実習書

生物学実験 IIIAB
アポトーシス細胞における DNA ラダーの検出
担当：鎌田
真司
細胞は極度のストレス条件（紫外線、放射線、酸化ストレス等）下に置かれ
た場合やデスレセプター（Fas 抗原レセプター、TNF レセプター等）が細胞死
のシグナルを受け取った場合に、速やかにアポトーシスを起こす。様々な細胞
死誘導刺激は最終的にはカスパーゼと呼ばれる蛋白質分解酵素の活性化を引き
起こし、活性化したカスパーゼが細胞内の様々な蛋白質を切断することにより
アポトーシス細胞の特徴を示すようになる。アポトーシス細胞の特徴としては、
細胞質の縮小と断片化、クロマチンの凝縮、核の凝縮と断片化等が挙げられる。
これら形態学的特徴は光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を用いて観察でき
る。また、これらの変化を示す過程で生化学的な変化を伴っており、細胞膜構
成成分であるアネキシン V の細胞外への露出や DNA の断片化を解析すること
によりアポトーシスが起きたかどうか判断することができる。本実習ではアガ
ロースゲル電気泳動法を用いて、アポトーシス細胞の生化学的指標である DNA
の断片化を検出する。アポトーシスが起こっていれば DNA は 180~200bp の整
数倍のラダーとして検出される。
１日目
・実習内容の説明
・試薬の調製
・細胞より断片化 DNA の抽出
２日目
・断片化 DNA 抽出の続き
・アガロースゲルの作製
・アガロースゲル電気泳動
・泳動結果の撮影
1
注意点
・本実習では Jurkat 細胞をエトポシド刺激によりアポトーシスを誘導した細胞
（刺激後０、３、６時間）から DNA を抽出する。また、HeLa 細胞（Histone H2B
が GFP と融合しているため核は緑色を示す）を Fas を介してアポトーシスを誘
導し、０時間から１８時間までタイムラプス撮影したビデオファイルを用意し
ておく(http://www.research.kobe-u.ac.jp/brce-kikkawa/jikken)。両者は刺激は
異なるが、細胞内では最終的に共通した経路を通ってアポトーシスに至る。実
験結果とビデオでの細胞の変化を良く観察し、細胞内で起こっている変化を考
察しレポートを作製する。
(A)
(I)
DNA 断片の抽出
試薬の調製
・細胞溶解バッファー
1M Tris-HCl (pH 7.5)
0.01 ml
（最終濃度 10mM）
0.5M EDTA (pH 8.0)
0.02 ml
（最終濃度 10mM）
10% Triton X-100
0.05 ml
（最終濃度 0.5%）
1M Tris-HCl (pH 7.5)
0.1 ml
（最終濃度 10mM）
0.5M EDTA (pH 8.0)
0.02 ml
（最終濃度 1mM）
DW で Total 1 ml とする
・ TE バッファー
DW で Total 10 ml とする
・ RNase A 溶液
TE バッファーに 10 mg/ml に溶解
（DNase 不活性化を要するときは、100℃、１５分間加熱処理）
100μl ずつ小分けにして、−２０℃保存、解凍後４℃保存
・Proteinase K 溶液
DW に 10 mg/ml に溶解
100μl ずつ小分けにして、−２０℃保存、解凍後４℃保存
・ 4M NaCl
2
(II)
方法
１）1 x 106 細胞を 200 x g、５分間遠心し、上清を除去後、200μl の PBS(-)
に懸濁する。
２）250 x g、１０分間遠心後、上清を除去する（この段階で−80℃で保存可能）。
３）ボルテックスにより細胞ペレットを浮遊させた後、細胞溶解バッファー
を 100μl 加える。
４）氷上に１０分間置き、時々ボルテックスをかけ DNA 断片を抽出する。
５）15000 rpm、１０分間遠心し、上清（DNA 断片を含む）を新たな 1.5 ml
チューブに移す。
６）RNase A 溶液を 2 μl 加え、37℃で１時間インキュベーションする。
７）２μl の Proteinase K 溶液を加え、50℃、３０分間インキュベーション
する。
８）２５μl の４M NaCl と１２５μl のイソプロパノールを加え、−２０℃で
一晩置く。
９）15000rpm、１５分間遠心し、上清を除去する。完全にイソプロパノール
を除くために、再度２分間遠心し注意深く上清を除去する。
１０）１０分間室温に放置し、軽く乾燥させる。
１１）TE バッファー２０μl を加え、ボルテックスをかけて DNA を溶解させ
る。
(B)
(I)
アガロースゲル電気泳動
試薬の調製
・50 X TAE バッファー
242g Tris base
57.1 ml 酢酸
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
DW で Total 1000 ml とする
・ 10 X ゲルローデイング液
1% SDS
50% グリセロール
3
0.05% ブロモフェノールブルー
(II)
方法
１）アガロース 2 g に 1 X TAE バッファー100 ml を加え、電子レンジで加温
溶解させる。
２）少し冷えたらゲルメーカー板に流し、直ちにコームを差し込む（Mupid
用ゲルメーカーで厚さ 4 ~ 5 mm のゲルを作製）。アガロースが完全に固
まるまで待ち、コームを外す。
３）（A）で調製した DNA 溶液にゲルローデイング液を 1 X となる様に加え
る。
４）1 X TAE バッファーを入れた Mupid 電気泳動槽にゲルをセットする。
５）上記試料（各１０μl）をウエルに入れる。左端のウエルには DNA 分子
量マーカー100 bp ladder marker を入れる。
６）100 V で泳動し、マーカー色素が先端付近に来たら終了する。
７）エチジウムブロマイドを加えた DW に浸し、２０分間放置する。
８）DW で軽く洗った後、UV トランスイルミネーターで DNA の蛍光を検出
し、カメラで撮影する。
4

Download Report