PrioCHECK BVDV Ag PI - Thermo Fisher Scientific

PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus
ELISA für in vitro Nachweis des Virusantigens und von Antikörper der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD) in Ohrstanzproben
vom Rind
Packung mit 10 Platten für 900 Proben
©Prionics AG
Gebrauchsinformation
Die deutsche Gebrauchsinformation ist
nach § 17c TierSG zugelassen
Version 2.4_d
Einführung
Infektionen mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe
(BVD) verursachen jährlich große ökonomische
Verluste in der Rinderindustrie. Zusätzlich hat BVDV
eine negative Auswirkung auf die Tiergesundheit.
Der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ist speziell
entwickelt worden um persistent infizierte (PI) Tiere mit
einer sehr hohen Spezifität aufzuspüren. Der Test
weist verschiedene untergeordnete Typen des BVDV
(Ia, Ib und II) Antigens in Ohrstanzproben vom Rind
nach.
Der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus Test kann zur
Diagnose von BVDV Infektionen an einzelnen Tieren
angewendet werden. Außerdem ist der Test ein
geeignetes Mittel in groß angelegten Screenings- und
Ausrottungsprogrammen.
Der diagnostische Nachweis von persistent BVDVinfizierten Rindern kann durch die Aufnahme von
BVDV-Antikörperhaltigem Kolostrum beeinträchtigt
sein (Diagnostische Lücke). Aus diesem Grund darf
der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus Test nur bei Tieren,
die zum Zeitpunkt der Probennahme älter als 90 Tage
sind, angewendet werden.
vor und der zweite mAk wird als Konjugat verwendet.
Zum
Antigennachweis
werden
unverdünnte
Gewebeproben vom Ohr gleichzeitig mit Puffer in den
Wells der beschichteten Platte inkubiert. Auf diesen
Inkubationsschritt folgt ein Waschschritt. Anschließend
wird die Gebrauchsverdünnung des Meerrettichperoxidase-Konjugats zugegeben und nach einer
Inkubationszeit folgt ein zweiter Waschschritt. Im
daran anschließenden Schritt wird Chromogen (TMB)
Substrat in die Wells zugegeben und nach Inkubation
wird die Farbentwicklung gestoppt und die optische
Dichte bei 450 nm gemessen.
Sind BVDV-Antigene in der Probe vorhanden, so
binden sie sich während der ersten Inkubationszeit an
die BVDV-spezifischen monoklonalen Antikörper in der
Beschichtung. Anschließend werden die Platten
gewaschen
und
mit
Meerrettichperoxidase
konjugierten
BVDV-spezifischen
monoklonalen
Antikörpern inkubiert (mAk gegen ein anderes Epitop
von NS-3). Dann wird das gebundene Konjugat, und
somit das BVDV-Antigen der Probe, durch Zugabe
eines Chromogen (TMB) Substrats sichtbar gemacht.
Ist die Probe positiv, so wird eine Farbentwicklung
sichtbar. Ist die Probe negativ, so findet keine
Farbentwicklung statt.
Testprinzip
Komponenten des Testkits
Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C auf
bewahrt werden. Siehe Kit-Etikett für jeweiliges
Verfallsdatum. Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter
oder
wieder
hergestellter
Komponenten
ist
nachstehend gegebenenfalls vermerkt. Chemische
Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang II) vor.
Haltbarkeit der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.
Komponente 8
Referenz 1 (Lyophilisiert)
Ein Fläschchen enthält 2,0 ml Referenz 1.
Haltbarkeit von rekonstituierter Referenz 1: bis
Verfallsdatum bei -20°C.
Komponente 9
Referenz 2 (Lyophilisiert)
Ein Fläschchen enthält 2,0 ml Referenz 2.
Haltbarkeit von rekonstituierter Referenz 2: bis
Verfallsdatum bei -20°C.
Komponente 10
Referenz 3 (Lyophilisiert)
Ein Fläschchen enthält 2,0 ml Referenz 3.
Haltbarkeit von rekonstituierter Referenz 3: bis
Verfallsdatum bei -20°C.
