胃 MALT リンパ腫における高レベルの FOXP3 陽性の制御性 T 細胞は、 Helicobacter pylori 除菌の反応性を予測する 抄 訳 中村 正彦（北里大学薬学部臨床薬学研究・教育センター臨床医学病態解析学） High Levels of FOXP3+ Regulatory T Cells in Gastric MALT Lymphoma Predict Responsiveness to Helicobacter pylori Eradication Yugo Iwaya,*,†,1 Motohiro Kobayashi,*,1 Masanobu Momose,‡ Nobuyoshi Hiraoka,§ Yasuhiro Sakai,* Taiji Akamatsu,† Eiji Tanaka,† Haruo Ohtani,¶ Minoru Fukuda** and Jun Nakayama* *Department of Molecular Pathology, Shinshu University Graduate School of Medicine, Matsumoto, Japan, of Medicine, Division of Gastroenterology and Hepatology, Shinshu University School of Medicine, Matsumoto, Japan, ‡Department of Laboratory Medicine, Shinshu University Hospital, Matsumoto, Japan, § Division of Molecular Pathology, National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan, ¶ Department of Pathology, Mito Medical Center, National Hospital Organization, Ibaraki, Japan, ** Tumor Microenvironment Program, Cancer Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA, USA †Department 要 約 背景：Helicobacter pylori（H. pylori ）除菌は胃 MALT リンパ腫の第 1 選択療法だが、およそ 25％の患 者は治療に反応しない。CD4 陽性、FOXP3 陽性制御性 T 細胞（Treg）は、生理的状態および H. pylori 関 連疾患を含めた様々な炎症における免疫反応を調整する。我々の目的は、Treg が H. pylori 除菌療法の反応 性にどのように影響するかを明らかにすることである。 対象と方法：MALT リンパ腫 63 例と慢性活動性胃炎 55 例の胃における FOXP3 陽性 Treg の H. pylori 陽 性率を評価するために CD4 と FOXP3 の二重染色免疫組織化学を施行した。 結果：リンパ腫において FOXP3 陽性 /CD4 陽性細胞比と高倍率下の FOXP3 細胞の絶対数は、H. pylori 除菌反応者において、非反応者より有意に多かった。この結果は、MALT リンパ腫退縮機構において Treg が機能していることを示唆する。良好な感受性、特異性のカットオフ値は除菌の結果を予測するために決め られた。 結論：胃 MALT リンパ腫における Treg 細胞の高値あるいは全 CD4 陽性 T 細胞数に対する Treg 細胞の高 率は除菌療法に対する反応性を予測できる。 キーワード：胃 MALT リンパ腫、ピロリ菌、除菌反応性、FOXP3、制御性 T 細胞 対象と方法 びまん性大細胞型 B 細胞性リンパ種（DLBCL） 染色）標本が、経験ある病理医により再調査された。 Helicobacter pylori（H. pylori ）感 染 については、 成分のない MALT リンパ腫患者 63 例と、Updated 病理と培養法の併用により確認された。t（ 11;18）/ Sydney System で 評 価 した 著 明 な 単 核 球 浸 潤 を API2/MALT1 陰性の H. pylori 陽性 MALT リンパ 伴った慢性活動性胃炎患者 55 例の胃粘膜生検標本 腫症例はプロトンポンプ阻害薬（PPI）と 2 種類の のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを信 抗生剤の組み合わせにより治療された。除菌後 州大学検査部の病理保管部より集めた。病理診断 Groupe d’ Etude des Lymphomes de l’ Adulte を確定するためヘマトキシリン・エオジン染色（HE （GELA）分類により評価され、反応者は、治療後 © 2013 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 18: 356–362 13 Vulcan Fast Red Chromogen Kit 2 (Biocare Medical, Concord, CA, USA). To strip bound antibodies, sections were boiled in 10 mmol/L Tris/HCl (pH 8.0) containing 1 mmol/L EDTA in a microwave oven for 10 minutes. To quench endogenous peroxidase activity, sections were soaked in absolute methanol containing 0.3% hydrogen peroxide for 30 minutes. Sections were then incubated with anti-human FOXP3 antibody (clone #42, mouse IgG) [25] for 1 2 年後の経過観察で完全 hours followed by a 30の生検組織が少なくとも minutes incubation with horseradish peroxidase EnVi寛解 あるいは微小遺残のものと定義した。