ヒト再生医療の実現に ヒト再生医療の実現に向けた 再生医療の実現に向けた イヌiPS細胞の 細胞の創製 イヌ 細胞の創製 大阪府立大学 大学院生命環境科学研究科 獣医学専攻 教授 稲葉 俊夫 1 イヌについて 獣医療の発達 ヒトと共通の疾患 ヒトと共通の生活環境 2014年 イヌ飼育頭数：1,035万頭 イヌ飼育家庭：830万世帯 /5,450万世帯 室内飼育率：約72% イヌゲノムの 解読完了 自然発症例モデルとして 医学領域に応用できる 2 幹細胞 ES細胞 体性幹細胞 自己の細胞から iPS細胞 細胞治療 神経 肝 心筋 自己複製能 血管内皮細胞 多分化能 3 従来技術とその問題点 動物実験：マウスで得られた結果が ヒトiPS細胞 ヒトに当てはまるのか？ 疾患モデル マウス マウスiPS細胞 ？ ？ ？ 短期観察 長期観察 自然発症犬 安 有 全 効 性 性 担保 イヌiPS細胞 前臨床試験 4 イヌiPS細胞作製の意義 マウスとサルの中間の位置にある（形態、機能面で） ヒトと同様、生活習慣病などの自然発症がある マウス 安い 経費 寿命 2年 妊娠期間 20日 産子数 8～12匹 取扱い 容易 生活環境 ヒトと異なる 少ない ヒトと類似の疾病 イヌ 中程度 14年 60日 6～8頭 容易 ヒトと同じ空間 自然発症して 抽出容易 サル 高い 25年 170日 1頭 困難 ヒトと異なる 自然発症する が抽出困難 5 脊髄損傷はヒトとイヌで共通の疾患である 軸索損傷 退縮/変性 軸索再生 ・日本では10万人以上の 脊髄損傷患者が存在 ・毎年、5000～6000人以上が 新たに発症 ・日本においては人気犬種である ミニチュアダックスフントの増加 に伴い、脊髄損傷の発症数が増加 重度の場合、効果的な治療法はない 6 体性幹細胞 自己複製能 神経栄養因子の産生 神経栄養因子の産生 TGFβ-1 自家移植 間葉系幹細胞 （MSC） IL-6 他家移植 多分化能 組織傷害部位 への集積性 神経細胞 肝細胞 骨細胞 免疫抑制作用 軟骨細胞 脂肪細胞 再生医療への応用に期待 7 骨髄間質細胞の分離と性状 骨髄吸引 骨 骨髄単核細 胞を分離 Colony Forming Unit-Fibroblast （CFU-F） 脂肪 100 µm 10 µm 100 µm 神経幹細胞 8 自己骨髄間質細胞によるイヌの重度脊髄損傷の治療 イヌ重度脊髄損傷を伴った胸腰部椎間板ヘルニアの 臨床例を対象 ・ミニチュアダックスフント ・椎弓切除術により脊髄を減圧し、 脊椎を固定 ・術後1カ月の時点で運動および感覚 機能の改善が認められない コントロール群（n = 13）、投与群（n = 10）に分ける 1カ月ごとに6ヶ月間、運動および感覚機能を評価 9 自己骨髄間質細胞によるイヌの重度脊髄損傷の治療 投与方法 0.05% トリプシンEDTA 生理食塩水に懸濁 10% FBSのDMEMで培養 第5-6腰椎間 脳 脊髄 損傷部 10 自己骨髄間質細胞によるイヌの重度脊髄損傷の治療 運動および感覚機能の改善 コントロール群 （n =13） ） 歩行の改善率 痛覚の改善率 a 2/13 （15.3%） 0/13 （0%） 投与群 （n =10） ） b 6/10 （60.0%） 1/10 （10.0%） a vs b p < 0.05 ・ 両群において、排尿、排便機能に改善は認められず ・ 投与群において、副作用は認められなかった。 