PrioCHECK® CSFV Ag ELISA für in vitro Nachweis von Antigenen gegen das Virus des klassischen Schweinefiebers in Vollblut, Serum, Plasma und Gewebeproben von Schweinen Packung mit 2 Platten für 180 Proben ©Prionics AG Gebrauchsinformation Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 17c TierSG zugelassen Nur für in-vitro in Veterinärdiagnostik Bei 5±3°C lagern Produkt-Nr.: 7610047 Version 1.2_d Einführung Die frühe Erkennung von CSFV infizierten Schweinen ist von grosser Wichtigkeit um die Verbreitung von CSFV zu verhindern. Da Antikörper aber erst etwa 14 Tage nach eine Infizierung gebildet werden, muss in der frühen Phase der Krankheit ein Nachweis über das Anitgen erfolgen. Der PrioCHECK® CSFV Ag weist genau diese Antigene nach und ist deshalb ideal um CSF in einem frühen ® Stadium zu detktieren. Der PrioCHEK CSFV Ag ist ausgelegt auf die Reduzierung falsch positiver Testergebnisse (hohe Spezifität) bei höchst möglicher ® Sensitivität. Der PrioCHECK CSFV Ag kann verwendet werden um Schweineherden zu untersuchen bei denen Verdacht auf eine CSFV Infektion besteht. In Ländern (Gebieten), in denen CSF verbreitet ist und häufig geimpft wird, kann der Test verwendet werden um verbleibende CSFV-Herde aufzuspüren. Positive Testergebnisse müssen durch einen „Gold“ Standardtest bestätigt werden (z.B. Isolierung des Virus in einer Zellkultur). Testprinzip Der PrioCHECK® CSFV Ag basiert auf dem DoppelAntikörper-Sandwich (DAS) Prinzip. CSFV spezifische Antikörper sind auf Streifen-Platten beschichtet. In einem ersten Schritt wird die Probe (Vollblut, Serum, Plasma, Leukozytenkonzentrat oder Gewebeextrakt) in Probenverdünnungspuffer verdünnt und in der Platte inkubiert. Danach wird die Platte gewaschen und mit einem hochspezifischen anti-CSFV Konjugat inkubiert. Anschliessend wird die Platte erneut gewaschen und das Konjugat wird über das Chromogen (TMB) Substrat nachgewiesen. Nach Zugabe einer Stopplösung ist die Farbreaktion beendet. Die bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessene Farbentwicklung weisst auf das Vorhandensein von Antigenen, welche für klassisches Schweinefieber typischen sind, hin. Komponenten des Testkits Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C aufbewahrt werden.Siehe Kit-Etikette für jeweiliges Verfallsdatum. Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder rekonstituierter Komponenten ist wo nötig nachstehend vermerkt. Chemische Gefahrenhinweise liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze“ (Anhang II) vor. Komponente 1 Testplatte Zwei Streifen-Testplatten. Komponente 2 Konjugat (30x) (30x konzentriert, vor Gebrauch verdünnen) Ein Fläschchen enthält 1,2 ml Konjugat. Erst kurz vor Gebrauch verdünnen; Konjugatverdünnung ist nicht stabil. Komponente 3 Konjugat Verdünnungspuffer (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 60 ml Konjugat Verdünnungspuffer. Komponente 4 Konjugat Additiv (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 6.0 ml Konjugat Additiv. Komponente 5 Demineralisiertes Wasser Ein Fläschchen enthält 10 ml demineralisiertes Wasser. Komponente 6 Waschpuffer (200x) (200x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer. Haltbarkeit der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C. Komponente 7 Proben Verdünnungspuffer (gebrauchsfertig) Zwei Fläschchen, die je 10 ml Proben Verdünnungspuffer enthalten. Komponente 8 Referenzserum 1 (lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 1,5 ml Referenzserum 1 (starke Positivkontrolle). Das Referenzserum 1 muss vor gebrauch rekonstituiert werden. Das rekonstiuierte Referenzserum 1 muss bei -20°C gelagert werden. Komponente 9 Referenzserum 2 (lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 1,5 ml Referenzserum 2 (Blindprobe). Das