今回の sion. The color reaction was developed with ImmPACT SG Peroxidase Substrate Laboratories, Burlin検討では、従来の報告 （(Vector 25%）に比べ非反応者の率 game, CA, USA). tric mucosa, promoting disappearance of proper gastric glands (Fig. 1, left panels). As an indicator of MALT lymphoma, we chose chronic active gastritis extensively infiltrated by mononuclear cells with occasional formation of secondary follicles (Fig. 1, right panels). FOXP3+ Treg cells (black) were distributed sparsely in the が 36％と高率だったが、これは、通常非反応者は 化学療法および放射線療法の可能性検討のため大 + + Quantification of CD4 and FOXP3 Cells 学病院に移されることによる可能性が高い。 Immunostained sections above were observed under a BX-51 light microscope (Olympus, Tokyo, Japan). For each specimen, we chose at least three different HPFs 二重免疫組織化学 at a magnification of 9 400 in the lamina propria with-P out電子レンジにより抗原賦活し、CD4 epithelial components or lymphoid 抗体は follicles,Aland + + the number of respective CD4 and FOXP3 lymphoを用いた酵素抗体間接法を施行、FOXP3 に関し cytes was counted in the same field. The FOXP3+/CD4+ ては、内因性ペルオシターゼ活性をブロック後、ペ cell ratio was calculated for each field as described previously [25], and averages were compared. Quantificaルオキシターゼを用いた酵素抗体間接法により二重 tion of CD4+ and FOXP3+ cells was carried out by a 染色が行われた。 single observer (YI) after training by an experienced pathologist (MK). CD4 陽性、FOXP3 陽性細胞の定量化 Statistical Analysis 免疫組織化学標本は BX-51 顕微鏡により観察さ Differences between groups were statistically analyzed れ、少なくとも 3 カ所の上皮細胞のない粘膜固有層 using the Mann–Whitney U-test using GraphPad Prism 内の CD4 陽性および 陽性細胞を 400 倍で、 5 software (GraphPad FOXP3 Software, La Jolla, CA, USA). Predictive values were calculated using receiver operat同じ視野で算定し、その比率も計算した。 ing characteristic (ROC) analysis. The Youden index 結 果 図 1． 胃 MALT リ ン パhistology 腫 と 慢 性of活gastric 動 性 胃MALT 炎の代 表 的 組 織and 像 Figure 1 Representative lymphoma chronic（HE active染色、上 gastritis. 2Hematoxylin eosin (H&E) sections in the 段）およびand FOXP3（黒色） 、CD4（赤 second 色）二重染色像（下段） row are enlarged from boxes in the陽性リンパ球のほとん top row. The panels in 。FOXP3 the bottom show dual immunohistochemistry for FOXP3 (black) どは row CD4 陽性である。 and CD4 (red). Note that almost all lymphocytes positive for FOXP3 are also positive for CD4. Bar, 200 lm in the top row and 50 lm in the remaining panels. FOXP3 陽 性 /CD4 陽 性 細 胞 比 を 比 較 すると、 MALT リンパ腫でその比が有意に高いことから、 358 陽性 FOXP3 陽性 Treg 細胞が MALT リンパ CD4 © 2013 John Wiley陽性細胞中の & Sons Ltd, Helicobacter 18: 356–362 MALT リンパ腫では CD4 Treg が相 腫と慢性活動性胃炎で浸潤している 対的に多いことが明らかとなった。 