成熟やエフェクター機構（12,13）、組織、器官、
肢の胚からの発達（14）、神経系の発達（15,16）、ホルモン依存性の組織再構
成（17）などを含む多くの生理学的過程で必須のものです。アポトーシ
スの不適当な調節は、虚血や発作、心臓病、癌、エイズ、自己免疫疾
患、肝臓毒性、中枢神経の崩壊病などの多くの病理学的な状況におい
て重要な働きを持ちます（18～20）。
癌研究において、細胞死が多くの抗ガン剤や放射線、過温症により引
き起こされ、アポトーシスにより応答する腫瘍細胞の固有の性質が数
種の癌遺伝子の発現により調節されていることから、癌治療の予後マ
ーカーになるかもしれないとの期待がよせられています（21）。
試　料
・細胞懸濁液
・樹立細胞株
・末梢血、リンパ球並びに白血球（4）
・胸腺細胞（1, 6）
・骨髄細胞
・生検細胞（5）
・サイトスピン、細胞スメア調製品
・チャンバースライド上での培養接着細胞（31）
・凍結及びフォルマリン固定、パラフィン包埋組織切片（1, 25, 26 29, 30, 32～34, 36, 39）
アポトーシスの同定
アポトーシス細胞を同定する方法は多く報告されていますが（22～24）、
核 DNA のオリゴクレオソーム断片化による核の崩壊がアポトーシス
の主要な生化学的現象として注目されています。この過程は、電気泳
動でのアガロースゲル中の典型的な "DNA ラダー " により、アポトー
シスの検出に利用されます。しかしこの方法は個別の細胞のアポトー
シスに関する情報は得られず、組織学的な局在あるいは細胞の分化
における細胞のアポトーシスに関する情報も得られません。
このことを可能にするのは、アポトーシス誘導 DNA 鎖分解物の酵
（1～7, 25～
素的 in situ 標識法です。ターミナルトランスフェラーゼ（TdT）
36, 41）
と同様に DNA ポリメラーゼが in situ での DNA 断片への標識
核酸の取り込みに利用されてきました。 TdT によるテイリング反
（5, 35）
応は、ISEL 法（in situ end labeling）
あるいは TUNEL 法（TdT－
（1, 6, 31, 33）
mediated dUTPnick end labeling）
として述べられています
アッセイ時間
1－2時間、細胞の培養、固定、浸透化、及び組織切片の準備を除く
テスト数
50回用
キットの保存と安定性
開封前のキットは－15～－25℃保存で保証期限（ラベルに記載）まで
安定です
37
が、DNA ポリメラーゼを用いる in situ ニックトランスレーション法
（ISNT）と比較して多くの利点があります。
・ISNT 法より TUNEL 法のほうがアポトーシスの標識強度が高く、
結果的に感度が高くなる（2, 4）。
・ISNT に比べ TUNEL は核酸の取り込みが非常に迅速です。
・TUNEL 法はネクローシスに比べアポトーシスを優先的に標識す
るのでネクローシスや、抗ガン剤や放射線により誘導された一次
DNA 鎖分解物からアポトーシスを識別します（3, 4）。
ステップ
アクション
1
試料を PBS で 3 回洗浄し、細胞数を 2 × 107 個 /ml に
調製。
2
100μl/well の細胞懸濁液を V 底 96 穴プレートに移す
3
100μl/well の用時調製のパラホルムアルデヒド固定溶液
（PBS 中4 ％ , pH 7.4）　を細胞懸濁液に加える（終濃度 2
％ PFA）。
4
よく再懸濁した後、15～25℃で60分間インキュベートする。
注：細胞の凝集を防ぐため、プレートは固定の間シェイ
カーの上でインキュベートする。
5
プレートを300 × g で10分間遠心し、軽くタッピングま
たは吸引で固定液を除去する。
6
200μl/well の PBS で一度洗浄する。
7
プレートを300 × g で10分間遠心し、軽くタッピングま
たは吸引で PBS を除去する。
8
細胞を100μl/well の浸透化液（ 0.1 ％クエン酸ナトリウ
ム中 0.1 ％ Triton X－100）で 2 分間氷上（2～8℃）で再懸
濁する。
9
以下の3.3に進む。
3. 手順と必要な材料
以下に述べる操作法は R. Sgonc とその共同研究者により開発され、
最近出版されたものです（6）。この簡単で迅速な操作法の主な利点は、