Referenzserum 2 muss vor gebrauch rekonstituiert werden. Das rekonstiuierte Referenzserum 2 muss bei -20°C gelagert werden. Komponente 10 Referenzserum 3 (lyophilisiert) Ein Fläschchen enthält 1,5 ml Referenzserum 3 (schwache Positivkontrolle). Das Referenzserum 3 muss vor gebrauch rekonstituiert werden. Das rekonstiuierte Referenzserum 3 muss bei -20°C gelagert werden. Komponente 11 Chromogen (TMB) Substrat (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 60 ml Chromogen (TMB) Substrat. Komponente 12 Stopplösung (gebrauchsfertig) Ein Fläschchen enthält 60 ml Stopplösung. Weitere Kitbestandteile: - 1 Deckel um die Streifen während der Inkubation abzudecken - Gebrauchsinformation - Analysezertifikat Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte Allgemein: Laborausrüstung gemäss den nationalen Sicherheitsvorschriften. Auswertung: Platten Fotometer, z.B. Multiscan EX oder gleichwertiges Gerät. Das Fotometer muss mit einem geeigneten Filtersatz ausgerüstet sein um die Absorption bei 450 nm messen zu können. Optional: Plattenwascher, z.B. Tecan EIA Plattform oder gleichwertiges Gerät. Ablauf des Tests Vorsichtsmassnahmen Beim Arbeiten mit Tierproben müssen nationale Richtlinien eingehalten werden. Der PrioCHECK® CSFV Ab muss in Laboratorien durchgeführt werden, die für diesen Zweck geeigneten sind. Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell kontaminiert erachtet werden. Zur Dekontamination kann Halamid (1%), Natriumhydroxid (0,4%) oder Glutaraldehyd (1%) verwendet werden (CSFV Reduktion von 4-5 Log in 6 Minuten). Testproben müssen steril gehalten werden um nachträgliche Bestätigung durch einen Virusisolationstest zu ermöglichen. Chemische Gefahrenhinweise liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze“ (Anhang II) vor. Hinweise ® Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK CSFV Ag zu erhalten, müssen folgende Aspekte beachtet werden: Das Testverfahren muss streng eingehalten werden Alle Reagentien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22±3°C) gebracht werden. Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden. Für jedes Reagenz müssen eigene Behälter verwendet werden. Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum oder bei einer Änderung in ihrem Aussehen nicht mehr verwendet werden. Komponenten von verschiedenen Kit-Chargennummern dürfen nicht gemischt werden Demineralisiertes Wasser oder Wasser gleicher Qualität verwenden. VORBEREITUNG DER LÖSUNGEN Referenzen Die Referenzseren (Komponente 8-10) mit 1.5 ml demineralisiertem Wasser (Komponente 5) rekonstituieren∗. Die rekonstituierten Seren müssen aufgeteilt werden (12 x für maximal 12 Testläufe). Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und Auftauen. Die Haltbarkeit des rekonstituierte Seren bei -20°C entspricht der der lyophilisierten Seren. Konjugatverdünnung Konjugat (30x) (Komponente 2) 1/30 in Konjugat Verdünngspuffer (Komponente 3), der mit 20% Konjugat Additiv versetzt ist, verdünnen; für z.B 2 Streifen wird eine Menge von 2,1 ml benötigt. Hierzu werden 70 µl Konjugat (30x) in 1,63 ml Konjugat Verdünnungspuffer und 400 µl Konjugat Additiv verdünnt. Hinweis: Die Konjugatverdünnung darf erst kurz vor ihrer Verwendung hergestellt werden. Waschlösung Der Waschpuffer (200x) (Komponente 4) muss mit demineralisiertem Wasser 1/200 verdünnt werden. Eine Flache reicht für ein Endvolumen von 12 Liter. Stabilität der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C. Zu Beachten: Das Waschen der Platte nach Inkubationen ist kritisch muss sorgfältig durchgeführt werden. Ein Messwert des Referenzserums 2 von > 0,300 OD ist höchstwahrscheinlich auf mangelhaftes Waschen der Platte zurückzuführen. Beim manuellen Waschen der Platte sind mindestens 6 Waschzyklen