PrioCHECK® PPV Ab ELISA für den in vitro Nachweis von Antikörpern gegen das Porzine Parvovirus in Serum von Schweinen Packung für 176 Proben © Prionics AG Gebrauchsinformation Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 17c TierSG zugelassen Version 1.2_d Einführung Das Porzine Parvovirus (PPV) ist ein kleiner Virus mit einsträngiger DNA aus der Familie der Parvoviridae. Der Virus ist ein überall vorkommender Infektionserreger in Schweinen, der die Fortpflanzung in Schweineherden negativ beeinträchtigt und Züchter weltweit wirtschaftlich betrifft. Das Virus kann die Plazenta passieren. Die Folgen einer Infektion mit PPV hängen vom Immunstatus des Muttertiers im Trächtigkeitsstadium bei Auftreten der Infektion ab. Bei nicht-immunen Muttertieren können PPV-Infektionen, die vor dem 35. Tag der Trächtigkeit eintreten, zum Tod des Embryos führen. Nach etwa 70 Tagen, wenn die Föten immunkompetent sind, kann der Schweinefötus durch die Produktion von Antikörper gegen PPV eine Immunreaktion starten und die Infektion überleben. Dies führt im Allgemeinen zur Geburt gesunder, serologisch positiver Ferkel. Der PrioCHECK® PPV Ab weist bereits sieben Tage nach der primären Infektion spezifische Antikörper nach. Der Antikörpertiter erreicht ungefähr 10 Tagen nach der Infektion ein Plateau. Durch Titration paarweiser Serumproben, die aus einer Herde in einem Zeitabstand von mehreren Wochen entnommen wurden, kann der Infektionsstatus überwacht werden. Basierend auf dieser Information können Entscheidungen über die Kontrolle der Infektion durch Impfung getroffen werden. Testprinzip Der PrioCHECK® PPV Ab ELISA ist ein Test mit Einzelverdünnung. Serumproben werden in einer 1:5 Verdünnung gemessen. Die Testseren werden mit PPV-Antigen gemischt, während der folgenden Inkubation bilden spezifische Antikörper, falls vorhanden, einen Immunkomplex mit dem Antigen. Nach dieser Vorinkubation wird die Mischung in eine mit Antikörpern beschichtete Testplatte überführt. Während der anschliessenden Inkubation in der Testplatte, wird vorhandenes freies PPV-Antigen an die mit Antikörper beschichteten Wells gebunden, wohingegen Antigen, das vorher einen Immunkomplex mit Antikörpern des Testserums gebildet hat (= blockiertes Antigen) nicht gebunden wird. Nach dem Wegspülen der ungebundenen Reagenzien gibt man Konjugat zu, welches mit dem gebundenen Antigen reagiert. Nach einer weiteren Inkubation werden die Wells nochmals gewaschen und Chromogen (TMB) Substrat wird zugegeben. Die Farbentwicklung wird nach 15 Minuten gestoppt und bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Komponenten des Testkits Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C auf bewahrt werden. Siehe Kit-Etikett für jeweiliges Verfallsdatum. Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder rekonstituierter Komponenten ist nachstehend gegebenenfalls vermerkt. Chemische Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang II) vor. Komponente 1 Testplatte Zwei Streifen-Testplatten. Komponente 2 Konjugat (30x) (30x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen) Ein Fläschchen enthält 1,5 ml Konjugat. Erst kurz vor Gebrauch verdünnen, die Konjugatverdünnung nicht stabil. Komponente 3 Verdünnungspuffer (5x) (5x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen) Ein Fläschchen enthält 60 ml Verdünnungspuffer. Haltbarkeit der Verdünnungspuffergebrauchslösung: 5 Stunden bei 22±3°C. Komponente 4 Waschpuffer (200x) (200x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer. Haltbarkeit der Waschlösung: eine Woche bei 22±3°C. Komponente 5 Demineralisiertes Wasser Ein Fläschchen enthält 10 ml Demineralisiertes Wasser. Komponente 6 Pferdeserum (lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 3,5 ml lyophilisiertes Pferdeserum. Haltbarkeit des rekonstituierten Pferdeserums: bis zum Verfallsdatum bei -20°C. Komponente 7 Antigen (lyophilisiert) Zwei Fläschchen mit je 6,0 ml lyophilisiertem Antigen. Haltbarkeit des rekonstituierten Antigens: in Portionen bis zum Verfallsdatum bei -20°C. Komponente 8 Referenzserum 1 (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 1,0 ml Referenzserum 1 (Positivkontrolle) Komponente 9 Referenzserum 2 (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 1,0 ml Referenzserum 2 (Negativkontrolle) Komponente 10 Chromogen (TMB) Substrat (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 60 ml Chromogen (TMB) Substrat. Komponente 11 Stopplösung (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 60 ml Stopplösung. Weitere Kitbestandteile: - Gebrauchsinformation - 1 Deckel um die Streifen während der Inkubation abzudecken - Analysenzertifikat Nur für in-vitro Veterinärdiagnostik Bei 5±3°C lagern Produkt-Nr.: 7588981 Für Deutschland: Zulassungsnummer FLI-B Ablauf des Tests Vorsichtsmassnahmen Beim Arbeiten mit Tierproben müssen Nationale ® Richtlinien streng befolgt werden. Der PrioCHECK PPV Ab muss in für diesen Zweck geeigneten Laboratorien durchgeführt werden. Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell kontaminiert erachtet werden. Chemische Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang II) vor. Hinweise Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK® PPV Ab zu erhalten, müssen folgende Hinweise beachtet werden: Das Testverfahren muss streng eingehalten werden. Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22±3°C) gebracht werden. Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden. Für jedes Reagenz müssen eigene Behälter verwendet werden. Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum, oder wenn Änderungen in ihrem Aussehen festgestellt werden, nicht mehr verwendet werden. Kitbestandteile verschiedener Kit-Chargennummern dürfen nicht zusammen verwendet werden. Demineralisiertes Wasser oder Gleichwertiges für den Test verwenden. VORBEREITUNG DER LÖSUNGEN Verdünnungspuffergebrauchslösung Den konzentrierten Verdünnungspuffer (5x) (Komponente 3) in demineralisiertem Wasser 1/5 verdünnen. Stabilität der Verdünnungspuffergebrauchslösung: 5 Stunden bei 22±3°C. Antigen Rekonstituieren1 des Antigens (Komponente 7) mit 6 ml Verdünnungspuffergebrauchslösung. Wird nur ein Teil des Testkits verwendet, muss das Fläschchen mit rekosntituiertem Antigen in Portionen von je 1,0 ml eingeteilt werden (für maximal 6 Testläufe pro Platte). Häufiges Einfrieren und Auftauen vermeiden und das portionierte Antigen in kleinen Fläschchen bei -20°C lagern. Allgemein: Laborausrüstung gemäss den nationalen Sicherheitsvorschriften. Pferdeserum 1 Rekonstituieren des lyophilisierten Pferdeserums (Komponente 6) in 3.5 ml Demineralisiertem Wasser (Komponente 5). Das rekonstituierte Pferdeserum kann bis zum Verfallsdatum bei -20°C aufbewahrt werden. Blindplatten: Blindplatten für die Verdünnung der Testseren und zum vorinkubieren mit dem Antigen, z.Bsp.: UBodenplatten (Greiner, Art.-Nr. 650101). Es können auch andere Platten oder Röhrchen mit geringer unspezifischer Proteinadsorption verwendet werden. Konjugatpuffer Um den Test mit zwei Streifen durchzuführen 1,9 ml Verdünnungspuffergebrauchslösung zu 0,1 ml rekonstituiertem Pferdeserum (Endkonzentration des Pferdeserums beträgt 5% (v/v)) zugeben. Stabilität des Konjugatpuffers: 24 Stunden bei 5±3°C. Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte Inkubation: Microtiterplatten-Inkubator mit Temperaturregelung (mindestens 50°C) Analysenergebnisse: Plattenleser, z.B Multiscan EX oder Gleichwertigen. Der Leser muss einen geeigneten Filtersatz haben um die Platten bei 450 nm ablesen zu können. Optional: Waschgerät, z.B. Tecan EIA Plattform oder Gleichwertiges. 1 - - Rekonstitution der lyophilisierten Reagenzien muss wie folgt durchgeführt werden: Die Fläschchen auf 22±3°C bringen. Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des Fläschchens befindet. Fläschchen öffnen. Angegebene Menge an Demineralisiertem Wasser zufügen. Warten bis sich lyophilisiertes Material aufgelöst hat. Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und das Fläschchen vorsichtig schwenken, damit sich restliches trockenes Material auflöst. Lyophilisiertes Material 15 Minuten bei 22±3°C st ehen lassen. Gelegentlich Fläschchen behutsam umdrehen (Schaumbildung muss vermieden werden). PrioCHECK® PPV Ab Konjugatvedünnung Verdünnen des Konjugats (30x) (Komponente 2) 1/30 in Konjugatpuffer. Um den Test mit zwei Streifen durchzuführen 1,8 ml zubereiten. Hinweis: Die Konjugatverdünnung ist nicht stabil, erst kurz vor Verwendung anfertigen. Hinweis: Es können kommerzielle ELISA-Waschgeräte verwendet werden. Falls diese nicht zur Verfügung stehen können die Platten manuell durch pipettieren von 200 µl bis 300 µl Waschlösung in jedes Well der Platte gewaschen werden. Danach die Platte ausleeren und den Vorgang so oft wie vorgeschrieben wiederholen. Es besteht keine Notwendigkeit die Platte einzuweichen. Die Platten nach dem letzten Waschen fest ausklopfen. VORINKUBATION DER PROBEN UND ANTIGEN 1.1 1.2 1.3 1.4 96 µl Verdünnungspuffergebrauchslösung mit 24 µl Referenzserum 1 (Komponente 8) und 120 µl rekonstituiertem Antigen mischen. 96 µl Verdünnungspuffer mit 24 µl Referenzserum 2 (Komponente 9) und 120 µl rekonstituiertem Antigen mischen. 12 µl jeder Serumprobe mit 48 µl Verdünnungspuffergebrauchslösung und 60 µl rekonstituiertem Antigen mischen. Während 60±5 Minuten bei 37±1°C inkubieren. INKUBATION IN DER TESTPLATTE 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 Jeden Streifen der Testplatte (Komponente 1) mit einem Markierstift beschriften. 100 µl der Verdünnungspuffergebrauchslösung in die Wells A1 und B1 pipettieren. 50 µl der Verdünnungspuffergebrauchslösung in die Wells C1 und D1 pipettieren. 50 µl des rekonstituierten Antigens in die Wells C1 und D1 pipettieren und mischen. 100 µl des Referenzserum 1/Antigen Gemisches in die Wells E1 und F1 pipettieren. 100 µl des Referenzserum 2/Antigen Gemisches in die Wells G1 und H1 pipettieren. 100 µl des Probe/Antigen Gemisches in die verbleibenden Wells pipettieren. Die Testplatte abdecken und während 120±5 Minuten bei 37±1°C inkubieren. INKUBATION MIT KONJUGAT 3.1 3.2 3.3 Die Platte entleeren und 6-mal mit 200 µl bis 300 µl Waschlösung waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen. 100 µl der Konjuagtverdünnung in jedes Well pipettieren. Die Testplatte abdecken und während 60±5 Minuten bei 37±1°C inkubieren. INKUBATION MIT CHROMOGEN (TMB) SUBSTRAT 4.1. Die Testplatte nach der Inkubationszeit entleeren und 6-mal mit 200 µl bis 300 µl Waschlösung waschen. Die Testplatte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen. 4.2 100 µl Chromogen (TMB) Substrat in jedes Well pipettieren. 4.3 Die Testplatte 15 Minuten bei 22±3°C inkubieren. 4.4 100 µl der Stopplösung (Komponente 11) in jedes Well zugeben. 4.5 Inhalte der einzelnen Wells vor dem Messen mischen. Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 15 Minuten nach dem Befüllen des ersten Wells mit Chromogen (TMB) Substrat beginnen. Die Stopplösung in derselben Reihenfolge und Geschwindigkeit zugeben wie das Chromogen (TMB) Substrat. ABLESEN DES TESTS UND BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 5.1 5.2 5.3 5.4 Die optische Dichte (OD) der Wells bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten nach Stoppen der Farbentwicklung messen. Den mittleren OD450-Wert der Wells A1 und B1 (=OD450 Blindwert) berechnen. Den korrigierten OD450-Wert der Referenzseren 1 und 2 und der Serumproben durch Subtrahieren des mittleren OD450-Blindwerts berechnen. Den Mittelwert der korrigierten OD450 der Wells C1 und D1 (=OD450 max) berechnen. 5.5 Die prozentuale Inhibition (PI) wird gemäss nachstehender Formel berechnet: Hinweis: Die korrigierte OD450 aller Proben wird als prozentuale Inhibition (PI) im Verhältnis zur korrigierten mittleren OD450 max ausgedrückt. PI = 100- korrigierte OD450 Testprobe --------------------------------------- x 100 korrigierte OD450 max AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Validitätskriterien 6.1 Die mittlere OD450 der Blindkontrolle (Wells A1 und B1) muss <0,300 sein. 6.2 Die korrigierte OD450 max (Wells C1 und D1) muss >1,000 sein. 6.3 Die PI von Referenzserum 1 (Positivkontrolle) muss >50% sein. 6.4 Die PI von Referenzserum 2 (Negativkontrolle) muss <50% sein. 6.5 Wird eines der Kriterien nicht erfüllt so ist die Platte ungültig. Hinweis: Wenn die korrigierte OD450 max unter 1,000 liegt, ist das Chromogen (TMB) Substrat vermutlich zu kalt. In diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C erwärmen oder bis zu 30 Minuten inkubieren. Wenn die korrigierte mittlere OD450 max über 2,000 liegt wird eine kürzere Inkubationszeit mit dem