DNA 鎖分解物の標識にフルオレセイン－dUTP を用いていること
で、これにより、蛍光顕微鏡あるいはフローサイトメトリーで DNA
断片化の直接検出が可能になります。
3. 1 フローチャート
分析フローチャート
分析手順は以下のフローチャートで説明します。
細胞懸濁液
接着細胞
細胞スメア
サイトスピン
調製品
凍結組織切片
パラフィン
包埋組織切片
↓
↓
↓
↓
↓
固　定
脱パラフィン、
再親水化、
プロテアーゼ処理
↓
↓
浸透化
↓
TUNEL 反応液による標識反応
↓
フローサイトメトリ
ーあるいは蛍光顕微
鏡での分析
3.2.2 接着細胞、細胞スメア、サイトスピン調製品
必要な追加試薬
・洗浄バッファー：リン酸バッファー（PBS）
・固定液：パラホルムアルデヒド（PBS, pH7.4 中 4 ％）
・浸透化溶液：クエン酸ナトリウム0.1 ％中 0.1 ％ Triton X－100（6）
手　順
次の表に従い、接着細胞、細胞スメア、サイトスピンの調製を行っ
てください。
注：固定と浸透化に陽性及び陰性コントロールを作成して下さい。
ステップ
アクション
1
風乾した細胞試料を新しく調製したパラホルムアルデヒド
固定溶液
（PBS、pH7.4 中 4％）
で15～25℃、1時間固定する。
2
スライドを PBS ですすぐ。
3
浸透化溶液（0.1％、クエン酸ナトリウム）中で、氷上（2～8
℃）で2分間インキュベートする。
4
以下の3.3に進む。
蛍光顕微鏡での分析
3. 2 サンプルの前処理
3. 2. 1 細胞懸濁液
前標識
フルオレセイン標識抗体を使うフローサイトメトリーによる二重分
析を行う場合、細胞を固定する前にマーカーでインキュベートして下
さい。
3. 2. 3 組織切片
3. 2. 3. 1 パラフィン包埋切片の処理
パラフィン包埋切片の前処理
プロテイナーゼ K 処理または代替手法での前処理が可能です。プ
ロテイナーゼ K を使用する場合、濃度、インキュベーション時間、
および温度はそれぞれのタイプの組織（1、29、33、36、40、41）ごとに最適化し
て下さい。
注：プロテイナーゼ K は、roche applied science のものをご使用下
さい。ヌクレアーゼによる偽陽性がないことを試験済みです。
次の表に記述する代替手法による前処理も可能です。
（ステップ2）
必要な追加試薬と器具
・洗浄バッファー：リン酸バッファー（PBS）
・固定液：パラホルムアルデヒド（PBS, pH7.4 中 4 ％）
・浸透化溶液：クエン酸ナトリウム0.1 ％中 0.1 ％ Triton X－100（6）
・シェーカー
・96穴Ⅴ底マイクロプレート
注：V 底96穴プレートの使用により、固定、浸透化、標識の間の細胞
のロスを最小限にし、また多数検体の処理が可能になります。
必要な追加試薬
・キシレンおよびエタノール（無水、95％ , 90％ , 80％ , 70％ , －再蒸
留水で希釈）
・洗浄バッファー：PBS
・プロテイナーゼ K ワーキング溶液（ 10 mMTris/HCl, pH7.4～ 8中
10～20μg/ml）
手　順
以下の表で細胞の固定と浸透化の手順のプロトコロールを確認して
ください。
注：固定と浸透化に陽性及び陰性コントロールを作成して下さい。
代替処理
・浸透化溶液：（0.1％ Triton Ⅹ－100, 0.1%クエン酸ナトリウム）用時
調製
・ペプシン（0.25％－0.5％塩酸、pH2中）かトリプシン　0.01規定　塩
酸　ヌクレアーゼフリー
38
必要な追加試薬
・球菌ヌクレアーゼ　または、
・DNase I リコンビナント
0.1Ｍクエン酸バッファー、pH6　マイクロウェーブ照射用
手　順
次の表にパラフィン包埋組織のプロテイナーゼ K 処理と３つの代
替手順が記述されています。
注：陽性と陰性標識コントロール用の組織切片を加えてください
コントロール
陰性コントロールと陽性コントロールを各一連の実験ごとに作成し
て下さい。
ステップ
アクション
1
標準的方法（例：60℃で熱した後キシレンで洗浄しエタノ
ールと蒸留水での希釈系列で親水化）
（1, 33, 36）に従い組
織切片の脱パラフィン、親水化を行なう。
2
組織切片をプロテイナーゼ K ワーキング溶液と21～37℃
で、15～3 0分間インキュベートする
