http://utomir.lib.u-toyama.ac.jp/dspace/ Title Neuropharmacological

Neuropharmacological studies on neuroprotective
effects of Baccopa monnieri, a traditional medicine
, and tacrine, acetylcholinesterase inhibitor
Title
Author(s)
LE THI, XOAN
Citation
Issue Date
2014-03-21
Type
Article
Text version
URL
http://hdl.handle.net/10110/12978
Rights
http://utomir.lib.u-toyama.ac.jp/dspace/
れーちーそあん
氏　名
LE THI XOAN
学位の種類
博士（薬学）
学位記番号
富医薬博甲第 143 号
学位授与年月日
平成 26 年 3 月 21 日
学位授与の要件
富山大学学位規則第 3 条第 3 項該当
教　育　部
富山大学大学院医学薬学教育部　薬学領域　博士課程
名
生命薬科学専攻
学位論文題目
Neuropharmacological studies on neuroprotective effects of
Baccopa monnieri, a traditional medicine, and tacrine,
acetylcholinesterase inhibitor
（伝統薬 Baccopa monnieri およびアセチルコリンエステラーゼ阻
害薬の神経損傷抑制効果とその作用分子機構に関する薬理学的研究）
論文審査委員
（主査）
教
授
松本欣三
（副査）
教
授
新田淳美
（副査）
教
授
東田千尋
（指導教員）
論
文
内容
の
要
旨
Alzheimer’s disease (AD) and cerebrovascular disorder are the major causes of
dementia in which aging and vascular disorders are implicated as risk factors. Because
of worldwide population aging, the number of people with dementia is dramatically
increasing in many countries and providing social and economic impacts in terms of
medical and social costs. Therefore, development of new drugs and therapeutic
strategies effective for prevention/therapy of dementia are greatly needed. Bacopa
monnieri (L) Wettst. (BM) is a medicinal plant which has been not only used as a
traditional medicine to improve intelligence and memory but also taken as vegetables in
Vietnam for a long time. In this study, we investigated the anti-dementia effects of BM
alcohol extract in mice with olfactory bulbectomy (OBX) and transient cerebral ischemia
(T2VO) used as experimental models of AD and vascular dementia, respectively.
Moreover, to have a better understanding the molecular mechanism(s) underlying the
effects of BM, we investigated neuroprotective effects of tacrine (THA), an
acetylcholinesterase inhibitor, and bacopaside I, a terpenoid saponin isolated from BM,
in organotypic hippocampal slice cultures (OHSCs).
I. Bacopa monnieri ameliorates memory deficits in olfactory bulbectomized mice:
Possible involvement of glutamatergic and cholinergic systems (1)
This study investigated the effects of alcoholic extract of BM on cognitive deficits
using olfactory bulbectomized (OBX) mice and the underlying molecular mechanisms of
its action. OBX mice were treated daily with BM (50 mg/kg, p.o.) or a reference drug
-1-
THA (2.5 mg/kg, i.p.) 1 week before and continuously 3 days after OBX. Cognitive
performance of the animals was analyzed by the novel object recognition test, modified
Y maze test, and fear conditioning test. Brain tissues of OBX animals were used for
neurochemical and immunohistochemical studies. OBX impaired non-spatial
short-term memory, spatial working memory, and long-term fair memory. BM
administration ameliorated these memory disturbances. The effect of BM on short-term
memory deficits was abolished by a muscarinic receptor antagonist, scopolamine. OBX
down-regulated phosphorylation of synaptic plasticity-related signaling proteins: NR1
subunit of N-methyl-D-aspartate receptor, glutamate receptor 1 (GluR1), and
calmodulin-dependent kinase II but not cyclic AMP-responsive element binding protein
(CREB), and reduced brain-derived neurotrophic factor (BDNF) mRNA in the
hippocampus. OBX also reduced the expression level of choline acetyltransferase in the
hippocampus and cholinergic neurons in the medial septum, and enlarged the size of
lateral ventricle. BM administration reversed these OBX-induced neurochemical and
histological alterations, except the decrease of GluR1 phosphorylation, and enhanced
CREB phosphorylation. Moreover, BM treatment inhibited ex vivo activity of
acetylcholinesterase in the brain. The effects of BM were quite similar to those of THA.
Our findings demonstrate that BM treatment, as well as THA, ameliorates
OBX-induced cognition dysfunction via a mechanism involving enhancement of synaptic
plasticity-related signaling and BDNF transcription and protection of cholinergic
systems from OBX-induced neuronal damage.
-2-
II. Endogenous acetylcholine rescues NMDA-induced long-lasting hippocampal cell
damage via stimulation of muscarinic M1 receptors: Elucidation using organic
hippocampal slice cultures (2)
This study aimed to investigate a recuing role of cholinergic systems in the
excitotoxicity-induced hippocampal cell damage using organotypic hippocampal slice
cultures (OHSCs). OHSCs were prepared from 7-day-old mice and exposed to 3 μM
N-methyl-D-aspartate (NMDA) for 24 hr. After washing out the NMDA, OHSCs were
incubated in medium containing test drugs for 0–6 days. Hippocampal cell damage was
evaluated by propidium iodide (PI) staining, immunofluorescence, and western blotting.