MALT リンパ腫と慢性活動性胃炎症例の胃粘膜 内における全 CD4 陽性 T 細胞における FOXP3 陽性 H. pylori 除菌反応性 MALT リンパ腫では、非反 応者より FOXP3 陽性 /CD4 陽性細胞比が高い Treg の割合を決定するために、CD4 と FOXP3 の FOXP3 陽 性 /CD4 陽 性 細 胞 比 と Helicobacter 二重免疫組織化学を施行した。図 1 に示されるよう pylori（H. pylori ）の感染状態との関係を明らかに に MALT リンパ腫標本では、CCL 様（centrocyte- するため、H. pylori 陽性MALTリンパ腫とH. pylori like）のリンパ球が胃粘膜固有層内でびまん性に増 陰性 MALT リンパ腫に分け、その比を検討すると、 加し、胃腺組織の消失を促進していた。MALT リ H. pylori 陽性群で有意に高かった（図 2 B）。さら ンパ腫の対照として、2 次性リンパ濾胞の形成を伴 に、除菌に対する反応を検討すると反応群で非反 う単核球の広範な浸潤を伴う慢性活動性胃炎を選 応群よりその比が有意に高かった（図 2 C）。 んだ。FOXP3 陽性 Treg は両疾患の胃粘膜固有層 内に散在して認められたが、CD4 陽性 T リンパ球 高倍率視野下の FOXP3 陽性細胞数 は、胃 MALT は慢性活動性胃炎に比べ MALT リンパ腫ではそれ リンパ腫の除菌反応性を予測させる ほど多くなかった。FOXP3 陽性リンパ球はすべて MALT リンパ腫と慢性活動性胃炎における高倍 CD4 陽性であることから、CD4 陽性細胞のサブセッ 率視野下の FOXP3 陽性細胞数には有意な差はな トであることが示された。 かったが、H. pylori 陽性 MALT リンパ腫では陰性 14 Fig. 2B, the FOXP3+/CD4+ cell ratio in H. pylori-positive MALT lymphoma was significantly higher than that seen in H. pylori-negative MALT lymphoma (p = .010). We then evaluated the relationship between the FOXP3+/CD4+ cell ratio and eradication responsiveness H. pylori-positive MALT MALT lym胃 MALT リンパ腫における高レベルの FOXP3 陽性の制御性 in T 細胞は、 Helicobacter pylorilymphoma. 除菌の反応性を予測する phoma cases that subsequently received H. pylori eradication therapy (n = 36) were divided into two groups: 考 察 A responders (n = 23) and nonresponders (n = 13). As + shown in Fig. 2C, the FOXP3+/CD4pylori cell （ ratio in eradiHelicobacter H. pylori ） 今回の検討から cation responders was higher than that in nonrespond除菌療法を受けた H. pylori 陽性 MALT リンパ腫の ers with high statistical significance (p < .001). Fig. 2A, that ratio in gastric MALT lymphoma was higher than it was in chronic active gastritis (p < .001), indicating a relative abundance of Treg cells among CD4+ cells in MALT lymphoma, a finding consistent with a previous report [8]. 中で、反応者で CD4 陽性 T 細胞中の FOXP3 陽性 Treg が有意に多いことが明らかとなった。二重の A Higher FOXP3+/CD4+ Cell Ratio Predicts Eradication Responsiveness in Gastric MALT 免疫組織化学は日常の病理学的検討には煩雑であ Lymphoma り、高倍率における FOXP3 陽性細胞数を検討する + + To determine the best FOXP3 /CD4 cell ratio cut-off ことでも H. pylori 陽性 MALT リンパ腫の除菌反応 point to predict eradication responsiveness in H. pylori- B positive MALT lymphoma, we carried out receiver 性の予測に役に立ちうることが示唆された。この operating characteristic (ROC) analysis. The area under the curve of the ROC was .893 (95% confidence inter陽性細胞比の報告と一致した。 