11 骨髄間質細胞の臨床応用における問題点 ウイルス 微生物汚染 採取時のリスク MSC 増殖能が低い 採取効率が低い 細胞の調整に 時間がかかる 12 イヌiPS細胞の作製 Klf4 C-Myc Oct3/4 Sox2 フィーダー細胞上に播種 フィーダー細胞 DOX誘導性 レンチウイルスベクター 胎子線維芽 細胞の培養 DOX誘導性レンチウイルスによる 初期化４遺伝子の導入 無血清培地で培養 iPS細胞作製～継代維持 13 初期化因子 線維芽細胞 イヌiPS細胞 イヌ 細胞 単一細胞コロニー Oct3/4 Sox2 Klf4 C-Myc 胚様体 未分化マーカーの発現 胚様体 iPS細胞 内胚葉 GATA4 外胚葉 TUJ1 核型解析 2n=78, XY型 型 正常な核型 中胚葉 DESMIN 三胚葉への分化能 14 イヌiPS細胞からMSCへの分化誘導 浮遊培養 イヌiPS細胞 イヌ 細胞 形態観察 胚様体を接着培養 胚様体形成用培地 MSC分化培地 分化培地 フローサイトメトリー 免疫染色 15 イヌiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導 イヌ 細胞から間葉系幹細胞への分化誘導 継代に伴う細胞形態の比較 iPS細胞由来 細胞由来MSC様細胞 様細胞 細胞由来 P1 P2 P5 大きな変化なし 骨髄間質細胞（BMSC） 骨髄間質細胞 P1 P2 P5 扁平・大型化 16 新技術の特徴・従来技術との比較 成体MSC 特徴： ①複数の組織から採取可能 ②細胞調整が容易 考慮すべき点： ①採取患者の多くは高齢者 で採取効率が低い ②採取時のリスク ③ウイルス・微生物汚染 ④細胞増殖能が低い ⑤製品化が困難 iPS細胞由来 iPS細胞由来MSC 細胞由来MSC 特徴： ①細胞増殖能が高い ②比較臨床試験が可能 ③有効性と安全性の検証 が可能 考慮すべき点： ①導入遺伝子の安全性 ②作製が困難 ③高価 17 新技術の応用 iPS細胞 自己複製能 神経栄養因子の産生 神経栄養因子の産生 TGFβ-1 間葉系幹細胞 （MSC） 自家移植 IL-6 他家移植 多分化能 組織傷害部位 への集積性 神経細胞 肝細胞 骨細胞 免疫抑制作用 軟骨細胞 脂肪細胞 再生医療への応用に期待 18 想定される用途 イヌiPS細胞の作製 目的の細胞へ分化 移植 再生獣医療への応用 毒性試験への応用 in vivoでの治療成績 実験動物使用の減少 難病の解明・治療 獣医学領域への応用 血液細胞へ分化 血液バンク ヒト再生医療への応用 19 実用化に向けた課題 iPS細胞株の樹立 ②最適な初期化因子 ③ウィルスを用いない方法 ①最適な体細胞 ⑥動物実験 iPS細胞の評価 ④高分化能の株を選抜 免疫拒絶抑制 （バンクの作製？） 効果的な分化方法の検討 ⑤確実に分化させる方法 安全性の確保 （腫瘍化の抑制） 分化細胞 20 企業への期待 共同研究を希望する企業等 ・医薬、獣医薬、バイオ関連企業 ・動物病院 ・医学・獣医学系大学及び附属研究所等 実用化に向けて ・産学共同促進ステージなどへの共同申請 実用化後 ・製品化 21 本技術に関する知的財産権 • • • • 発明の名称 ：イヌiPS細胞の製造方法 出願番号 ：特願2015-123775 出願人 ：大阪府立大学 発明者 ：稲葉俊夫、西村俊哉、 田中恵里菜、鳩谷晋吾、 杉浦喜久弥 22 産学連携の経歴 • 2006年-2007年 JST シーズ発掘試験事業に採択 • 2011年-2012年 JST A-STEP(FS探索)事業に採択 • 2014年-2015年 JST A-STEP(FS探索)事業に採択 23 お問い合わせ先 公立大学大阪府立大学 地域連携研究機構 産学官研究連携推進センター 知財マネジメントオフィス 統括コーディネーター 岡澤一秀 ＴＥＬ 072-254-9873 (内線)3510 ＦＡＸ 072-254-9849 e-mail [email protected] http://www.osakafu-u.ac.jp 24
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