陰性コントロール固定、浸透化した細胞を TUNEL 反応液の代わ
りに、50μl/ ウェルの標識溶液（ターミナルトラ
ンスフェラーゼを含まず）でインキュベートする。
陽性コントロール標識を行う前に、固定、浸透化した細胞を、DNA
鎖分解を誘導するため球菌ヌクレアーゼ　または
DNase I, リコンビナント
（　3000 U/ml～3 U/ml,
50 mM Tris－HCl, pH 7.5, 1 mg/ml BSA,）
で、10
分間、15～25℃でインキュベートする。
代替処理法
1. 浸透化溶液
処理内容
スライドを 8 分間インキュ
ベート
2. ペプシンあるいはトリプ 37℃ 15～60分
シン
3. マイクロウェーブ照射
・スライドを200ml の 0.1
M クエン酸バッファー
pH 6.0 の入ったプラスチ
ックジャー内に置く。
・350 W 5 分間マイクロウ
ェーブ照射
3
4
3. 3. 2　細胞懸濁液の標識プロトコール
必要な追加試薬と器具
・洗浄バッファー：PBS
・湿式チャンバー
手　順
次の表をご覧下さい。
ステップ
アクション
1
PBS で細胞を 2 回洗浄する（200μl/well）。
2
50μl/well の TUNEL 反応液、で再懸濁する。
注：陰性コントロールは、50μl/well の標識溶液（ボトル
2）で再懸濁する。
3
ふたをし、暗所、加湿された環境で 37℃、60分間インキ
ュベートする。
4
試料を PBS で 2 回洗浄する（200μl/well）。
5
細胞試料をチューブに最終量、PBS 中250～500μl にな
るよう移す。
6
試料は直接蛍光顕微鏡で分析できる。あるいは分析の前
に退色防止剤で封入する。励起波長 450～500nm（たとえ
ば488nm）、検出波長515～565nm（緑）を使用する。
スライドを PBS で 2 回すすぐ。
以下の3.3に進む。
3. 2. 3. 2 凍結組織の処理
必要な追加試薬
・固定液：パラホルムアルデヒド（PBS, pH7.4 中 4 ％）
・洗浄バッファー：リン酸バッファー（PBS）
・浸透化溶液：クエン酸ナトリウム0.1 ％中 0.1 ％ Triton X－100、
用時調製
凍結組織
次の表に凍結組織の前処理を示します。
注：固定と浸透化に陽性及び陰性コントロールを作成して下さい。
ステップ
アクション
1
組織切片を固定液で 15～25℃で、20分間固定する。
2
PBS で30分間洗浄する。
注：保存は、無水エタノール中で 2 分間、固定組織切片
を脱水後、－15～－25℃で保存する。
3
スライドを浸透化溶液中、氷上（2～8℃）で 2 分間インキ
ュベートする。
4
以下の3.3に進む。
3. 3. 3 接着細胞、細胞スメア、サイトスピン調製品、組織の標識プ
ロトコール
必要な追加試薬と器具
・洗浄バッファー：PBS
・パラフィルムもしくはカバースリップ
・湿式チャンバー
手　順
次の表を参照下さい。
3. 3 標識プロトコール
3. 3. 1 はじめる前に
TUNEL 反応混合液の準備
一対のチューブ（ボトル 1 : 酵素溶液、ボトル 2 : 標識溶液）は、各
50μl の TUNEL 反応混合液を用いた10枚のサンプルの染色ならびに、
50μl の標識溶液を用いた 2 回の陰性コントロールの実施に十分な量
になっています。
注：TUNEL 反応混合液は使用前に用時調製します。保存はできませ
ん。TUNEL 反応混合液は使用まで氷上に静置します。
ステップ
実　行
1
スライドを PBS で 2 回すすぐ。
2
試料の周りを乾かす。
3
試料に TUNEL 反応液 50μl を加える。
陰性コントロールは、50μl/well の標識溶液を加える。
TUNEL 反応液が細胞層に均一に拡がるようにする。蒸
発によるロスを避けるため、試料はインキュベーション
の間パラフィルムやカバースリップで覆って下さい。
4
スライドを湿式チャンバー内で37℃で60分間インキュベ
ートする。
5
スライドを PBS で 3 回すすぐ。
6
試料は直接蛍光顕微鏡で分析できる。あるいは分析の前
に退色防止剤で封入する。励起波長 450～500nm（たとえ
ば488nm）、検出波長 515～565nm（緑）を使用する。
ステップ
アクション
1
2 回分の陰性コントロールに、ボトル 2 より100μl の標