Chromogen (TMB) Substrat empfohlen. Auswertung der prozentualen Inhibition PI = ≥50% Probe ist positiv auf PPV-spezifische Antikörper. PP = <50% Probe ist negativ auf PPV-spezifische Antikörper. Anhang I Hinweis Diese Packungsbeilage gilt als vollständig und richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Inhalte der Packungsbeilage bedürfen in Deutschland der Genehmigung durch das Friedrich-Loeffler Institut (FLI). Prionics AG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der Benutzung dieses Handbuches ergeben. Haftbarkeit Prionics AG garantiert, dass seine Produkte die entsprechende veröffentlichte Spezifikation erfüllen, wenn sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Anleitungen verwendet werden und innerhalb der angegebenen Produktlebensdauer. Prionics AG gibt keine andere Garantie, weder ausdrücklich noch stillschweigend. Das Unternehmen übernimmt keinerlei Garantie hinsichtlich der Marktgängigkeit und Eignung seiner Waren für einen besonderen Zweck. Die hier erteilte Garantie und die Daten, Spezifikationen und Beschreibungen der Produkte der Prionics AG, die in den von Prionics AG herausgegebenen Katalogen und in Informationen zum Produkt auftauchen kann nicht verändert werden, außer durch ausdrückliche schriftliche Zustimmung durch ein Vorstandsmitglied der Prionics AG. Mündliche oder schriftliche Informationen, die nicht mit dieser Garantie übereinstimmen, oder falls sie weitergegeben werden, sind nicht genehmigt, und falls sie gegeben werden, sind sie nicht gültig. Bei Auftreten eines Defektes, der im Rahmen der vorstehenden Garantiebestimmungen gedeckt ist, besteht für Prionics AG nur die Verpflichtung, wahlweise das entsprechende Produkt oder Teile hiervon zu reparieren oder zu ersetzen, wobei es im Ermessen von Prionics AG liegt, ob das Produkt ersetzt oder repariert wird. Dem Kunden obliegt es Prionics AG rechtzeitig über das Auftreten eines solchen Defektes zu informieren. Wenn Prionics AG das Produkt oder ein Teil davon nicht innerhalb einer angemessenen Frist reparieren oder ersetzen kann, wird Prionics AG den Kaufpreis für das Produkt oder dessen Teil zurückerstatten. Soweit im Rahmen des anwendbaren Rechts zulässig, ist Prionics AG nicht ersatzpflichtig für direkte, indirekte, spezifische, beiläufige oder Folgeschäden durch Verlust oder Beschädigung infolge der Verwendung seiner Produkte. Prionics AG und Prionics Lelystad BV sind nach ISO 9001:2000 zertifizierte Gesellschaften. Anhang II Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze Nationale Sicherheitsvorschriften müssen streng befolgt werden. Komponente 1 Testplatte Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 2 Konjugat (30x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 3 Verdünnungspuffer (5x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 4 Waschpuffer (200x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 5 Demineralisiertes Wasser Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 6 Pferdeserum (lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 7 Antigen (lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 8 Referenzserum 1 (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 9 Referenzserum 2 (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 10 Chromogen (TMB) Substrat (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 11 C; Ätzend Stopplösung (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: R35: Verursacht schwere Verätzungen. S26: Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen) Anhang III Referenzen (1) F. Westenbrink, M.A. Veldhuis und J.M.A. Brinkhof Journal of Virological Methods, 23: (1989) 169, -178. Kontakt Prionics AG Wagistrasse 27a CH-8952 Schlieren-Zurich Switzerland Tel. +41 44 200 2000 Fax +41 44 200 2010 www.prionics.com [email protected] Prionics Lelystad B.V. Platinastraat 33 P.O. Box 2271 NL-8203 AG Lelystad Niederlande Tel: +31 320 714000 Fax: +31 320 714029 Antragsteller und Vertreiberfirma Prionics Deutschland GmbH Hans-Urmiller-Ring 17a 82515 Wolfratshausen Deutschland Tel. +49 (0) 8171 99 747 0 Fax +49 (0) 8171 99 747 19 Unsere Distributoren-Kontakte finden Sie unter: www.prionics.com
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