NMDA (1–10 μM) dose-dependently damaged hippocampal cells. The toxic effect of 3μM
NMDA was also observed at 3– 6 days, even after washing out NMDA, and was blocked
by MK-801 from day 3 to day 6. Post-treatments with THA, donepezil, and galantamine
reduced the NMDA-induced long-lasting hippocampal cell damage. The effect of THA
was induced in a manner dependent on the incubation period after NMDA treatment
and was confirmed by Nissl staining and immunostaining with NeuN, a marker of
mature neurons. The effect of THA was attenuated by scopolamine and a muscarinic M1
receptor antagonist, pirenzepine, but not by a muscarinic M3 receptor antagonist,
darifenacin, or a nicotinic receptor antagonist, mecamylamine. The protein kinase C
(PKC) inhibitor Ro-31-8220 abolished the effect of tacrine. The pretreatment with
NMDA had no effect on the expression level of presynaptic cholinergic markers, choline
acetyltransferase and vesicular acetylcholine transporter, in OHSCs. These results
suggest that a low concentration of NMDA causes long-lasting hippocampal cell damage
and that cholinergic systems play, via endogenous ACh stimulation of muscarinic M1
-3-
receptor, a rescuing role in the excitotoxicity-induced long-lasting hippocampal cell
damage.
III. Protective effects of Bacopa monnieri on ischemia-induced cognitive deficit: a
possible contribution of bacopaside I and the underlying mechanism (3)
In the previous study, we found that BM alcohol extract attenuated OBX-induced
cognitive deficits and septum cholinergic neurons, suggesting beneficial effects of BM on
dementia patients. This study was conducted to further clarify the anti-dementia effects
of BM using T2VO-induced cognitive deficits in mice, an animal model of vascular
dementia, and to investigate the constituent(s) that contribute to the action of BM using
oxygen- and glucose-deprivation (OGD)-induced hippocampal cell damage as an in vitro
model of ischemia. In in vivo experiments, T2VO mice were treated daily with BM (50
and 100 mg/kg, p.o.) 1 week before and continuously 3 days after operation. In in vitro
experiments, OHSCs were incubated with triterpenoid saponins from BM (bacosides) or
MK-801 1 hr before and during a 45-min period of OGD. Neuronal cell damage in
OHSCs was analyzed by PI uptake 24 hr after OGD. BM treatment significantly and
dose-dependently ameliorated T2VO-induced impairment of spatial cognitive
performance in the water maze test. In in vitro experiments using OHSCs, among the
bacosides tested, bacopaside I (25 μM) was found to have a potent neuroprotective
action against OGD-induced neuronal cell damage. Double staining with TUNEL and
PI revealed that OGD caused necrosis and apoptosis and that bacopaside I attenuated
the effects of OGD. The neuroprotective effect of bacopaside I was blocked by a PKC
inhibitor Ro-31-8220 and a PI3K inhibitor LY294002 but not by an ERK inhibitor
-4-
U0126. OGD reduced the level of phospho-Akt (p-Akt), an anti-apoptotic factor, in
OHSCs. This decrease was reversed by bacopaside I. Moreover, it was found that
treatment with bacopaside I itself was able to increase the level of p-Akt in OHSCs.
These findings suggest that BM is beneficial for prevention of cognitive deficits related
to cerebral ischemia and that bacopaside I, via PKC and PI3K/Akt mechanisms, plays a
role in the neuroprotective effect of BM.
References
1. Le T.X., Pham H.T.N., Do P.T., Fujiwara H., Tanaka K., Li F., Nguyen T.V., Nguyen
K.M., Matsumoto K. Bacopa monnieri ameliorates memory deficits in olfactory
bulbectomized mice: Possible involvement of glutamatergic and cholinergic systems.
Neurochem Res., 10: 2201-2215, 2013.
2. Inada C., Le T.X., Tsuneyama K., Fujiwara H., Miyata M., Matsumoto K. Endogenous
acetylcholine rescues NMDA-induced long-lasting hippocampal cell damage via
stimulation of muscarinic M1 receptors: Elucidation using organic hippocampal slice
cultures. Eur J Pharmacol., 699: 150-159, 2013.
3. Le T.X., Pham H.T.N., Nguyen T.V., Tanaka K., Matsumoto K.. Protective effects of
Bacopa monnieri on ischemia-induced cognitive deficit: a possible contribution of
bacopaside I and the underlying mechanism. (Manuscript in preparation for
submission).
