RNAアプタマーを用いた新規医用材料の開発 RNAアプタマーを用いた新規医用材料の開発 ○野村祐介1，福井千恵1，戸井田瞳1，新見伸吾1，宮川伸2，金玲2，中村義一2,3，蓜島由二1 （1国立医薬品食品衛生研究所、2株式会社リボミック、3東京大学）【背景と目的】鋳型DNAライブラリライブラリ鋳型医用材料を生体内に埋植すると、材料表面に水やイオンが速やかに吸着する。次いで生体蛋白質の吸着が起こり、それら蛋白質を足場として、細胞が接着する。すなわち、同蛋白質は材料の機能発現や生体適合性に大きく関与している。それ故、増殖因子等の生理活性物質を導入した材料表面等の開発が多く進められている。一方、特定の蛋白質を特異的に捕捉し、その活性を阻害するRNAアプタマー（RNA-AP）が医薬品として上市化されている。試験管内分子進化法（SELEX法）によりRNA-APを検索する際、活性を保持した状態で標的蛋白質を特異的に捕捉するRNAAPが多数ヒットする。すなわち、適切なRNA-APを医用材料上に固定化することにより、特定の蛋白質を特異的に材料表面に吸着させ、その機能を一定期間に渡り制御できる可能性が非常に高い（図１）。そこで、本研究では、 RNA-APを固定化した新規医用材料の開発を目的とし、そのファーストトライアルとして塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を活性を保持した状態で捕捉し濃縮する材料表面を開発すると共に、同材料表面上で各種細胞の増殖能を測定することにより、その有用性を評価した。吸着する水や蛋白質が医用材料の機能発現や生体適合性に影響プロモーター転写逆転写PCR 逆転写（増幅）細胞本研究で用いたRNA配列配列本研究で用いた 40N: ランダム配列のRNA bFA: bFGFの活性を阻害するRNA-AP 1p01,02,07: RNA Pool1より得られたRNA-AP候補 2p03,05,11: RNA Pool2より得られたRNA-AP候補 RNAプールプール (1014) 生体蛋白質水やイオン材料表面結合したRNA 結合した結合しなかったRNA 結合しなかった選別材料表面に RNA-APを固定化 bFGFに結合し、活性阻害しないRNA-APを選定【実験】・RNA-AP/bFGF及びRNA-AP/bFGF/FGFR1複合体形成能はSPR法により解析した。全てのRNAは酵素を用いた試験管内転写法により合成。・各候補のNIH3T3細胞に対するbFGF細胞刺激阻害能はERK及びFRS2のリン酸化を指標としてWB法によって行った。・RNA-AP固定化表面は、二官能性PEG（5k）を常法に従って金コートガラス板上に固定化した後、カルボジイミド法により同RNA-APを導入して作製した。接触角測定及び XPS解析は、それぞれG-1-1000及びESCA2000を用いて行った。RNA-AP固定化表面上におけるhMSC及びNIH3T3細胞の増殖能はHoechst 33258染色後、BZ-9000 を用いて核数を計測することにより評価した。ランダム配列プライマー結合配列細胞増殖促進 FGFR bFGF-FGFR相互作用 bFGF RNA-APによるFGF2の特異的補足 RNA-AP 再生医療材料となりうる PEGブラシによる蛋白質の非特異吸着防止 PEG 材料表面図１． bFGFに対するRNA-APを用いた新規医用材料の開発【結果と考察①】SPR法によるRNA-AP/bFGF/FGFR1形成能評価 RU RU RU RU RNA-APとbFGFの相互作用が確認でき、FGFR1が添加されることでbFA,1p07以外のRNA-APからbFGFが脱離することが確認された（図２、３）。 RNA-AP/bFGF複合体形成が確認できた複合体形成が確認できた。複合体形成が確認できた。 bFGF/FGFR1相互作用を阻害相互作用を阻害しない候補が選定できた。相互作用を阻害しないRNA-AP候補が選定できたしない候補が選定できた。 Time (s) Time (s) Time (s) 図２．RNAを固定化後，bFGFを添加（△）．さらにFGFR1を添加した際（▲）のRU値．上はヘパリン無し，下はヘパリン有 Time (s) 図３．RNAを固定化後，bFGFを添加（△）．さらにFGFR1を添加した際（▲）のRU値．ヘパリン存在下 9000 8000 【結果と考察 ③ 】RNA-AP 固定化材料上での 1p01, 1p02および2p03においてはFRS-2およびErkのリン酸化が確認されたことから、これらRNA-APはbFGFによる細胞刺激を阻害しないことが示された（図４）。細胞内シグナル伝達を阻害しないを細胞内シグナル伝達を阻害しないRNA-APをシグナル伝達を阻害しない選定することができた選定することができた。することができた。細胞増殖能 1p01および、陰性対照となるpoly dT(pdT)を固定化した材料表面上で、細胞培養を行ない、細胞増殖能を比較した結果、1p01を固定化した条件では細胞数が優位に増加した（図５、６）。 bFGF補足型補足型RNA-APは意図した機能は意図した機能を発揮補足型は意図した機能を発揮すを発揮することが確認された。ることが確認された。 RNA bFGF - 7000 6000 細胞数【結果と考察②】bFGFによる細胞刺激阻害能評価 5000 4000 3000 2000 1000 0 NIH3T3 + + + + + + + + + 100 P-FRS2 90 C 80 図４．WBによるFRS2とErkのリン酸化の解析． 60 50 30 10 0 Gold PEG5k 【本研究の利点と展望】・RNA-APはあらゆる蛋白質に対して、得られる可能性があるため、組み合わせを変えることで材料表面上における、あらゆる細胞挙動の制御が可能となる。様々な組織再生を誘導（血管新生や骨再生など）様々な幹細胞の増殖、分化制御再生医療促進につながる再生医療促進につながる N P 40 20 ・本研究における RNA-AP は、単独では生理活性を示さない合成可能な化学物質である。薬事申請上、医薬品としての承認審査が不要である O PEG5k 接触角 70 PEG5k-dT PEG5k-pdT P-Erk Actin hMSC 図５． RNA-AP固定化材料が与える NIH3T3およびhMSC細胞増殖能への影響材料表面の接触角 RNA-PEG表面のXPS解析結果図６．接触角測定およびXPS解析による核酸固定化の確認【今後の予定】・RNA-AP固定化条件の最適化・材料表面のbFGFの補足状況及び生体蛋白質の非特異吸着評価・材料表面上での細胞挙動解析（遺伝子発現、蛋白質発現等）・材料表面からのRNA-AP溶出量の定量および影響評価・動物実験による同材料の有効性および安全性評価