PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ELISA für in vitro Nachweis des Virusantigens und von Antikörper der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD) in Ohrstanzproben vom Rind Packung mit 10 Platten für 900 Proben ©Prionics AG Gebrauchsinformation Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 17c TierSG zugelassen Version 2.4_d Einführung Infektionen mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD) verursachen jährlich große ökonomische Verluste in der Rinderindustrie. Zusätzlich hat BVDV eine negative Auswirkung auf die Tiergesundheit. Der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ist speziell entwickelt worden um persistent infizierte (PI) Tiere mit einer sehr hohen Spezifität aufzuspüren. Der Test weist verschiedene untergeordnete Typen des BVDV (Ia, Ib und II) Antigens in Ohrstanzproben vom Rind nach. Der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus Test kann zur Diagnose von BVDV Infektionen an einzelnen Tieren angewendet werden. Außerdem ist der Test ein geeignetes Mittel in groß angelegten Screenings- und Ausrottungsprogrammen. Der diagnostische Nachweis von persistent BVDVinfizierten Rindern kann durch die Aufnahme von BVDV-Antikörperhaltigem Kolostrum beeinträchtigt sein (Diagnostische Lücke). Aus diesem Grund darf der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus Test nur bei Tieren, die zum Zeitpunkt der Probennahme älter als 90 Tage sind, angewendet werden. vor und der zweite mAk wird als Konjugat verwendet. Zum Antigennachweis werden unverdünnte Gewebeproben vom Ohr gleichzeitig mit Puffer in den Wells der beschichteten Platte inkubiert. Auf diesen Inkubationsschritt folgt ein Waschschritt. Anschließend wird die Gebrauchsverdünnung des Meerrettichperoxidase-Konjugats zugegeben und nach einer Inkubationszeit folgt ein zweiter Waschschritt. Im daran anschließenden Schritt wird Chromogen (TMB) Substrat in die Wells zugegeben und nach Inkubation wird die Farbentwicklung gestoppt und die optische Dichte bei 450 nm gemessen. Sind BVDV-Antigene in der Probe vorhanden, so binden sie sich während der ersten Inkubationszeit an die BVDV-spezifischen monoklonalen Antikörper in der Beschichtung. Anschließend werden die Platten gewaschen und mit Meerrettichperoxidase konjugierten BVDV-spezifischen monoklonalen Antikörpern inkubiert (mAk gegen ein anderes Epitop von NS-3). Dann wird das gebundene Konjugat, und somit das BVDV-Antigen der Probe, durch Zugabe eines Chromogen (TMB) Substrats sichtbar gemacht. Ist die Probe positiv, so wird eine Farbentwicklung sichtbar. Ist die Probe negativ, so findet keine Farbentwicklung statt. Testprinzip Komponenten des Testkits Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C auf bewahrt werden. Siehe Kit-Etikett für jeweiliges Verfallsdatum. Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder wieder hergestellter Komponenten ist nachstehend gegebenenfalls vermerkt. Chemische Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang II) vor. Haltbarkeit der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C. Komponente 8 Referenz 1 (Lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 2,0 ml Referenz 1. Haltbarkeit von rekonstituierter Referenz 1: bis Verfallsdatum bei -20°C. Komponente 9 Referenz 2 (Lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 2,0 ml Referenz 2. Haltbarkeit von rekonstituierter Referenz 2: bis Verfallsdatum bei -20°C. Komponente 10 Referenz 3 (Lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 2,0 ml Referenz 3. Haltbarkeit von rekonstituierter Referenz 3: bis Verfallsdatum bei -20°C. Komponente 11 Chromogen (TMB) Substrat (Gebrauchsfertig) Zwei Fläschchen, jedes Fläschchen enthält 60 ml Chromogen (TMB) Substrat. Komponente 12 Stopplösung (Gebrauchsfertig) Zwei Fläschchen, jedes enthält 60 ml Stopplösung. Weitere Kitkomponenten: - Gebrauchsinformation - 20 Abdeckfolien um die Streifen während der Inkubation abzudecken Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte Komponente 1 Testplatte Zehn Streifentestplatten. Allgemein: Laborausrüstung gemäß den nationalen Sicherheitsvorschriften. Komponente 2 Extraktionspuffer (Gebrauchsfertig) Vier Fläschchen, jedes enthält 