Komponente 11
Chromogen (TMB) Substrat (Gebrauchsfertig)
Zwei Fläschchen, jedes Fläschchen enthält 60 ml
Chromogen (TMB) Substrat.
Komponente 12
Stopplösung (Gebrauchsfertig)
Zwei Fläschchen, jedes enthält 60 ml Stopplösung.
Weitere Kitkomponenten:
- Gebrauchsinformation
- 20 Abdeckfolien um die Streifen während der
Inkubation abzudecken
Zusätzlich benötigte Materialien und
Geräte
Komponente 1
Testplatte
Zehn Streifentestplatten.
Allgemein:
Laborausrüstung gemäß den nationalen
Sicherheitsvorschriften.
Komponente 2
Extraktionspuffer (Gebrauchsfertig)
Vier Fläschchen, jedes enthält 60 ml Extraktionspuffer
Analysenergebnisse:
Plattenleser, z.B. Multiscan EX oder Gleichwertigen.
Der Leser muss einen geeigneten Filtersatz haben um
die Platten bei 450 nm ablesen zu können.
Komponente 3
Extraktionspuffer Zusatzmittel (Lyophilisiert)
Vier Fläschchen, jedes Fläschchen enthält
Extraktionspuffer Zusatzmittel für ein Fläschchen
Extraktionspuffer.
Haltbarkeit der Extraktionslösung: 1 Monat bei 5±3°C.
Komponente 4
Konjugat (30x)
Zwei Fläschchen, jedes enthält 2,5 ml Konjugat.
Verdünntes Konjugat ist nicht stabil, kurz vor der
Verwendung zubereiten.
Komponente 5
Konjugatpuffer (Gebrauchsfertig)
Vier Fläschchen, jedes enthält 60 ml Konjugatpuffer.
Komponente 6
Verdünnungspuffer (Gebrauchsfertig)
Zwei Fläschchen, jedes enthält 60 ml
Verdünnungspuffer.
Der PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ELISA verwendet
zwei monoklonale Antikörper (mAk). Die zwei mAk
erkennen unterschiedliche Epitope auf dem hoch
konservierten NS-3 Nichtstrukturprotein (P80) von
BVDV. Ein mAk liegt als Beschichtung auf der Platte
Nur für in-vitro Veterinärdiagnostik
Bei at 5±3°C lagern
Produkt-Nr.:7610140
Für Deutschland: Zulassungsnummer FLI-B 465
Komponente 7
Waschpuffer (200x)
(200x, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein Fläschchen
enthält 60 ml Waschpuffer.
Optional:
Plattenwascher, z.B. ELx405UV oder
Gleichwertiges
Liquid-Handler, z.B. BeckmanCoulter
Biomek NXp Span-8 oder Gleichwertigen.
Ablauf des Tests
Vorsichtsmaßnahmen
Beim Arbeiten mit Tierproben müssen Nationale
Richtlinien streng befolgt werden. PrioCHECK® BVDV
Ag PIfocus muss in für diesen Zweck geeigneten
Laboratorien
durchgeführt
werden.
Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet
werden und alle mit den Proben in Berührung
kommenden Gegenstände als potentiell kontaminiert
erachtet werden.
Chemische Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt
„Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang
II) vor.
Hinweise: Um optimale Ergebnisse mit PrioCHECK®
BVDV PIfocus zu erhalten, müssen folgende Hinweise
beachtet werden:
1
PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Das Protokoll des Testverfahrens muss
streng eingehalten werden.
Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch
auf Raumtemperatur (22±3°C) gebracht werden.
Pipettenspitzen müssen nach jedem
Pipettierschritt gewechselt werden.
Für jedes Reagenz müssen eigene
Lösungsmittelbehälter verwendet werden.
Kitkomponenten dürfen nach ihrem
Verfallsdatum, oder wenn Änderungen in ihrem
Aussehen festgestellt werden, nicht mehr
verwendet werden.
Kitkomponenten verschiedener KitChargennummern dürfen nicht zusammen
verwendet werden.
Demineralisiertes Wasser oder Gleichwertiges
für den Test verwenden.
Es sollten nur durch Trocknung gut konservierte,
frische Ohrstanzproben getestet werden.