nötig. Ein Waschzyklus besteht aus: Befüllen jeder Vertiefung mit 300 µl Waschlösung, die Platte sorgfältig entleeren und wieder befüllen. Bildung von Luftblasen beim Befüllen der Vertiefungen vermeiden. Achten Sie darauf, dass nach dem letzten Waschen die restliche Waschlösung durch Ausklopfen der Testplatte auf einer saugfähiger Unterlage entfernt wird. Wenn OD-Blindwerte von >0,300 bei Verwendung von automatischen Plattenwaschern erhalten werden, dann sollte die Platte manuell gewaschen werden, wie vorstehend beschrieben. Informationen zur Probenvorbereitung und Probenlagerung liegen in Anhang IV vor. * Das Rekonstituieren des lyophilisierten Antigens muss wie folgt durchgeführt werden: Fläschchen auf 22±3°C bringen. Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des Fläschchens befindet. Fläschchen öffnen. Angegebene Menge an demineralisiertem Wassers (Komponente 5) zufügen. Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und das Fläschchen vorsichtig drehen, damit sich das restliche Lyophilisat auflöst. Lyophilisiertes Material 15 Minuten bei 22±3°C la ssen. Gelegentlich Fläschchen sanft umdrehen (Schaumbildung muss vermieden werden). - PrioCHECK® CSFV Ag INKUBATION VON SERUM UND PROBE 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 Jede Testplatte (Komponente 1) mit einem Markierstift beschriften. 50 µL Proben Verdünnungspuffer (Komponente 7) in alle Vertiefungen geben. 50 µl des rekonstituierten Referenzserums 1 in die Vertiefungen A1 und B1 zugeben. 50 µl von reconstituted Referenzserums 2 in die Vertiefungen C1 und D1 geben. 50 µl von reconstituted Referenzserums 3 in die Vertiefungen E1 und F1 geben. 50 µl der Probe in die übrigen Vertiefungen geben. Die Testplatte abdecken und sanft schütteln. 180±5 Minuten bei 22±3°C inkubieren. Hinweis: Beim Dosieren von Vollblutproben darauf achten, dass keine Probenreste in der Pipettenspitze zurückbleiben. INKUBATION MIT KONJUGAT 2.1 Die Testplatte 6 mal mit 300 µl Waschlösung pro Vertiefung waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen. Hinweis: Es dürfen keine Blutreste mehr in den Vertiefungen sein. 2.2 2.3 2.4 100 µl der Konjugatverdünnung in alle Vertiefungen geben. Die Testsplatte abdecken. 60±5 Minuten bei 22±3°C inkubieren. INKUBATION MIT CHROMOGEN (TMB) SUBSTRAT 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Die Testplatte 6-mal mit 300 µl Waschlösung pro Vertiefung waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen. 100 µl Chromogen (TMB) Substrat (Komponente 11) in alle Vertiefungen geben. 15 Minuten bei 22±3°C inkubieren. Nicht Schütteln. 100 µl Stopplösung (Komponente 12) zugeben. Die Platte leicht schütteln. Hinweis: Beginnen Sie mit der Zugabe der Stopplösung 15-20 Minuten nach dem Befüllen der ersten Vertiefungen mit Chromogen (TMB) Substrat. Geben Sie die Stopplösung in derselben Reihenfolge und Geschwindigkeit zu wie das Chromogen (TMB) Substrat. MESSEN DER TESTPLATTE UND BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 4.1 4.2 4.3 4.4 Die optische Dichte (OD) der Vertiefungen wird bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe der Stopplösung gemessen. Berechnung des mittleren OD450 Wertes des Referenzserums 2 (Vertiefungen C1 und D1 = OD450 Blindwert) Berechnung der korrigierten OD450 Werte der Proben durch Subtrahieren des Blindwerts vom mittleren OD450. Berechnung der prozentuale Positivität (PP) des Referenzserums 3 und der Proben gemäss nachstehender Formel. Die korrigierten OD450 Werte aller Proben werden als prozentuale Positivität (PP) im Verhältnis zum korrigierten mittleren OD450 Wert des Referenzserums 1 ausgedrückt. PP = Korrigierte OD450 Probe ----------------------------------------Korrigierte OD450 Referenz 1 x 100 AUSWERTUNG DES ERGEBNIS Validitätskriterien 