さかいかずあき氏名（本籍）学位の種類酒井和明（東京都）博士（薬学）学位記番号論博第 330号学位授与の日付平成 26 年 3 月 20 日学位授与の要件学位規則第 4 条第 2 項該当学位論文題目小児臨床試験のための高感度定量分析法の開発とその応用論文審査委員（主査）教授楠文代教授渋澤庸一教授井上勝央教授古田隆論文内容の要旨バイオアナリシスは，生体試料中（血漿・血清，尿や組織など）の医薬品や内因性成分などの測定に用いられる分析の総称である．この分析法は，今日の医薬品の承認申請において，医薬品の未変化体や代謝物，バイオマーカーなどの生体内における挙動（動態）を明らかにし，有効性や安全性の議論に必要な情報を得るために不可欠な技術である．医薬品の開発では治療効果や副作用をメカニズムベースで解釈し，最適な用法・用量を設定するために信頼性の高い分析法が求められる．小児臨床試験では特に小児特有の病態や薬効メカニズムの有無に基づいて最適な用法・用量を検討する．しかし，日本における小児のバイオアナリシスの事例は必ずしも豊富とはいえない．これは小児臨床試験では成人に比較して治験参加のハードルが高く，その一つに検体採取における負担がリスクとベネフィットの関係に影響するためと考えられた．小児臨床試験への適用を考えたバイオアナリシスでは，できる限り検体の採取頻度や採取量を減らし，分析の精度を上げることが求められる．一般に分析値の妥当性は，分析法バリデーション（ Bioanalytical Method Validation; BMV）により検討される．今日の BMV は，低分子医薬品の高速液体クロマトグラフィー・質量分析法（ LC-MS/MS）による測定を前提とした評価項目と判断基準に基づき，その概念は確立されている． BMV の評価では，主に分析対象物を含まないブランクマトリックス中に既知量の分析対象物を添加した QC 試料を用いるが，実測定の実施前に検討するプレスタディーバリデーションと，実測定中に確認するインスタディーバリデーションの二つがある．後者は，検量線の当てはまりと QC 試料による測定単位の保証及び ISR（ Incurred Sample Reanalysis）など実試料を用いた検証法が推奨されている．しかし，実試料を用いたバリデーションでは検証用に検体が必要となり，小児臨床試験では採血の負担を増やすことは好ましくない．申請者はマトリックスの影響を受けにくい分析法を確立し，事前のバリデーションにより評価目的に合わせた検証を実施することで小児臨床試験における分析法の信頼性は得られると考えた．本論文では，小児臨床試験への適用を前提に， BMV の概念が確立されている ① 吸入ステロイド剤の血中薬物濃度測定について検証し，実際に小児臨床試験への応用により有用性を確認した．その検証に基づいて現時点で統一的な BMV の概念が確立されていない②バイオマーカーの血清中濃度測定及び③バイオ（抗体）医薬品の血中薬物濃度の測定について，信頼性の高い分析値を得るための測定系構築とバリデーション項目の検討法・評価基準について研究した．更に，バリデートされた測定法を小児臨床試験に応用し，血清中濃度推移や薬物動態について評価した．第 1章 APPI-LC-MS/MS 法による吸入ステロイド剤 Ciclesonide の薬物動態解析日本人小児気管支喘息患者を対象に，新規吸入ステロイド剤である Ciclesonide 投与時のヒト血清中濃度測定法に関する基礎研究を行った．Ciclesonide はプロドラッグであり，肺局所で活性代謝物 Ciclesonide M1 に変換されるため，二成分の同時分析法を構築した．小児臨床検体測定の視点から，高感度化のために大気圧光イオン化法 APPI-LC-MS/MS 法を検討し，国内健康成人で測定に用いた APCI-LC-MS/MS 法より少量の血清で分析が可能となった．確立した分析法の妥当性を検証するためバリデーション試験として①選択性，②検量線，③日内及び日間の真度及び精度，④定量限界， ⑤マトリックス効果，⑥希釈妥当性，⑦血清中安定性を検証した．バリデーション試験の結果，ヒト血清中で 10～ 1600 pg/mL の範囲で本法の妥当性が確認された．