生物学実験 IIIAB アポトーシス細胞における DNA ラダーの検出 担当:鎌田 真司 細胞は極度のストレス条件(紫外線、放射線、酸化ストレス等)下に置かれ た場合やデスレセプター(Fas 抗原レセプター、TNF レセプター等)が細胞死 のシグナルを受け取った場合に、速やかにアポトーシスを起こす。様々な細胞 死誘導刺激は最終的にはカスパーゼと呼ばれる蛋白質分解酵素の活性化を引き 起こし、活性化したカスパーゼが細胞内の様々な蛋白質を切断することにより アポトーシス細胞の特徴を示すようになる。アポトーシス細胞の特徴としては、 細胞質の縮小と断片化、クロマチンの凝縮、核の凝縮と断片化等が挙げられる。 これら形態学的特徴は光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を用いて観察でき る。また、これらの変化を示す過程で生化学的な変化を伴っており、細胞膜構 成成分であるアネキシン V の細胞外への露出や DNA の断片化を解析すること によりアポトーシスが起きたかどうか判断することができる。本実習ではアガ ロースゲル電気泳動法を用いて、アポトーシス細胞の生化学的指標である DNA の断片化を検出する。アポトーシスが起こっていれば DNA は 180~200bp の整 数倍のラダーとして検出される。 1日目 ・ 実習内容の説明 ・ 試薬の調製 ・細胞より断片化 DNA の抽出 2日目 ・断片化 DNA 抽出の続き ・アガロースゲルの作製 ・アガロースゲル電気泳動 ・泳動結果の撮影 1 注意点 ・本実習では Jurkat 細胞をエトポシド刺激によりアポトーシスを誘導した細胞 (刺激後0、3、6時間)から DNA を抽出する。また、HeLa 細胞(Histone H2B が GFP と融合しているため核は緑色を示す)を Fas を介してアポトーシスを誘 導し、0時間から18時間までタイムラプス撮影したビデオファイルを用意し ておく(http://www.research.kobe-u.ac.jp/brce-kikkawa/jikken)。両者は刺激は 異なるが、細胞内では最終的に共通した経路を通ってアポトーシスに至る。実 験結果とビデオでの細胞の変化を良く観察し、細胞内で起こっている変化を考 察しレポートを作製する。 (A) (I) DNA 断片の抽出 試薬の調製 ・ 細胞溶解バッファー 1M Tris-HCl (pH 7.5) 0.01 ml (最終濃度 10mM) 0.5M EDTA (pH 8.0) 0.02 ml (最終濃度 10mM) 10% Triton X-100 0.05 ml (最終濃度 0.5%) 1M Tris-HCl (pH 7.5) 0.1 ml (最終濃度 10mM) 0.5M EDTA (pH 8.0) 0.02 ml (最終濃度 1mM) DW で Total 1 ml とする ・ TE バッファー DW で Total 10 ml とする ・ RNase A 溶液 TE バッファーに 10 mg/ml に溶解 (DNase 不活性化を要するときは、100℃、15分間加熱処理) 100μl ずつ小分けにして、−20℃保存、解凍後4℃保存 ・Proteinase K 溶液 DW に 10 mg/ml に溶解 100μl ずつ小分けにして、−20℃保存、解凍後4℃保存 ・ 4M NaCl 2 (II) 方法 1)1 x 106 細胞を 200 x g、5分間遠心し、上清を除去後、200μl の PBS(-) に懸濁する。 2)250 x g、10分間遠心後、上清を除去する(この段階で−80℃で保存可能)。 3)ボルテックスにより細胞ペレットを浮遊させた後、細胞溶解バッファー を 100μl 加える。 4)氷上に10分間置き、時々ボルテックスをかけ DNA 断片を抽出する。 5)15000 rpm、10分間遠心し、上清(DNA 断片を含む)を新たな 1.5 ml チューブに移す。 6)RNase A 溶液を 2 μl 加え、37℃で1時間インキュベーションする。 7)2μl の Proteinase K 溶液を加え、50℃、30分間インキュベーション する。 8)25μl の4M NaCl と125μl のイソプロパノールを加え、−20℃で 一晩置く。 9)15000rpm、15分間遠心し、上清を除去する。完全にイソプロパノール を除くために、再度2分間遠心し注意深く上清を除去する。 10)10分間室温に放置し、軽く乾燥させる。 11)TE バッファー20μl を加え、ボルテックスをかけて DNA を溶解させ る。 (B) (I) アガロースゲル電気泳動 試薬の調製 ・50 X TAE バッファー 242g Tris base 57.1 ml 酢酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) DW で Total 1000 ml とする ・ 10 X ゲルローデイング液 1% SDS 50% グリセロール 3 0.05% ブロモフェノールブルー (II) 方法 1)アガロース 2 g に 1 X TAE バッファー100 ml を加え、電子レンジで加温 溶解させる。 2)少し冷えたらゲルメーカー板に流し、直ちにコームを差し込む(Mupid 用ゲルメーカーで厚さ 4 ~ 5 mm のゲルを作製)。アガロースが完全に固 まるまで待ち、コームを外す。 3)(A)で調製した DNA 溶液にゲルローデイング液を 1 X となる様に加え る。 4)1 X TAE バッファーを入れた Mupid 電気泳動槽にゲルをセットする。 5)上記試料(各10μl)をウエルに入れる。左端のウエルには DNA 分子 量マーカー100 bp ladder marker を入れる。 6)100 V で泳動し、マーカー色素が先端付近に来たら終了する。 7)エチジウムブロマイドを加えた DW に浸し、20分間放置する。 8)DW で軽く洗った後、UV トランスイルミネーターで DNA の蛍光を検出 し、カメラで撮影する。 4
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