60 ml Extraktionspuffer Analysenergebnisse: Plattenleser, z.B. Multiscan EX oder Gleichwertigen. Der Leser muss einen geeigneten Filtersatz haben um die Platten bei 450 nm ablesen zu können. Komponente 3 Extraktionspuffer Zusatzmittel (Lyophilisiert) Vier Fläschchen, jedes Fläschchen enthält Extraktionspuffer Zusatzmittel für ein Fläschchen Extraktionspuffer. Haltbarkeit der Extraktionslösung: 1 Monat bei 5±3°C. Komponente 4 Konjugat (30x) Zwei Fläschchen, jedes enthält 2,5 ml Konjugat. Verdünntes Konjugat ist nicht stabil, kurz vor der Verwendung zubereiten. Komponente 5 Konjugatpuffer (Gebrauchsfertig) Vier Fläschchen, jedes enthält 60 ml Konjugatpuffer. Komponente 6 Verdünnungspuffer (Gebrauchsfertig) Zwei Fläschchen, jedes enthält 60 ml Verdünnungspuffer. Der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ELISA verwendet zwei monoklonale Antikörper (mAk). Die zwei mAk erkennen unterschiedliche Epitope auf dem hoch konservierten NS-3 Nichtstrukturprotein (P80) von BVDV. Ein mAk liegt als Beschichtung auf der Platte Nur für in-vitro Veterinärdiagnostik Bei at 5±3°C lagern Produkt-Nr.:7610140 Für Deutschland: Zulassungsnummer FLI-B 465 Komponente 7 Waschpuffer (200x) (200x, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer. Optional: Plattenwascher, z.B. ELx405UV oder Gleichwertiges Liquid-Handler, z.B. BeckmanCoulter Biomek NXp Span-8 oder Gleichwertigen. Ablauf des Tests Vorsichtsmaßnahmen Beim Arbeiten mit Tierproben müssen Nationale Richtlinien streng befolgt werden. PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus muss in für diesen Zweck geeigneten Laboratorien durchgeführt werden. Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell kontaminiert erachtet werden. Chemische Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang II) vor. Hinweise: Um optimale Ergebnisse mit PrioCHECK® BVDV PIfocus zu erhalten, müssen folgende Hinweise beachtet werden: 1 PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus Das Protokoll des Testverfahrens muss streng eingehalten werden. Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22±3°C) gebracht werden. Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden. Für jedes Reagenz müssen eigene Lösungsmittelbehälter verwendet werden. Kitkomponenten dürfen nach ihrem Verfallsdatum, oder wenn Änderungen in ihrem Aussehen festgestellt werden, nicht mehr verwendet werden. Kitkomponenten verschiedener KitChargennummern dürfen nicht zusammen verwendet werden. Demineralisiertes Wasser oder Gleichwertiges für den Test verwenden. Es sollten nur durch Trocknung gut konservierte, frische Ohrstanzproben getestet werden. Mazerniertes Gewebe sollte für den Test nicht verwendet werden. VOREBEREITUNG DER LÖSUNGEN FÜR DIE PROBENEXTRAKTION Extraktionslösung Fläschchen auf 22±3°C bringen und das Extraktionspuffer Zusatzmittel (Komponente 3) mit Extraktionspuffer (Komponente 2) rekonstituieren. Überführe den gesamten Inhalt eines Fläschchens mit Extraktionspuffer Zusatzmittel in ein Fläschchen Extraktionspuffer. Haltbarkeit der Extraktionslösung: 1 Monat bei 5±3°C. INKUBATION DER PROBEN Antigennachweis: 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 INKUBATION MIT KONJUGAT 3.1 3.2 3.3 3.4 ZUBEREITUNGSSCHRITTE 1.2 1.3 Die Ohrstanzprobe vom Probenbehälter in eine Deepwell-Platte übertragen. 200 μl Extraktionlösung in die Deepwell-Platte geben. Über Nacht inkubieren (12-18 Stunden) bei 22±3°C. 4.2 4.3 4.4 4.5 VORBEREITUNG DER LÖSUNGEN Konjugatverdünnung Konjugat (30x) (Komponente 4) 1/30 in Konjugatpuffer (Komponente 5) verdünnen; (z.B. 12 ml für 1 Platte zubereiten (Zugabe von 400 μl Konjugat (30x) zu 11,6 ml Konjugatpuffer). Hinweis: Das verdünnte Konjugat muss kurz vor Verwendung angefertigt werden. Waschlösung Waschpuffer (200x) (Komponente 7) 1/200 in demineralisiertem Wasser verdünnen. Die Menge an Waschpuffer reicht aus um ein Endvolumen von 12 Liter Waschlösung herzustellen. Stabilität der Waschlösung 1 Woche, Lagerung bei 22±3°C. Zu Beachten: Es können kommerzielle ELISAWashers verwendet werden. Falls nicht verfügbar können die Testplatten durch Zugabe von wenigstens 200 μl Waschlösung in jedes Well der Testplatte gewaschen werden. Anschließend die Testplatte