val .785-1.000). Using the Youden index, the best cutoff point for the FOXP3+/CD4+ cell ratio was .14 with a H. pylori 除菌療法に反応する MALT リンパ腫に sensitivity of 95.7%, specificity of 69.2%, and positive FOXP3 陽 性 predictive Treg が 多values い理由 陽性 and negative of は、FOXP3 84.6% and 90.0%, respectively (p < .001; see dotted line in Fig. 2C). This Treg が多いと高い免疫抑制効果が得られるからと result indicates that the FOXP3+/CD4+ cell ratio can be 考えられる。慢性活動性胃炎症例ではエフェクター used to predict eradication responsiveness in H. pyloripositive MALT lymphoma. 細胞傷害性 T 細胞が多いことが報告されていること 所見は最近の Garcia らの FOXP3 陽性細胞 /CD3 C から、MALT リンパ腫におけるエフェクター T 細胞 The Number of FOXP3+ Cells/HPF Also Predicts Eradication Responsiveness in Gastric MALT の MALT リンパ腫における免疫反応は、エフェク Lymphoma と Treg のバランスを考慮する必要がある。反応性 ター細胞と Treg が誘導されている正常の炎症に近 We next evaluated the number of FOXP3+ Treg cells per HPF in gastric MALT lymphoma and chronic active いと考えられるが、非反応群では Treg は少ない。 gastritis samples. As shown in Fig. 3A, the number of このことは、腫瘍形成性は非反応群でより強いと FOXP3+ cells/HPF between the two conditions did not Figure Comparison the FOXP3 /CD4 cell ratio between MALT 図 2．2FOXP3 陽性 of /CD4 陽性細胞比 A：MALT リンパ腫と lymphoma and chronic active H. pylori gastritis (A), between MALT Helicobacter 慢性活動性胃炎、B： 陽性、陰性 リン pylori-positive and H. pylori-negative MALT lymphoma (B), and パ腫、C：除菌反応者、非反応者 between eradication responders and nonresponders (C). Box plots illustrate the medians and the 25th and 75th percentiles. Dotted line in (C) shows the best cut-off point. + + differ significantly (p = .140). On the other hand, the 考えられる。 number of FOXP3+ cells/HPF in H. pylori-positive MALT Dogan らは末梢リンパ節アドレシン（PNAd）発 lymphoma was greater than that seen in H. pylori-nega現高内皮細静脈 （HEV） リンパ腫で誘導 tive MALT lymphoma (pが = MALT .001; Fig. 3B). Moreover, among H. pylori-positive MALT lymphoma cases, the されることを報告している。HEV 類似の血管上に優 先的に発現することを報告した。また、L-selectin 群より有意に高く、さらに H. pylori 陽性群の中で 発現 FOXP3 陽性 Treg はおそらくこれらの HEV 経 359 © 2013 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 18: 356–362 H. pylori 除菌反応群では非反応群より有意に高 由で誘導される。Treg 細胞は胸腺由来だけでなく、 かった。このことから、煩雑な二重染色を行わなく 末梢で T 細胞受容体経由のシグナルと形質転換成 ても FOXP3 陽性細胞数を評価することが除菌反応 長因子 β 経由で形成され、これが胃 MALT リンパ 群の予測因子になることが示された。さらに受信 腫に対する抗炎症、抗腫瘍作用を発揮すると考え 者操作特性（ROC）解析の結果から、FOXP3 陽性 られる。こういった機構の総合的解析が、この疾患 細胞が 65以上は除菌反応者、6未満は非反応者だっ の治療戦略を考える上で必要であろう。 た。 15 16 胃 MALT リンパ腫を構成するのは、B リンパ球の は抑制的に作用することを示唆している。今後注目さ 集族だが、その形成には T 細胞が必須であることはよ れるのは、この Treg の誘導機構との関連だが、Treg く知られている。本論文は、その T 細胞のうち Treg 自体が別の機能を持った細胞に変化することも指摘さ は、除菌反応性に促進的に働き、さらに腫瘍形成性に れており、その観点からの解明も必要であろう。
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