NAOSITE: Nagasaki University's Academic Output SITE Title Study on Synthesis of Dendrimer-Like Polymeric DNA and Its Application for Chemiluminescence Detection of Telomere DNA and Delivery of siRNA Author(s) EL-Mahdy Ahmed, Ahmed Fikry Mohamed Citation (2014-09-19) Issue Date 2014-09-19 URL http://hdl.handle.net/10069/34892 Right This document is downloaded at: 2015-02-01T00:30:14Z http://naosite.lb.nagasaki-u.ac.jp Study on Synthesis of Dendrimer-Like Polymeric DNA and Its Application for Chemiluminescence Detection of Telomere DNA and Delivery of siRNA （デンドリマー様ポリマーDNA の合成とテロメア DNA 化学発光検出お よび siRNA の細胞内輸送への応用に関する研究） 長崎大学大学院医歯薬学総合研究科生命薬科学専攻 Ahmed Fikry Mohamed EL-Mahdy Ahmed ［目的］ デンドリマーは、中心から放射状に分枝した構造を持つ高分子である。一本鎖およ びその相補鎖 DNA からなるデンドリマー様 DNA は、構成成分が DNA であるため、 化学修飾が容易であり、蛍光基を結合させたプローブ開発や医薬品分子を結合させた 薬物輸送などへの応用が考えられる。 本研究では、多数のグアニン塩基を含む新規デンドリマー様 DNA (YY-DNAs)を合 成し、固相膜上および溶液中の標的 DNA の高感度検出のための化学発光プローブへ 応用した。さらに、siRNA の細胞内輸送分子としての YY-DNAs の有効性について検 討した。 ［結果および考察］ デンドリマー様 DNA の合成と固相膜上テロメア DNA の高感度化学発光検出用プロ ーブとしての応用 当研究室では、室温でグアニンと特異的に短時間で反応し、発光を生じる化学発光 試薬 3,4,5-trimethoxyphenylglyoxal (TMPG)を開発している。そこで、多数のグアニン を含む YY-DNAs は、TMPG 反応と組み合わせることで高感度化学発光検出用プロー ブとして応用できるものと考え、テロメア DNA を標的とした化学発光検出法を開発 した (Fig. 1)。 Fig. 1 (A) Schematic protocol for the chemiluminescence (CL) detection and (B) CL-imaging detection of telomere DNA by the direct hybridization with the synthesized probe of YY-DNAs followed by TMPG reaction. まず、テロメア配列(TTAGGG)3 およびその相補的な配列を持つオリゴヌクレオチド を導入した Y 字型三量体の DNA を、それぞれ合成した。これら 2 種類の三量体 DNA を混合し、ハイブリダイズさせることで YY-DNAs である重合体を形成させることが できた。YY-DNAs の生成は、電気泳動によるバンドの位置によって確認した。 次に、ナイロン膜にテロメア DNA をスポットし、YY-DNAs とハイブリダイズさせ たのち、TMPG を用いた化学発光検出を行った。その結果、スポットしたテロメア DNA 量に比例した化学発光が観察された (Fig. 1)。このときのテロメア DNA の検出 限界は約 50 fmol (0.9 ng)であり、biotin-avidin-horseradish peroxidase を用いた従来の化 学発光検出法と比較して、5 倍程高感度であった。 Streptavidin-coated sephadex beads とデンドリマー様 DNA プローブを用いたテロメ ア DNA の高感度化学発光検出 著者らは、sephadex beads を酸化し、生成したアルデヒド基と streptavidin (SA)のア ミノ基を反応させたのち還元することによって、SA-coated sephadex beads の効率的な 調製法を開発した。この方法による sephadex beads 1mg あたりの SA の結合量は、市 販の SA-coated polystyrene beads や sepharose beads と比較して、それぞれ約 24 倍およ び 5 倍増大した。そこで、この SA-coated sephadex beads と YY-DNAs を用いて、テロ メア DNA を標的とした化学発光検出を行った。 