ausleeren und so oft wie vorgeschrieben wiederholen. Es besteht keine Notwendigkeit die Testplatte zwischen dem Waschen einzuweichen. Testplatte nach dem letzten Waschschritt fest ausklopfen. Referenz 1 - 3 Fläschchen auf 22±3°C bringen und die Referenz 1-3 (Komponenten 8-10) mit 2,0 ml Verdünnungspuffer Komponente 6) rekonstituieren1. Die wieder hergestellten Referenzen können in Portionen zu 150 μl bei -20°C bis zum Verfallsdatum gelagert werden. Testplatte ausleeren und 6 mal mit Waschlösung waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen. 100 μl des Chromogen (TMB) Substrat (Komponente 11) in jedes Well zugeben. Die Testplatte für 15 bis 25 Minuten bei 22±3°C inkubieren. 100 μl der Stopplösung (Komponente 12) in jedes Well zugeben. Inhalt der einzelnen Wells auf der Testplatte durchmischen. Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 15 bis 25 Minuten nach dem Befüllen des ersten Wells mit Chromogen (TMB) Substrat beginnen. Die Stopplösung in derselben Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit wie das Chromogen (TMB) Substrat zugeben. MESSEN DES TESTS UND BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 Die optische Dichte (OD) der Wells bei 450 nm innerhalb von 20 Minuten nach Beendung der Farbentwicklung messen. Die mittlere OD450 der Wells E1 und F1 (=ODBlindwert) berechnen. Die korrigierten OD450 aller Wells durch subtrahieren des ODBlindwert berechnen. Den Mittelwert der korrigierten OD450 der Wells A1 und B1 (= korrigerter ODmax) berechnen. Die prozentuale Positivität (PP) der Referenz 2 und der Proben gemäß nachstehender Formel berechnen. Korrigierte OD450 Probe PP = -------------------------------------------- x 100% korrigerte ODmax Hinweis : Die korrigierten OD450 Werte aller Proben werden als prozentuale Inhibition (PI) im Verhältnis zum korrigierten mittleren OD450 der Wells A1 und B1 (=korrigierter ODmax) ausgedrückt. AUSWERTUNG DES ERGEBNIS Validierungskriterien BVDV-Ag Test 6.1 1 Wieder herstellen des lyophilisierten Materials muss wie folgt durchgeführt werden: - Fläschchen auf 22±3°C bringen. - Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des Fläschchens befindet. - Fläschchen vorsichtig öffnen. - Angegebene Menge an Verdünnungspuffer zufügen (Komponente 6). - Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und warten bis sich lyophilisiertes Material aufgelöst hat. Testplatte ausleeren und 6 mal mit Waschlösung waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen. 100 μl des verdünnten Konjugats in alle Wells zugeben. Testplatte abdecken. Die Testplatte für 60±10 Minuten bei 22±3°C inkubieren. INKUBATION MIT CHROMOGEN (TMB) SUBSTRAT 4.1 1.1 Jeden Streifen der Testplatte (Komponente 1) mit einem Markierstift beschriften. 50 μl Verdünnungspuffer (Komponente 6) in alle Wells zugeben. 50 μl von Referenz 1 in die Wells A1 und B1 zugeben. 50 μl von Referenz 2 in die Wells C1 und D1 zugeben. 50 μl von Referenz 3 in die Wells E1 und F1 zugeben (= ODBlindwert). 50 μl der Proben in die restlichen Wells zugeben. Testplatte abdecken und leicht schütteln. Für 60±10 Minuten bei 22±3°C inkubieren. - Die mittlere OD450 von Referenz 3 (= ODBlindwert) muss ≤ 0,300 sein. 6.2 6.3 Die korrigierte OD450 von Referenz 1 muss ≥ 0,800 sein. Die prozentuale Positivität von Referenz 2 muss < 30% sein. Werden diese Kriterien nicht erfüllt, so ist die Patte ungültig. Hinweis: Wenn die korrigierte ODmax unter 0,800 liegt, ist das Chromogen (TMB) Substrat vermutlich zu kalt. In diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C erwärmen oder bis zu 30 Minuten inkubieren. Auswertung des BVDV-Ag Test PP = ≥ 20 % (Positiv) BVDV-Antigen ist in der Probe anwesend. PP = < 20 % (Negativ) Kein nachweisbares Antigen in der Probe anwesend. Hinweis: PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ist ein hochspezifischer Test für den Nachweis von PI-Tieren. Gibt es jedoch einen Zweifel am Status eines wertvollen Lebendtiers, das positiv getestet wurde, muss eine weitere Probe, die 2-3 Wochen (ELISA) oder 6 Wochen (PCR/NASBA) nach der ursprünglichen Probe genommen wurde, erneut getestet werden, um die persistente Infektion zu bestätigen. Anhang I