Mazerniertes Gewebe sollte für den Test nicht
verwendet werden.
VOREBEREITUNG DER LÖSUNGEN FÜR DIE
PROBENEXTRAKTION
Extraktionslösung
Fläschchen auf 22±3°C bringen und das
Extraktionspuffer Zusatzmittel (Komponente 3) mit
Extraktionspuffer (Komponente 2) rekonstituieren.
Überführe den gesamten Inhalt eines Fläschchens mit
Extraktionspuffer Zusatzmittel in ein Fläschchen
Extraktionspuffer.
Haltbarkeit der Extraktionslösung: 1 Monat bei 5±3°C.
INKUBATION DER PROBEN
Antigennachweis:
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
INKUBATION MIT KONJUGAT
3.1
3.2
3.3
3.4
ZUBEREITUNGSSCHRITTE
1.2
1.3
Die Ohrstanzprobe vom Probenbehälter in eine
Deepwell-Platte übertragen.
200 μl Extraktionlösung in die Deepwell-Platte
geben.
Über Nacht inkubieren (12-18 Stunden) bei
22±3°C.
4.2
4.3
4.4
4.5
VORBEREITUNG DER LÖSUNGEN
Konjugatverdünnung
Konjugat (30x) (Komponente 4) 1/30 in Konjugatpuffer
(Komponente 5) verdünnen; (z.B. 12 ml für 1 Platte
zubereiten (Zugabe von 400 μl Konjugat (30x) zu 11,6
ml Konjugatpuffer).
Hinweis: Das verdünnte Konjugat muss kurz vor
Verwendung angefertigt werden.
Waschlösung
Waschpuffer (200x) (Komponente 7) 1/200 in
demineralisiertem Wasser verdünnen. Die Menge an
Waschpuffer reicht aus um ein Endvolumen von 12
Liter Waschlösung herzustellen.
Stabilität der Waschlösung 1 Woche, Lagerung bei
22±3°C.
Zu Beachten: Es können kommerzielle ELISAWashers verwendet werden. Falls nicht verfügbar
können die Testplatten durch Zugabe von wenigstens
200 μl Waschlösung in jedes Well der Testplatte
gewaschen werden. Anschließend die Testplatte
ausleeren und so oft wie vorgeschrieben wiederholen.
Es besteht keine Notwendigkeit die Testplatte
zwischen dem Waschen einzuweichen. Testplatte
nach dem letzten Waschschritt fest ausklopfen.
Referenz 1 - 3
Fläschchen auf 22±3°C bringen und die Referenz 1-3
(Komponenten 8-10) mit 2,0 ml Verdünnungspuffer
Komponente
6)
rekonstituieren1.
Die
wieder
hergestellten Referenzen können in Portionen zu 150
μl bei -20°C bis zum Verfallsdatum gelagert werden.
Testplatte ausleeren und 6 mal mit Waschlösung
waschen. Die Platte nach dem letzten
Waschzyklus fest ausklopfen.
100 μl des Chromogen (TMB) Substrat
(Komponente 11) in jedes Well zugeben.
Die Testplatte für 15 bis 25 Minuten bei 22±3°C
inkubieren.
100 μl der Stopplösung (Komponente 12) in
jedes Well zugeben.
Inhalt der einzelnen Wells auf der Testplatte
durchmischen.
Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 15 bis 25
Minuten nach dem Befüllen des ersten Wells mit
Chromogen (TMB) Substrat beginnen. Die
Stopplösung in derselben Reihenfolge und mit der
gleichen Geschwindigkeit wie das Chromogen (TMB)
Substrat zugeben.
MESSEN DES TESTS UND BERECHNUNG DER
ERGEBNISSE
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
Die optische Dichte (OD) der Wells bei 450 nm
innerhalb von 20 Minuten nach Beendung der
Farbentwicklung messen.
Die mittlere OD450 der Wells E1 und F1
(=ODBlindwert) berechnen.
Die korrigierten OD450 aller Wells durch
subtrahieren des ODBlindwert berechnen.