最初に、biotin 標識 cDNA を SA-coated sephadex beads に結合させ、標的であるテロ メア DNA とハイブリダイズさせた。次に、結合したテロメア DNA と YY-DNAs をハ イブリダイズさせ、TMPG を用いた化学発光検出を行った (Fig. 2A)。その結果、テロ メア DNA 5-200 nM の範囲において、化学発光強度と DNA 濃度の間に良好な直線性 が得られた(Fig. 2B)。本測定法の検出限界は約 0.75 nM (1.3 ng/100 μL)であった。本測 定法は、操作時間が短く(2-3 h)、測定範囲も広く、簡便かつ高感度であり、他の DNA 検出法に匹敵するものである。また、SA-coated sephadex beads は、DNA だけでなく、 抗体を用いたタンパク質の免疫測定にも応用可能であると考える。 Fig. 2 (A) Schematic principles for preparation of SA-coated sephadex bead and its application for CL detection of telomere DNA. (B) Calibration curve of CL intensity versus the target DNA. siRNA の細胞内輸 輸送におけ けるデンドリ リマー様 DNA D の有効 効性 基礎研 研究レベル ルにおける siRNA など どの核酸の の細胞内輸送 送には、トラ ランスフェ ェクショ ン試薬として Lippofectaminee (LP)、polyyethylenim mine (PEI)、poly-L-lysiine (PLL)な などのカ 性化合物が が使用されているが、カチオン性 性化合物は は細胞毒性 があるため め、臨床 チオン性 に適用できない。一方、YY Y-DNAs は は負に荷電しているた ため、カチオ オン性化合 合物の細 胞 毒 性 を 軽 減 で き る と 考 え た 。 そ こ で 、 siR RNA/ カ チ オ ン 性 化 合 物 (LP 、 PEI 、 PLL)/Y YY-DNAs の複合体を作 の 作製し(Schheme 1)、これら複合体 体の HeLa 細 細胞への細 細胞毒性 および siRNA の細 細胞内輸送 送への影響を を調べた。 + + siRNA Lp, PEI orr PLL YY-DNAs siRNA/LP (120 nm) siRNA/PEI (86 nm) or siRN NA/PLL (65 nm) Annionic encapsulated complex (12-4 -40 nm) Schemee 1 Electtrostatic encapsulati e ion of siR RNA/LP, siRNA/PEII or siRN NA/PLL nanopaarticles with h YY-DNAs. その結 結果、siRN NA/カチオン ン性化合物 物と比較して て、siRNA/カ カチオン性 性化合物/YY Y-DNAs 複合体の細胞毒性 性は著しく減少した (Fig. 3A)。一方、siR RNA の細胞 胞内輸送につ ついて、 YY-DN NAs は影響しなかった た (Fig. 3B))。これらの の結果は、Y YY-DNAs は はカチオン ン性トラ ンスフェクション ン試薬の核酸導入効率 率は維持したまま、これらの細胞 こ 胞毒性を低 低減でき ることを示してい いる。 Fig. 3 ((A) In vitroo cytotoxiccity of the anionic en ncapsulated d siRNA coomplexes on o HeLa cells foor 24 h in ncubation. (B) Uptak ke efficienccy of the anionic a enncapsulated d siRNA complexes in HeL La cells for 4h 4 incubatiion. ［基礎となった学 学術論文］ F. M. EL-M Mahdy, T. Sh hibata, T. K Kabashima, M. Kai, Deendrimer-likke polymeriic DNAs [1] A. F as chem miluminesceence probes for ampliified detecttion of telo omere DNA A on a solid-phase membraane. Chem. Commun., 2014, 2 50, 8559-861.
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![平成 27 年 5 月 14 日 [神戸大学大学院農学研究科] 李智博准教授が](http://s1.expydoc.com/store/data/006070707_1-3e6fd1585bf925076db6363e411c729d-250x500.png)