Hinweis Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Inhalte der Gebrauchsinformation bedürfen in Deutschland der Genehmigung durch das Friedrich-Loeffler Institut (FLI). Prionics AG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der Benutzung dieses Handbuches ergeben. Haftbarkeit Prionics AG garantiert, dass seine Produkte die entsprechende veröffentlichte Spezifikation erfüllen, wenn sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Anleitungen verwendet werden und innerhalb der angegebenen Produktlebensdauer. Prionics AG gibt keine andere Garantie, weder ausdrücklich noch stillschweigend. Das Unternehmen übernimmt keinerlei Garantie hinsichtlich der Marktgängigkeit und Eignung seiner Waren für einen besonderen Zweck. Die hier erteilte Garantie und die Daten, Spezifikationen und Beschreibungen der Produkte der Prionics AG, die in den von Prionics AG herausgegebenen Katalogen und in Informationen zum Produkt auftauchen kann nicht verändert werden, außer durch ausdrückliche schriftliche Zustimmung durch ein Vorstandsmitglied der Prionics AG. Mündliche oder schriftliche Informationen, die nicht mit dieser Garantie übereinstimmen, oder falls sie weitergegeben werden, sind nicht genehmigt, und falls sie gegeben werden, sind sie nicht gültig. Bei Auftreten eines Defektes, der im Rahmen der vorstehenden Garantiebestimmungen gedeckt ist, besteht für Prionics AG nur die Verpflichtung, wahlweise das entsprechende Produkt oder Teile hiervon zu reparieren oder zu ersetzen, wobei es im Ermessen von Prionics AG liegt, ob das Produkt ersetzt oder repariert wird. Dem Kunde obliegt es Prionics AG rechtzeitig über das Auftreten eines solchen Defektes zu informieren. Wenn Prionics AG das Produkt oder ein Teil davon nicht innerhalb einer angemessenen Frist reparieren oder ersetzen kann, wird Prionics AG den Kaufpreis für das Produkt oder dessen Teil zurückerstatten. Soweit im Rahmen des anwendbaren Rechts zulässig, ist Prionics AG nicht ersatzpflichtig für direkte, indirekte, spezifische, beiläufige oder Folgeschäden durch Verlust oder Beschädigung infolge der Verwendung seiner Produkte. Prionics AG und Prionics Lelystad B.V. sind nach ISO 9001:2008 zertifizierte Gesellschaften. Fläschchen leicht schütteln, damit sich restliches trockenes Material auflöst. Material vor dem Gebrauch mindestens 15 Minuten bei 22±3°C stehen lassen. Vorsichtig und mit Unterbrechungen vermischen (Schaumbildung vermeiden). 2 PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus Anhang II Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze Nationale Sicherheitsvorschriften müssen strikt eingehalten werden. R&S Sätze Komponente 1 Testplatte Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 2 Extraktionspuffer (Gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Antragsteller und Vertreiberfirma Prionics Deutschland GmbH Hans-Urmiller-Ring 17a 82515 Wolfratshausen Deutschland Tel: +49(0)8171 99 747 0 Fax: +49(0)8171 99 747 19 Prionics AG Wagistrasse 27a CH-8952 Schlieren-Zürich Schweiz Tel. +41 44 200 2000 Fax +41 44 200 2010 www.prionics.com [email protected] Unsere Distributoren-Kontakte finden Sie unter: www.prionics.com Komponente 3 Extraktionspuffer Zusatzmittel (Lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 4 Konjugat (30x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 5 Konjugatpuffer (Gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 6 Probenverdünner (Gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 7 Waschpuffer (200x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 8 Referenz 1 (Lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 9 Referenz 2 (Lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 10 Referenz 3 (Lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 11 Chromogen (TMB) Substrat (Gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. C; Ätzend Komponente 12 Stopplösung (Gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: R35: Verursacht schwere Verätzungen. S26: Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). Kontakt Prionics Lelystad B.V. Platinastraat 33 P.O. Box 2271 8203 AG Lelystad Niederlande Tel. +31 320 714000 Fax +31 320 714029 3
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