ここで，選択性は海外の結果と比較することを考慮し， BMV ガイドラインの要求例数の倍にあたる，日本人及び白人の男女それぞれ 3 例の計 12 例について検討し，測定系に対する個人間差の影響がないことを確認した．マトリックス効果においても同じく 12 例でのマトリックスファクターの算出と添加回収値を評価し，実試料分析における異常値発生の可能性が低いことを確認した．確立した APPI-LC-MS/MS 法を日本人小児臨床試験における血中薬物濃度測定に応用した．全ての実測定値バッチはインスタディーバリデーションにより妥当性を確認した．各測定バッチは，測定開始時に検量線 1 セットを配置し，実試料の測定中の変動を検知するため，測定用 QC 試料（既知濃度を添加したプール血清：3 濃度水準各 2 本）を実試料に対して等間隔に配置して，測定バッチ全体の変動を確認した．測定バッチの採用基準として，検量線と QC 試料の真度（理論値からの偏差は ±15%以内）と合格率（ 4/6 以上）を予め設定し，実測定バッチでの逸脱は認められなかった．また，実試料の保管条件での安定性は併行保存 QC 試料を，採血から測定まで実試料と同条件で冷凍保管・移動させ，輸送を含む保管中に分解等が無いことを確認した．日本人小児気管支喘息患者 8 名に Ciclesonide 製剤 (CIC-HFA) 200 µg/day を 7 日間反復吸入投与したときの Ciclesonide 及び Ciclesonide M1 を測定した． Ciclesonide M1 の血清中濃度推移を海外白人小児患者の推移と比較した（ Fig. 1）． Ciclesonide の吸入製剤を服用したときの小児における血中活性代謝物濃度推移には大きな違いは見られず，人種もしくは臨床試験の間に差はないと考えられた．十分に妥当性を検証した APPI-LC-MS/MS 法によって， Fig.1. Time course of serum Ciclesonide M1 level in Japanese children (●) and Caucasian children (○) following repeated CIC-HFA administration (200 µg/day ). Each point indicates the mean (SD) or Japanese children with bronchial asthma (N=8) and Caucasian children with bronchial asthma (n=33). 吸入ステロイド剤の日本人小児における臨床薬物動態試験が評価可能となり，小児の人種差に関する知見に基づいた議論が可能となった．第 2章血清中バイオマーカー Shiga toxin 2（ Stx-2）の化学発光免疫測定 O157 など志賀毒素産生性大腸菌（ Shiga toxin-producing E. coli ; STEC）に感染した小児患者では，下痢の後に血便症状を呈し，溶血性尿毒症症候群（ hemolytic uremic syndrome; HUS）に移行して死に至る場合がある．志賀毒素（ Shiga-like toxin)のうち，Stx-2 は HUS の進行に関連していると考えられるが，これまでに血中の Stx-2 濃度を正確に定量した事例はなく， STEC の感染と血中毒素濃度の検討は報告されていない．そこで，血清中 Stx-2 濃度の超高感度定量法として化学発光 -ELISA を開発し，血清中 Stx-2 を定量した．構築した分析法の妥当性を検証するため分析法のバリデーションを実施した．①検量線，② 日内及び日間の真度及び精度，③ 定量限界，④ 定量範囲，⑤ 特異性／選択性， ⑥ 希釈妥当性， ⑦ 血清中 Stx-2 保存安定性について検証した結果，ヒト血清中で 6.0 pg/mL～ 300 pg/mL の範囲で本法の妥当性が確認された．ここで，個人別血清で非特異的なシグナルが観測され，実測定において Stx-2 偽陽性が 5/30 例の割合で発生する可能性が示唆された．