Den Mittelwert der korrigierten OD450 der Wells
A1 und B1 (= korrigerter ODmax) berechnen.
Die prozentuale Positivität (PP) der Referenz 2
und der Proben gemäß nachstehender Formel
berechnen.
Korrigierte OD450 Probe
PP = -------------------------------------------- x 100%
korrigerte ODmax
Hinweis : Die korrigierten OD450 Werte aller Proben
werden als prozentuale Inhibition (PI) im Verhältnis
zum korrigierten mittleren OD450 der Wells A1 und B1
(=korrigierter ODmax) ausgedrückt.
AUSWERTUNG DES ERGEBNIS
Validierungskriterien BVDV-Ag Test
6.1
1
Wieder herstellen des lyophilisierten Materials muss wie folgt durchgeführt
werden:
- Fläschchen auf 22±3°C bringen.
- Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen
um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des
Fläschchens befindet.
- Fläschchen vorsichtig öffnen.
- Angegebene Menge an Verdünnungspuffer zufügen (Komponente 6).
- Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und warten bis sich
lyophilisiertes Material aufgelöst hat.
Testplatte ausleeren und 6 mal mit Waschlösung
waschen. Die Platte nach dem letzten
Waschzyklus fest ausklopfen.
100 μl des verdünnten Konjugats in alle Wells
zugeben.
Testplatte abdecken.
Die Testplatte für 60±10 Minuten bei 22±3°C
inkubieren.
INKUBATION MIT CHROMOGEN (TMB) SUBSTRAT
4.1
1.1
Jeden Streifen der Testplatte (Komponente 1)
mit einem Markierstift beschriften.
50 μl Verdünnungspuffer (Komponente 6) in alle
Wells zugeben.
50 μl von Referenz 1 in die Wells A1 und B1
zugeben.
50 μl von Referenz 2 in die Wells C1 und D1
zugeben.
50 μl von Referenz 3 in die Wells E1 und F1
zugeben (= ODBlindwert).
50 μl der Proben in die restlichen Wells
zugeben.
Testplatte abdecken und leicht schütteln.
Für 60±10 Minuten bei 22±3°C inkubieren.
-
Die mittlere OD450 von Referenz 3 (= ODBlindwert)
muss ≤ 0,300 sein.
6.2
6.3
Die korrigierte OD450 von Referenz 1 muss
≥ 0,800 sein.
Die prozentuale Positivität von Referenz 2 muss
< 30% sein.
Werden diese Kriterien nicht erfüllt, so ist die Patte
ungültig.
Hinweis: Wenn die korrigierte ODmax unter 0,800
liegt, ist das Chromogen (TMB) Substrat vermutlich zu
kalt. In diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C
erwärmen oder bis zu 30 Minuten inkubieren.
Auswertung des BVDV-Ag Test
PP = ≥ 20 %
(Positiv)
BVDV-Antigen ist in der Probe anwesend.
PP = < 20 %
(Negativ)
Kein nachweisbares Antigen in der Probe anwesend.
Hinweis: PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus ist ein
hochspezifischer Test für den Nachweis von PI-Tieren.
Gibt es jedoch einen Zweifel am Status eines
wertvollen Lebendtiers, das positiv getestet wurde,
muss eine weitere Probe, die 2-3 Wochen (ELISA)
oder
6
Wochen
(PCR/NASBA)
nach
der
ursprünglichen Probe genommen wurde, erneut
getestet werden, um die persistente Infektion zu
bestätigen.
Anhang I
Hinweis
Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und
richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Inhalte der
Gebrauchsinformation bedürfen in Deutschland der
Genehmigung durch das Friedrich-Loeffler Institut
(FLI). Prionics AG haftet keinesfalls für Neben- oder
Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder in
der Folge der Benutzung dieses Handbuches
ergeben.
Haftbarkeit
Prionics AG garantiert, dass seine Produkte die
entsprechende veröffentlichte Spezifikation erfüllen,
wenn sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden
Anleitungen verwendet werden und innerhalb der
angegebenen Produktlebensdauer. Prionics AG gibt
keine andere Garantie, weder ausdrücklich noch
stillschweigend.
