T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase
Cat No. CH-0801
【目的・用途】
【使用方法 1】
本酵素は二本鎖ヌクレオチドの隣接した 5 リン酸末端と 3'ヒドロキシル末端
とのホスホジエステル結合の形成を触媒します。二本鎖 DNA、二本鎖 RNA、
下記試薬をピペッティングにより穏やかに混合し、スピンダウンします。
DNA/RNA ハイブリッドの平滑末端および粘着末端を結合でき、ニックの修
復も可能です。一本鎖ヌクレオチドには作用しません。
【特徴】
１）高効率
粘着末端の結合
１）反応溶液の調製 (20uL の場合)
容量
終濃度
Linear vector DNA
試薬
X uL
20-100 ng
Insert DNA
Y uL
10×Ligation Buffer
２）粘着末端の結合は 22℃、10 分で終了
３）平滑末端の結合は 22℃、1 時間で終了
T4 DNA Ligase(5U/uL)
超純水
Insert : vector
1:1-5:1※
2 uL
1×
0.2 uL
1U/20uL
up to 20 uL
※ モル比
２）22℃、10 分間インキュベートします。
【キット内容】
内容
容量
T4 DNA Ligase (5U/uL)
20 uL (100U)
10×Ligation Buffer
250 uL
50% PEG Solution
150 uL
３）65℃、10 分間または 70℃、5 分間インキュベートし、T4 DNA Ligase
を失活させます。
４）1-2uL の反応溶液を 50uL のコンピテントセルに加え、形質転換します。
【使用方法 2】
【保存方法】
平滑末端の結合
１）反応溶液の調製 (20uL の場合)
-20℃
下記試薬をピペッティングにより穏やかに混合し、スピンダウンします。
試薬
【組成】

終濃度
X uL
20-100 ng
Insert DNA
Y uL
T4 DNA Ligase 保存バッファー
20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 % glycerol
(pH 7.5 at 25℃)

容量
Linear vector DNA
10×Ligation Buffer
400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP
(pH 7.8 at 25℃)
Insert : vector
1:1-5:1※
10×Ligation Buffer
2 uL
1×
T4 DNA Ligase(5U/uL)
1 uL
5 U/20uL
2 uL
5%
50% PEG Solution
超純水
up to 20 uL
※ モル比
【由来】
２）22℃、1 時間インキュベートします。
Escherichia coli carrying the plasmids that enable highly expression of T4
DNA Ligase gene
３）65℃、10 分間または 70℃、5 分間インキュベートし、T4 DNA Ligase
を失活させます。
４）1-2uL の反応溶液を 50uL のコンピテントセルに加え、形質転換します。
【ユニットの定義】
37℃、20 分間で 1 nmol の[32PPi]を Norit 活性炭吸着性物質に変換する T4 DNA
Ligase 活性を 1 Weiss Unit とする(1)。
本酵素 1U（Weiss Unit) は 200 cohesive
end ligation units (CEU )に相当します。
※
【使用方法 3】
下記試薬をピペッティングにより穏やかに混合し、スピンダウンします。
反応液組成：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 66 uM ATP,
3.3 uM [32PPi]
※1 CEU はλDNA-Hind III 分解物を 16℃で 30 分間に 50%以上ライゲーショ
ンさせる酵素活性です。
【使用上の注意】
 T4 DNA Ligase の終濃度は推奨容量を超えないようにしてください。過剰
量の T4 DNA Ligase は結合効率の低下の原因となります。
 PEG を加えることにより、平滑末端の結合効率を大幅に改善できます。
平滑末端の結合には終濃度 5%となるように反応系に加えます。
 形質転換に使用する Ligase 反応済みのプラスミドは細胞の容量の 10%を
DNA の閉環
１）反応溶液の調製 (50uL の場合)
試薬
Linear vector DNA
容量
終濃度
X uL
5-50 ng
10×Ligation Buffer
5 uL
1×
T4 DNA Ligase(5U/uL)
1 uL
5 U/20uL
超純水
up to 50 uL
２）粘着末端の場合は 22℃、10 分間、平滑末端の場合は 22℃、1 時間
インキュベートします。
３）65℃、10 分間または 70℃、5 分間インキュベートし、T4 DNA Ligase
を失活させます。
４）1-2uL の反応溶液を 50uL のコンピテントセルに加え、形質転換します。
超えない量を使用して下さい。(50uL のコンピテントセルには 5uL 以下の
【参考文献】
ライゲーションサンプルを加えます。)
(1) Weiss, B., et al., Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic
 T4 DNA Ligase には glycerol が含まれているため、ピペットチップの外壁
に接着しやすくなっています。容量を正確に量り取るため、T4 DNA
Ligase 溶液を採取する際にはピペットチップを溶液深く入れないでくだ
さい。
acid, J. Biol. Chem., 243, 4543-4555, 1968.

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