リガンド結合法（ LBA）の留意事項について記述のある欧州医薬品庁（ EMA）の BMV ガイドラインでは 2 割以内の偽陽性は許容される頻度であるが，本研究では解析上のノイズとなり結果への影響が考えられた．そこで中和試験を組み込み，偽陽性の判断が可能となった．小児患者における血清中 Stx-2 濃度測定への応用として，季節性の食中毒が発生する頻度の高いアルゼンチンで臨床研究における疫学調査を実施した． 93 名の STEC 感染小児患者から得られた 313 検体のうち， Stx-2 が定量限界（ 6.0 pg/mL）以上の検体は患者 8 名由来の 10 検体のみであった．STEC 陽性で水様性便から血便に移行しなかった患者では Stx-2 は定量限界未満であった．一方， STEC 陽性で血便を発症した患者の一部では血便が観察さ Fig.2. Serum Stx-2 levels by elapsed time relative to onset of bloody diarrhea (BD) for subjects ●: HUS subjects; ○: non-HUS subjects. れた直後に血清中で Stx-2 が上昇した．今回検出された Stx-2 は血便発生直後の採血可能ポイントで最高 17.3 pg/mL であり，その消失は非常に速やかであった． Stx-2 が検出された患者の 8 例中 3 例の病態は HUS に移行した（ Fig. 2）．以上，血清中 Stx-2 濃度の測定において，医薬品の BMV クライテリアを満たし，かつバイオマーカーとしての評価目的に合致した分析法を確立した．本法によって，初めて O-157 感染時の血清中 Stx-2 濃度と血便や HUS 発症の関連性が明らかとなった．第 3章 ELISA 法による血清中 Urtoxazumab の薬物動態解析新規ヒト型化抗体である Urtoxazumab は血中で Stx-2 の標的結合部位に特異的に結合する毒素中和抗体であり，主に小児で発症する HUS による死亡を防ぐことが期待される． Urtoxazumab の血清中薬物濃度測定法は抗イデオタイプのマウスモノクローナル抗体（ MAb1F4）を用いたサンドイッチ ELISA 法を採用した．分析法の妥当性を検証するため，バリデーション試験として，①検量線，②日内及び日間の真度及び精度，③定量限界，④特異性，⑤選択性，⑥希釈妥当性，⑦血清中安定性を検証した．ヒト血清中で 0.2～ 10 g/mL の範囲において本法の妥当性が確認された．本測定法を実際の臨床試験における血清中 Urtoxazumab 濃度の定量に応用し，海外 Ⅰ 相試験にて健康成人及び第 Ⅱ 相試験にて小児患者に Urtoxazumab を静脈内投与した時の血清中薬物濃度推移を明らかした．更に国内健康成人における血清中薬物濃度を測定し，薬物動態を評価した．臨床試験全体を通じて投与量 0.1 mg/kg～ 6 mg/kg まで，血清中 Urtoxazumab 濃度は用量依存的に推移することが確認された．以上，バイオ医薬品の小児臨床試験において，バリデートされた ELISA 法の測定結果は信頼できるものであり，投与量の設定に重要な情報を与えた．総括本研究では小児臨床試験で検証に高感度測定法が必要となる分析対象物として，① 低分子医薬品（吸入製剤），② バイオマーカー，③ バイオ医薬品のヒト血清中分析法を開発し，バリデーション試験により妥当性を確認した．小児臨床試験にフォーカスして感度・精度と選択性を高めた測定法は，実際の臨床試験への適用においても信頼性の高い結果を示し，病態の考察や薬物動態の人種差，年齢差の検討において新たな知見を得た．本研究における BMV の評価項目や評価方法の考え方は，小児臨床試験の様な希少な検体測定の信頼性確認に効果的であり，今後の国内小児臨床試験を推進に貢献できるものである．【研究結果の掲載誌】 1) Pediatr Infect Dis J. 2012 Jan; 31(1):20-4 2010 Jan; 54(1):239-43. 2) Antimicrob Agents Chemother 3) Allergol Int, 2012 Dec; 61(4):619-24