Das
Unternehmen
übernimmt
keinerlei Garantie hinsichtlich der Marktgängigkeit und
Eignung seiner Waren für einen besonderen Zweck.
Die hier erteilte Garantie und die Daten,
Spezifikationen und Beschreibungen der Produkte der
Prionics AG, die in den von Prionics AG
herausgegebenen Katalogen und in Informationen
zum Produkt auftauchen kann nicht verändert werden,
außer durch ausdrückliche schriftliche Zustimmung
durch ein Vorstandsmitglied der Prionics AG.
Mündliche oder schriftliche Informationen, die nicht mit
dieser Garantie übereinstimmen, oder falls sie
weitergegeben werden, sind nicht genehmigt, und falls
sie gegeben werden, sind sie nicht gültig.
Bei Auftreten eines Defektes, der im Rahmen der
vorstehenden Garantiebestimmungen gedeckt ist,
besteht für Prionics AG nur die Verpflichtung,
wahlweise das entsprechende Produkt oder Teile
hiervon zu reparieren oder zu ersetzen, wobei es im
Ermessen von Prionics AG liegt, ob das Produkt
ersetzt oder repariert wird. Dem Kunde obliegt es
Prionics AG rechtzeitig über das Auftreten eines
solchen Defektes zu informieren. Wenn Prionics AG
das Produkt oder ein Teil davon nicht innerhalb einer
angemessenen Frist reparieren oder ersetzen kann,
wird Prionics AG den Kaufpreis für das Produkt oder
dessen Teil zurückerstatten.
Soweit im Rahmen des anwendbaren Rechts zulässig,
ist Prionics AG nicht ersatzpflichtig für direkte,
indirekte, spezifische, beiläufige oder Folgeschäden
durch Verlust oder Beschädigung infolge der
Verwendung seiner Produkte.
Prionics AG und Prionics Lelystad B.V. sind nach ISO
9001:2008 zertifizierte Gesellschaften.
Fläschchen leicht schütteln, damit sich restliches trockenes Material
auflöst.
Material vor dem Gebrauch mindestens 15 Minuten bei 22±3°C stehen
lassen.
Vorsichtig und mit Unterbrechungen vermischen (Schaumbildung
vermeiden).
2
PrioCHECK® BVDV Ag PIfocus
Anhang II
Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze
Nationale Sicherheitsvorschriften müssen strikt
eingehalten werden.
R&S Sätze
Komponente 1
Testplatte
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 2
Extraktionspuffer (Gebrauchsfertig)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Antragsteller und Vertreiberfirma
Prionics Deutschland GmbH
Hans-Urmiller-Ring 17a
82515 Wolfratshausen
Deutschland
Tel: +49(0)8171 99 747 0
Fax: +49(0)8171 99 747 19
Prionics AG
Wagistrasse 27a
CH-8952 Schlieren-Zürich
Schweiz
Tel. +41 44 200 2000
Fax +41 44 200 2010
www.prionics.com
[email protected]
Unsere Distributoren-Kontakte finden Sie unter:
www.prionics.com
Komponente 3
Extraktionspuffer Zusatzmittel (Lyophilisiert)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 4
Konjugat (30x)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 5
Konjugatpuffer (Gebrauchsfertig)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 6
Probenverdünner (Gebrauchsfertig)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 7
Waschpuffer (200x)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 8
Referenz 1 (Lyophilisiert)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 9
Referenz 2 (Lyophilisiert)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 10
Referenz 3 (Lyophilisiert)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
Komponente 11
Chromogen (TMB) Substrat (Gebrauchsfertig)
Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU
Vorschriften klassifiziert.
C; Ätzend
Komponente 12
Stopplösung (Gebrauchsfertig)
Gefahrenklasse:
R35: Verursacht schwere Verätzungen.
S26: Bei Berührung mit den Augen gründlich mit
Wasser abspülen und Arzt konsultieren.
S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung,
Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz
tragen.
S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt
hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen).
Kontakt
Prionics Lelystad B.V.
Platinastraat 33
P.O. Box 2271
8203 AG Lelystad
Niederlande
Tel. +31 320 714000
Fax +31 320 714029
3