RNAアプタマーを用いた新規医用材料の開発 RNAアプタマーを用いた新規医用材料の開発 ○野村祐介1,福井千恵1,戸井田 瞳1,新見伸吾1,宮川 伸2,金 玲2,中村義一2,3,蓜島由二1 (1国立医薬品食品衛生研究所、2株式会社リボミック、3東京大学) 【背景と目的】 鋳型DNAライブラリ ライブラリ 鋳型 医用材料を生体内に埋植すると、材料表面に水やイオンが速やかに吸 着する。次いで生体蛋白質の吸着が起こり、それら蛋白質を足場として、 細胞が接着する。すなわち、同蛋白質は材料の機能発現や生体適合性 に大きく関与している。それ故、増殖因子等の生理活性物質を導入した材 料表面等の開発が多く進められている。一方、特定の蛋白質を特異的に 捕捉し、その活性を阻害するRNAアプタマー(RNA-AP)が医薬品として 上市化されている。試験管内分子進化法(SELEX法)によりRNA-APを検 索する際、活性を保持した状態で標的蛋白質を特異的に捕捉するRNAAPが多数ヒットする。すなわち、適切なRNA-APを医用材料上に固定化 することにより、特定の蛋白質を特異的に材料表面に吸着させ、その機能 を一定期間に渡り制御できる可能性が非常に高い(図1)。そこで、本研究 では、 RNA-APを固定化した新規医用材料の開発を目的とし、そのファー ストトライアルとして塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を活性を保持し た状態で捕捉し濃縮する材料表面を開発すると共に、同材料表面上で各 種細胞の増殖能を測定することにより、その有用性を評価した。 吸着する水や蛋白質が 医用材料の機能発現や 生体適合性に影響 プロモーター 転写 逆転写PCR 逆転写 (増幅) 細胞 本研究で用いたRNA配列 配列 本研究で用いた 40N: ランダム配列のRNA bFA: bFGFの活性を阻害するRNA-AP 1p01,02,07: RNA Pool1より得られたRNA-AP候補 2p03,05,11: RNA Pool2より得られたRNA-AP候補 RNAプール プール (1014) 生体蛋白質 水やイオン 材料表面 結合したRNA 結合した 結合しなかったRNA 結合しなかった 選別 材料表面に RNA-APを固定化 bFGFに結合し、 活性阻害しないRNA-APを選定 【実験】 ・RNA-AP/bFGF及びRNA-AP/bFGF/FGFR1複合体形成能はSPR法により解析した。 全てのRNAは酵素を用いた試験管内転写法により合成。 ・各候補のNIH3T3細胞に対するbFGF細胞刺激阻害能はERK及びFRS2のリン酸化 を指標としてWB法によって行った。 ・RNA-AP固定化表面は、二官能性PEG(5k)を常法に従って金コートガラス板上に固 定化した後、カルボジイミド法により同RNA-APを導入して作製した。接触角測定及び XPS解析は、それぞれG-1-1000及びESCA2000を用いて行った。RNA-AP固定化表 面上におけるhMSC及びNIH3T3細胞の増殖能はHoechst 33258染色後、BZ-9000 を用いて核数を計測することにより評価した。 ランダム配列 プライマー結合配列 細胞増殖促進 FGFR bFGF-FGFR相互作用 bFGF RNA-APによるFGF2の 特異的補足 RNA-AP 再生医療材料となりうる PEGブラシによる 蛋白質の非特異吸着防止 PEG 材料表面 図1. bFGFに対するRNA-APを用いた新規医用材料の開発 【結果と考察①】SPR法によるRNA-AP/bFGF/FGFR1形成能評価 RU RU RU RU RNA-APとbFGFの相互作用が確認でき、FGFR1が添加されることでbFA,1p07以外のRNA-APからbFGFが脱離することが確認された(図2、3)。 RNA-AP/bFGF複合体形成が確認できた 複合体形成が確認できた。 複合体形成が確認できた。 bFGF/FGFR1相互作用を阻害 相互作用を阻害しない 候補が選定できた。 相互作用を阻害しないRNA-AP候補が選定できた しない 候補が選定できた。 Time (s) Time (s) Time (s) 図2.RNAを固定化後,bFGFを添加(△).さらにFGFR1を添加した際(▲)のRU値. 上はヘパリン無し,下はヘパリン有 Time (s) 図3.RNAを固定化後,bFGFを添加(△).さらにFGFR1を添加した際(▲)のRU値. ヘパリン存在下 9000 8000 【 結 果 と 考 察 ③ 】RNA-AP 固 定 化 材 料 上 で の 1p01, 1p02および2p03においてはFRS-2およびErkのリン酸化が確認されたこ とから、これらRNA-APはbFGFによる細胞刺激を阻害しないことが示された(図 4)。 細胞内シグナル伝達を阻害しない を 細胞内シグナル伝達を阻害しないRNA-APを シグナル伝達を阻害しない 選定することができた 選定することができた。 することができた。 細胞増殖能 1p01および、陰性対照となるpoly dT(pdT)を固定 化した材料表面上で、細胞培養を行ない、細胞増殖 能を比較した結果、1p01を固定化した条件では細 胞数が優位に増加した(図5、6)。 bFGF補足型 補足型RNA-APは意図した機能 は意図した機能を発揮 補足型 は意図した機能 を発揮す を発揮 す ることが確認された。 ることが確認された。 RNA bFGF - 7000 6000 細胞数 【結果と考察②】bFGFによる細胞刺激阻害能評価 5000 4000 3000 2000 1000 0 NIH3T3 + + + + + + + + + 100 P-FRS2 90 C 80 図4.WBによるFRS2とErkのリン酸化の解析. 60 50 30 10 0 Gold PEG5k 【本研究の利点と展望】 ・RNA-APはあらゆる蛋白質に対して、得られる可能性があるため、組み合わせ を変えることで材料表面上における、あらゆる細胞挙動の制御が可能となる。 様々な組織再生を誘導(血管新生や骨再生など) 様々な幹細胞の増殖、分化制御 再生医療促進につながる 再生医療促進につながる N P 40 20 ・ 本 研 究 に お け る RNA-AP は 、 単 独 で は 生 理 活 性 を 示 さ な い 合 成 可 能 な 化学物質である。 薬事申請上、医薬品としての承認審査が不要である O PEG5k 接触角 70 PEG5k-dT PEG5k-pdT P-Erk Actin hMSC 図5. RNA-AP固定化材料が与える NIH3T3およびhMSC細胞増殖能への影響 材料表面の接触角 RNA-PEG表面のXPS解析結果 図6. 接触角測定およびXPS解析による核酸固定化の確認 【今後の予定】 ・RNA-AP固定化条件の最適化 ・材料表面のbFGFの補足状況及び生体蛋白質の非特異吸着評価 ・材料表面上での細胞挙動解析(遺伝子発現、蛋白質発現等) ・材料表面からのRNA-AP溶出量の定量および影響評価 ・動物実験による同材料の有効性および安全性評価
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