-5-
学位論文審査の要旨
今日，人口の高齢化が世界的に進行し，それに伴った認知症高齢者数の急増が国
際的な問題となっている。認知症は介護支援に要する医療経済的負担が大きく，社
会経済的損失も大きい疾患である。また発症までの経過期間が数十年に及ぶ疾患で
あることから有効且つ安全で長期間摂取可能な予防的治療薬の開発が重要となっ
ている。
本研究では東南アジア地域で知的機能の改善に古くから用いられ，野菜としても
食される伝統薬 Bacopa monnieri (BM)に着目した。本伝統薬およびセチルコリン
(ACh)分解酵素阻害薬の認知障害改善効果を薬理学的に解析することにより，それ
らの神経損傷抑制効果と作用分子機構に関する新知見を得て，予防的治療薬として
の可能性を示唆した。
研究成果の概要と審査結果は以下のとおりである。
（１）嗅球摘出マウスの記憶障害に対するBacopa monnieriの改善効果：グルタミ
ン酸及びアセチルコリン神経系の関与
嗅球摘出マウスの認知障害及び中核野コリン神経細胞変性脱落等の脳組織変化
を指標に BM および参照薬 ACh 分解酵素阻害薬タクリン（ THC）の効果を解析し
た。その結果，これらの薬物により嗅球摘出動物で発症する短期記憶，空間的作業
記憶及び長期恐怖記憶の障害が改善されることを明らかにした。学習記憶の分子機
構としてのグルタミン酸受容体シグナリングと中核野コリン神経を解析したとこ
ろ，BM および THA は何れも嗅球摘出によるシグナリング機能の低下，コリン神
経細胞の変性脱落，および側脳室の拡大を抑制し，さらに BM の効果には一部，内
-6-
在性 ACh が関与することを明らかにした。これらの成果から BM が長期摂取可能
な認知症の予防的治療薬となる可能性を提示した。
（２）NMDA-誘発の持続性海馬細胞損傷に対する内在性アセチルコリンの M1受容
体を介した保護作用：海馬組織培養系を用いた検討
これまでの研究から中枢コリン神経系が学習記憶に重要であるだけでなく，コリ
ン神経細胞自身を含めた神経細胞の保護にも関わる可能性が示唆された。この可能
性を検証するために，学習記憶行動に重要な海馬の組織培養系を用い，興奮性毒性
誘発の神経細胞損傷に対する内在性AChの役割と分子機構を検討した。培養海馬組
織に低濃度NMDAを24時間曝露後，通常の培養液に戻し，PI染色により細胞損傷を
経時的に解析した。その結果，興奮性毒性により少なくとも6日後まで神経細胞損
傷を持続的に誘導できる系を構築できた。この系を用い，THAやドネペジルなどの
ACh分解酵素阻害薬の効果を検討したところ，何れも神経細胞損傷を軽減する作用
を有し，その作用の発現には内因性AChを介したムスカリン性M1受容体-PKCシグ
ナリング系の促進が重要であることを明らかにした。これらの成績は，神経細胞損
傷の抑制救助機構としての内在性アセチルコリン－ムスカリン性 M1受容体系の新
たな役割を示すほか，BMが認知障害改善効果を発現する機序の一部に関わること
を示唆した。
（３）伝統薬物Bacopa monnieriの脳虚血誘発の認知障害に対する保護効果：含有
サポニンBacosideの寄与とその作用機序
興奮性毒性はβ-アミロイドや脳虚血等による神経細胞損傷や神経細胞死に関わる。
そこでBMの認知症の予防治療における汎用性を検討する為，一過性脳虚血モデル
-7-
を用い，脳虚血誘発の認知障害に対するBMの保護作用を解析し，培養海馬組織の in
vitro 虚血モデルを用いて含有サポニンの役割と作用機序を評価した。その結果，
BM投与は脳血管性認知症に対しても予防的効果を発揮することが明らかとなった。
また，低酸素-低グルコースメディウム曝露で誘導した培養海馬神経組織の損傷を指
標に，BMが含有する数種主要サポニンの保護効果を検討した結果， Bacopaside I
に保護効果を認め，その効果にPKCおよびPI3K/Aktシグナリング系が関与すること
を突き止めた。さらにBacopaside IそのものにAktリン酸化体レベルを上昇させる
活性を有することを見出し，BMの神経保護効果に寄与している可能性を示唆した。
以上のように，本研究は認知症動物モデル及び興奮性毒性モデル系を用い，野菜
としても食される伝統薬物BMの有効性とそれを裏付ける作用機序を，アセチルコ
リンエステラーゼ阻害薬と比較しつつ，薬理学的に明らかにしたものである。また
本研究は中枢コリン神経系の賦活が神経細胞の損傷抑制機構としても機能するこ
とを明らかにし，認知症の予防機構として新たな可能性を提示している。得られた
研究成果は，認知症に対する有効な予防的治療薬の創出や予防方法の開発に繫がる
と期待され，意義がある。
主査及び副査は，Le Thi Xoan との面談試験および論文内容についての審査を行
い，博士（薬学）の学位を授与するに値すると判定した。
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