5.1 Die OD450 von Referenz 2 muss <0,350 sein. 5.2 Die korrigierte OD450 von Referenzserum 1 muss mindestens 0,750 sein. 5.3 Die PP von Referenz 3 muss >20% sein. Hinweis: Werden diese Kriterien nicht erfüllt sind die Resultate ungültig und der Test muss wiederholt werden. Hinweis: Liegt der mittlere OD450 von Referenzserum 1 unter 0,750, wurde das Chromogen (TMB) Substrat vermutlich nicht bis auf Raumtemperatur erwärmt. Erwärmen Sie in diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C oder inkubieren Sie das En zym Substrat bis zu 30 Minuten bevor die Farbreaktion gestoppt wird. Liegt der korrigierte mittlere OD450 von Referenzserum 1 über 2,000 wird eine kürzere Inkubation mit dem Chromogen (TMB) Substrat empfohlen. Auswertung der prozentualen Inhibition PP = < 15% Negativ Kein Antigen in der Probe nachweisbar. PP = ≥ 15% Positiv CSFV Antigen ist in der Probe vorhanden. Die Anwesenheit von CSFV in Antigen-positiven Proben muss durch Virusisolation bestätigt werden. Anhang I Hinweis Diese Packungsbeilage gilt als vollständig und richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Inhalte der Packungsbeilage bedürfen in Deutschland der Genehmigung durch das FriedrichLoeffler Institut (FLI). Prionics AG haftet keinesfalls für Nebenoder Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der Benutzung dieser Gebrauchsinformation ergeben. Haftbarkeit P Prionics AG garantiert, dass seine Produkte die entsprechende veröffentlichte Spezifikation erfüllen, wenn sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Anleitungen und innerhalb der angegebenen Produktlebensdauer verwendet werden. Prionics AG gibt keine andere Garantie, weder ausdrücklich noch stillschweigend. Das Unternehmen übernimmt keinerlei Garantie hinsichtlich der Marktgängigkeit und Eignung seiner Waren für einen besonderen Zweck. Die hier erteilte Garantie und die Daten, Spezifikationen und Beschreibungen der Produkte der Prionics AG, die in den von Prionics AG herausgegebenen Katalogen auftauchen und in Informationen zum Produkt kann nicht verändert werden, ausser durch ausdrücklichen schriftlichen Zustimmung durch ein Vorstandsmitglied der Prionics AG. Mündliche oder schriftliche Informationen, die nicht mit dieser Garantie übereinstimmen, oder falls sie weitergegeben werden, sind nicht genehmigt, und falls sie gegeben werden, sind sie nicht gültig. Bei Auftreten eines Defektes, der im Rahmen der vorstehenden Garantiebestimmungen gedeckt ist, besteht für Prionics AG nur die Verpflichtung, wahlweise das entsprechende Produkt oder Teile hiervon zu reparieren oder zu ersetzen, wobei es im Ermessen von Prionics AG liegt, ob das Produkt ersetzt oder repariert wird. Dem Kunden obliegt es Prionics AG rechtzeitig über das Auftreten eines solchen Defektes zu informieren. Wenn Prionics AG das Produkt oder einen Teil davon nicht innerhalb einer angemessenen Frist reparieren oder ersetzen kann, wird Prionics AG den Kaufpreis für das Produkt oder dessen Teil zurückerstatten. Soweit im Rahmen des anwendbaren Rechts zulässig, ist Prionics AG nicht ersatzpflichtig für direkte, indirekte, spezifische oder Folgeschäden von finanziellen Verlusten oder Beschädigungen infolge der Verwendung seiner Produkte. Prionics AG und Prionics Lelystad BV sind nach ISO 9001:2000 zertifiziert. Anhang II Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze Nationale Sicherheitsvorschriften müssen streng befolgt werden R&S Sätze Komponente 1 Testplatte Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 2 Konjugat (30x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 3 Verdünnungspuffer (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 4 Konjugat-Additive (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 5 Demineralisiertes