教育の頁一塩基多型を利用した新しい結核菌遺伝系統分類法の開発結核研究所抗酸菌部結核菌情報科長　はじめに前田伸司集団感染や院内感染疑い事例において，疑いを明 SNP分析法は注目される技術で，例えば，ヒトでの確に否定あるいは確認するための手段として結核菌大規模な遺伝型と疫学研究によりSNP部位の塩基配の型別が行われる。近年，型別の標準法は，IS6110 列の違いで肝炎ウイルスに対するペグインターフェ RFLP（制限酵素断片長多型）分析から反復配列多型ロンガンマとリバビリンの併用治療が有効か，あら（VNTR）分析法にシフトして来ている。また，新しかじめ予想できるようになっている。結核についてい型別法としては，次世代シークエンサー（NGS）をもSNPの有無で菌の病原性の高さや薬剤耐性化しや用いた結核菌分離株の全ゲノム比較で報告されていすいなどの性質が，今後の研究によって明らかになっる一塩基多型（SNP）を調べて型別する方法である。てくるかもしれない。図1　遺伝子の挿入あるいは欠損によるSNPの生成 SNPは，ランダムに生じる場合と菌ゲノム上の遺伝子の一部欠損や挿入等の事象が生じて対象菌が主要な進化系統から分岐する際に生じる場合があることが知られている（図1）。そのため，特定部位のSNP を調べることで菌を遺伝系統に従って分類することができる。今回，このようなSNPを利用した新しい結核菌型別システムの構築を行った。図2　SNPsを利用した結核菌の系統解析結核菌の遺伝系統（特に北京型結核を対象とした）に応じた SNP 分析システム NGSを用いた結核菌の全ゲノム解析で同定された遺伝系統と関連したSNP部位（特に日本国内では北京型結核菌の祖先型が主流な菌型なのでこの遺伝型の菌を効率よく型別できるような）を選択し，系統的に型別できる分析システムを構築した（図2）。23箇所のSNP 部位の変異を迅速に検出する方法として，リアルタイムPCRの系を利用した。分析の手法としては，最初に 2カ所，すなわち3284855位と1477596位のSNPを調べることで，非北京型と北京型及び北京型結核菌はさらに新興型と祖先型へと大き 14 5 / 2015 複十字 No.362 く3グループに区分し，それぞれの系統ごとに追加の図３　SNP法（23箇所）による結核菌の系統分析 SNP解析を行った（図3）。構築した SNP 解析システムでの結核菌臨床分離株の分析東京，韓国，台湾から分離された結核菌，それぞれ219株，293株及び210株について本システムで実際に分析を行った。地域に依存して存在する結核菌のサブタイプが異なることを想定して研究を行ったが，地域によって北京型祖先タイプと北京型新興タイプ共に各サブタイプの存在比は異なるものの，存在する遺伝型の種類は，日本，韓国及び台湾でほとんど変わらなかった（図4）。つまり，北京型結核菌については，調べたどの地域においてもSNP分析で同一パターンの結核菌が広まっていることが分かった。今後の応用図4　‌S NP分析による日本、台湾及び韓国から分離された結核菌のサブタイプ存在比 ‌祖先型（A）については10箇所、新興型（B）は4箇所のSNP分析を行いサブタイプに分類した。 A SNPを利用した新規型別法の判別能力はそれほど高くなく，東アジア地域ではSNP分析で同じ型の結核菌が広まっていることが明らかになった。しかし，本法で解析を行うことで，院内感染や集団感染疑い事例において，現在利用されているVNTR法より短時間で関連の否定が可能となる場合（対象株同士の遺伝系統が異なった場合など）があると考えられる。また，本SNP法とVNTR法を組み合わせた型別を行うことで，手間のかかかるVNTR法の分析座位数を減らすことが将来可能となると考えられる。 B このように新規の型別法を含めて複数の手法を組み合わせることで，全体として型別法の簡便化・迅速化等を図り，今後，実地疫学の現場で結核菌型別が容易に利用できる環境を作る必要があると考えられる。（4月より　北海道薬科大学薬学部生命科学分野　所属） 5 / 2015 複十字 No.362 15