識溶液をとっておく。
2
ボトル 1の全量（50μl）をボトル 2 の450μl 標識溶液に加
え500μl の TUNEL 反応混合液を調製する。
3
よく混合して、成分を均一にする。
39
3. 3. 4 困難な組織の標識プロトコール
必要な追加試薬と器具
・0.1Ｍクエン酸バッファー、pH6
・洗浄バッファー：PBS
・トリス－HCL,0.1M pH7.5 3% BSA,20%正常牛血清を含む
・マイクロウェーブ照射装置
・湿式チャンバー
4. 典型的な結果
分析手順
・5 × 10５個 /ml の密度の HL － 60細胞をカンプトテシン（2μg/
ml）存在下で 37℃、5 ％ CO2、湿度 90 ％で 3 時間インキュベートし、
アポトーシスを誘導する。
・非アポトーシス細胞群のコントロールとして、カンプトテシンを含
まない培地でインキュベートする。
・細胞を採取し、セクション3.3.2にの記述に従い操作を行なう。
手　順
次の表をご参照下さい。
ステップ
実　行
1
標準的方法に従いパラホルムアルデヒドやホルマリン固
定組織切片を脱パラフィンする。
2
スライドを200ml の 0.1 M クエン酸バッファー pH6.0の
入ったプラスチックジャー内に置く。
3
・750 W（high）で 1 分間、マイクロウェーブ照射
・80ml の再蒸留水（20～25℃）を直ちに加え、急冷する。
・スライドを PBS（20～25℃）中に移す。
注：プロテイナーゼＫ処理はしないでください。
4
スライドを15～25℃で30分間、3 ％の BSA と20 ％の正
常ウシ血清を含む 0.1 M Tris－HCl、
pH7.5 中に浸漬する。
5
・スライドを室温で、PBS で 2 回すすぐ。
・余分な液体を捨てます。
6
7
8
図 2：フローサイトメトリーによる HL - 60細胞でのカンプトテシン誘導アポ
トーシスの分析。
HL - 60細胞は上記の通り培養され、その後アポトーシス細胞はセクショ
ン3.3.2に述べられた通り標識された。
A : カンプトテシン不在下での培養
B : カンプトテシン存在下での培養（2μg /ml, 3 時間）
□ 細胞の自己蛍光のコントロール、標識 / 酵素溶液とのインキュベーシ
ョン無し
■ 陰性コントロール：ターミナルトランスフェラーゼ不在下で、標識溶
液とインキュベート
切片上に50μl の TUNEL 反応混合液を加える。
注：陰性コントロールには、50μl の標識溶液を加える
加湿条件下で37℃、　60分間インキュベートする。
・スライドを PBS 中で 3 回、各 5 分間すすぐ。
・蛍光顕微鏡で観察する。
■ TUNEL 反応液とインキュベートしたテスト試料
5. 付　録
5. 1トラブルシューティング
この表には様々なトラブルシューティングのパラメーターが記載されています。
問　題
非特異的な標識
手順のステップ / 試薬
組織の包埋
固定（fixation）
バックグラウンドが高い
考えられる原因
包埋剤（methacrylate など）を重合させ
るための UV 照射により、DNA 鎖
が破壊された。
酸性の固定用剤（mathacarn,Carny's
fixative など）
TdT 濃度が高すぎた
対処方法
他の包埋剤あるいは重合化試薬を使用する。
・4 ％に緩衝されたパラホルムアルデヒドを試用
・フォルマリンやグルタルアルデヒドを試用する。
TUNEL 反応
TUNEL ダイリューションバッファーで、TdT を
1：2 から 1：3 に希釈して濃度を下げる。
ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ特定の組織（平滑筋など）では組織調製・器官調製後、直ちに組織の固定を行う。
後非常に短時間に DNA 鎖の崩壊が観・肝臓静脈に固定用剤を灌流させる。
察された。
酵素がまだ活性を持っている
ddUTP と dATP を含む溶液でブロックする。
サンプルの測定
バックグラウンドが高すぎるため、マ以下の推奨によりバックグラウンドを減らす。
イクロプレートリーダーでは測定でき
ない。
サンプル
マイコプラズマの汚染
汚染マイコプラズマ検出キット（Cat. No. 1 296
449）
高度に増幅している細胞
フルオレセイン標識アネキシン V との二重染色
（Cat.