Wasser Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 6 Waschlösung (200x) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 7 Probenverdünner (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 8 Referenzserum 1 (lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 9 Referenzserum 2 (lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 10 Referenzserum 3 (lyophilisiert) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 11 Chromogen (TMB) Substrat (gebrauchsfertig) Gefahrenklasse: Dieses Produkt ist nicht nach den EU Vorschriften klassifiziert. Komponente 12 C; Ätzend Stopplösung Gefahrenklasse: R35: Verursacht schwere Verätzungen. S26: Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen) Anhang III Referenzen 1) Ressang, A.A., (1973). Zbl. Vet. Med. B 20, 256–271. 2) Wensvoort et al, (1986). Vet. Microbiol. 12, 101–108. 3) Kaden et al, (1999). Berl. Münch. Tierärtzl. Wschr.,112, 52-57. 4) Wensvoort et al, (1992). Zbl. Vet. Med. B 14, 33–34. Anhang IV Probenvorbereitung und Probenlagerung Es können verschiedne Verfahren angewendet werden um ein Gewebeextrakt für eine nachfolgede Analyse mittels PrioCHECK® CSFV Ag oder Virus isolation über Zellkultur zu erhalten. Die nachstehend beschriebenen Verfahren wurde von holländischen Referenzlabors für CSF des Bundesforschungsinstituts für Tiergesundheit für die Routinetestung übernommen. Blut und Plasmaproben Vollblutproben mit Antikoagulanz (bevorzugt Heparin) oder Plasma sollte nicht eingefroren werden, sondern bei 5±3°C (max. 7 Tage) gelagert werden. Serum Serumproben können direkt oder nach Lagerung bei -70°C getestet werden. Nach dem Test können die Ser umproben bei -70°C gelagert werden (um aktive Viren zu konse rvieren). Herstellung von Gewebeextrakt Schneiden Sie 1-2 Gramm des Gewebes in kleine Stücke und zermahlen diese zu einer homogenen Paste zusammen mit einer kleinen Menge des Mediums mit einem Mörser und Pistill. Wenn nötig verwenden Sie sterilen Sand als Schleifmittel. Geben Sie pro Gramm Gewebe 9 ml Earle’s MEM (ergänzt mit dem 5-fachen der normalen Konzentration an antibiotischem Streptomycin, Penicillin und Mycostatin) zu. Inkubieren Sie es 1 Stunde bei 22±3°C. Zentrifugieren Sie die Suspension 20±1 Minuten bei 6000x g. Ziehen Sie vorsichtig den Überstand ab und verwerfen Sie das Sediment. Verteilen Sie die Suspension in mindestens 2 Fläschchen. Lagern Sie die Fläschchen bei -70°C. Herstellung des Leukozytenkonzentrats Vor dem Testen sollten die gesammelte Leukozytenfraktion einer Blutprobe eingefroren (-20ºC) und wieder aufgetaut werden. 8 ml einer 0,83%-igen NH4Cl-Lösung in ein 15 ml Röhrchen zugeben. Fügen Sie 4 ml antikoaguliertes Vollblut zu. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und inkubieren Sie 30 Minuten bei 22±3°C um eine vollständige Auflösung d er roten Blutkörperchen zu erhalten. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 500x g bei 22±3°C. Verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Leukozytenpellet wieder in 400 µL Earle’s MEM (ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum und antibiotischem Streptomycin, Penicillin und Mycostatin). Lagern Sie die Probe bei -70°C (um aktive Viren zu konservieren). Kontakt Prionics AG Wagistrasse 27a CH-8952 Schlieren-Zurich Switzerland Tel. +41 44 200 2000 Fax +41 44 200 2010 www.prionics.com [email protected] Prionics Lelystad B.V. Platinastraat 33 P.O. Box 2271 NL-8203 AG Lelystad Niederlande Tel: +31 320 714000 Fax: +31 320 714029 Antragsteller und Vertreiberfirma Prionics Deutschland GmbH Hans-Urmiller-Ring 17a 82515 Wolfratshausen Deutschland Tel. +49 (0) 8171 99 747 0 Fax +49 (0) 8171 99 747 19 Unsere Distributoren-Kontakte finden Sie unter: www.prionics.com
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