No. 1 828681）
注：バックグラウンドが高すぎるため、マイクロ
プレートリーダーでは測定できない。
赤血球はヘモグロビンのために高い自 dUTP－ローダミンを使用する。
己蛍光を示す。
固定（fixation）
フォルマリン固定により、メラニン前固定にメタノールを試用する。しかしこの固定方
駆体を含む細胞において黄色い染色を法は感度の低下を生じる点に注意する。
生じた。
40
TUNEL 反応
標識効率が低い
乳がん細胞で、標識用混合液（labeling 標識用混標識用混合液（labeling mix）の濃度を
mix）の濃度が高すぎた。
30mM の Tris pH 7.2 に140 mM カコジル酸ナト
リウムと1 mM 塩化コバルトを含む溶液を用いて
50％に減少させる。
固定（fixation）
エタノールやメタノールは、標識効率・4％緩衝パラホルムアルデヒドを試用する。
を低下させる可能性がある。
（ヌクレオ・フォルマリンやグルタルアルデヒドを試用する。
ソームが固定の間に架橋されず、
操作過程で失われる）。
過剰な固定により、タンパクが必要以・固定時間を短くする。
上に架橋された。
・2 ％緩衝パラホルムアルデヒドを試用する。
浸透化（permeabilisation）浸透化が短すぎると、試薬が目的の分・インキュベーション時間を長くする。
子に到達することができない。
・より高い温度でインキュベート（15～25℃など）
する。
・プロテイナーゼＫ（組織のタイプにより適切な
濃度および時間により）を試用する。
・0.1 M クエン酸ナトリウムを70℃、30分間にて
試用する。
脱色
蛍光色素が10分間、明るい光にさらさ後で観察するためには、サンプルは、TUNEL 反
れた
応の後、暗所に保存する。
パラフィン包埋
試薬がサンプルに十分に達しない。
・脱パラフィン後、プロテイナーゼＫで組織を処
理する（組織のタイプにより適切な濃度および
時間により）。
・370 Ｗ（Low）、5 分間、200ml の 0.1 M クエン
陽性コントロールにお DNase 処理
いてシグナルが出ない
DNase の濃度が低すぎた。
カウンター染色により DNA の染色
TUNEL 染色が弱くな
った
ヨウ化プロピジウム
（PI）
は、
エネルギーの
運搬を介して蛍光の光強度を減少させる。
はっきりしないシグナル
TUNEL で検出できるよりも早いアポ
トーシスのステージ
多くのアポトーシス小体が得られ、ア
ポトーシスが進みすぎて陽性および陰
性のピークが区別できない。
二重染色
結果の評価における問題 FACS 分析
アポトーシスのシグナルがない。
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酸緩衝液 pH 6.0を用いてマイクロウェーブ照射
を行う（組織のタイプにより適切な条件）。
・凍結切片に対し、3 U/ml の DNase Ⅰ、グレー
ドⅠを用いる。
・パラフィン包埋切片に対し、1500 U/ml の　DNase ⅠグレードⅠを用いる。
・一般的には、1 U/ml DNase I を、10 mM NaCl、
5 mM MnCl 2、0.1 mM CaCl 2、25 mM KCl を
含む10 mM　Tris－HCl pH 7.4 にて溶解して溶
液で、37℃、30分　間インキュベートして下さい。
・代替バッファーとして、1 mM MgCl 2と1mg/
ml BSA を含む Tris－HCl、pH 7.5 がある。
・0.5μg/ml のヨウ化プロピジウムを試用する。
・Molecular Probe 社の TO－PRO－3 を試用する。
・細胞質のカウンター染色にはスルフォローダミ
ンが適する。
他のアポトーシス検出法：M30サイトデスやフル
オレセイン標識アネキシン V が適する。
アポトーシス誘導法を変える：FSC/SSC のヒス
トグラムで 2 － 3 の分画で次のものが確認され
なければならない。
1. アポトーシス小体と残渣
2. 細胞全体
3. 収縮した細胞ゲートは消失。1）明瞭に分かれた
ピークが確認できること
細胞株と誘導剤に依存し、時間を至適化する。
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