SURE: Shizuoka University REpository
http://ir.lib.shizuoka.ac.jp/
Title
Author(s)
出芽酵母の増殖に伴う世代構成の変動とストレス応答に
よる細胞死に関する研究
萩原, 利行
Citation
Issue Date
URL
Version
2012-01
http://doi.org/10.14945/00007483
ETD
Rights
This document is downloaded at: 2016-01-06T20:58:47Z
静 岡大 学
博士論文
出 芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動 と
ス ト レス 応 答 に よ る細 胞 死 に 関 す る研 究
2012年
1月
大 学 院 自然 科 学 系 教 育 部
環 境 。エ ネ ル ギ ー シ ス テ ム 専 攻
萩原
利行
次
頁
序
章
緒論
1
研 究 目的
2
先行研 究
1
1) 出芽 酵 母 の 世 代 構 成 にお け る数 理 解 析 ___
2) 出芽 酵 母 に お け る細 胞 死 と寿命 __… ………………
０４
3
論 文構 成
出芽酵母 の世 代構 成解析 手法
第一章
14
1
数理解析 法
15
2
実験的手法
19
出 芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動
第 二章
21
要 旨
22
2
序論
24
3
材 料 お よび 方 法
26
4
実験結 果
5
数 理 解 析 結 果 ……
考察
８
２ ¨
1
３
¨ ０
一 ４
〓一
１ ２
第
章
¨ ４
6
出 芽 酵 母 の ス トレ ス 応 答 に よ る 増 殖 へ の 影 響 お よ び 細 胞 死 ……11
44
要旨
45
序論
第 一節
栄 養 源 飢 餓 に よ る影 型
47
1
は じめ に
47
2
材 料 お よび 方 法
50
3
結果
53
4
考察
58
第二節
活 性 酸 素 に よ る影 響
59
1
は じめ に
59
2
材 料 お よび 方 法
60
頁
3
4
三
第
１
節
２
３
４
結果
66
考察
77
密 度 効 果 /そ の 他 に よ る影 響
は じめ に
79
材 料 お よび 方 法
81
結果
83
考察
90
出 芽 抑 制 /細 胞 死 を誘 発 す る物 質 の 特 定
第 四節
終
79
93
1
は じめ に
2
材 料 お よび 方 法
3
結果
97
4
考察
101
章
総括
103
93
1
結論
104
2
今 後 の課 題
107
参考文献
109
_
121
添付 資料
122
謝
辞
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う娘 細 胞 の 大 き さ の 変 化
表 2 ∼5
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 化 _
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う細 胞 周 期 の 比 較
表 6
123
本 研 究 に 用 い た 出芽 酵 母 株 の リス ト
本 研 究 に用 い た 欠 損 株 の 遺 伝 子 の機 能
129
表 1
表 7
表 8
124
128
130
略 語 お よび用語 の 定義
本 論 文 に 用 い た 略 語 は 、 次 の 通 りで あ る 。
AGC:
AIDS:
Amt
AO:
Apo
ATG
ATP
A-kinase, cGMP-kinase, C-kinase
Acquired immune deficiency syndrome
Ammonium transporter
Acridine orange
Ap opto sis
CD
Cdk
Autophagy
Adenosine tri phosphate
B-cell Iymphoma/B-cell leukemia
CycIin - dependent
Cyclin'dependent kinase
ces
Caspase
Cit
Citruline
bcl
CLS
CPS
CySH
DAPI:
EB:
Chronological life span
Carb amylpho sphate synthase
Cysteine
4',6-diamidino-2-phenylindole
Ethidum bromide
egl:
endo- 1,4-beta-glucanase
ELS:
Ecological life span
ERCs
Extrachro mo somal ribosomal DNA circles
Fas:
Fasligand
fob :
F-line obesity QTL
Fum:
Fumaric acid
‐
γ Glu Cys : y - Gluta mylcy steine
GSH:
Reduced glytathione
GSSG
Glutathione -S - S -Glutathione
MAP:
Mitoge n - activat e d protein
MBF:
Mlul cell cyle box binding factor
Mep:
Methylammonium permease
MPKl
Mitogen-activated protein kinase 1
OD:
Optical Density
p53:
PI:
protein 53000
Propidium iodide
PLS:
rDNA :
RLS
ROS
SBF
SCH
Physiological life span
Ribosomal deoxyribonucleic acid
Replicative life span
Reactive oxygen specie s
Swi4/Swib ceII cycle box binding factor
Serine/threonine'protein kinase
Schwannomin
Silent information regulator
sch:
Sir:
SIRT 1 :
SOD
TG:
TNF
TOR
TUNEL :
WT :
YCA1
:
:
Ypkl :
YPA
Sirtuin
Superoxide dismutase
Tran s genic
Tumor necrosis factor
Target of rapamycin
Terminal deoxynucleotidyl transferase -mediated
deoxyuridine triphosphate -biotin nick end labelling
Wild type
Yeast caspase- 1
Yeast extract peptone adenine
Yeast cells reguires the protein kinase
lV
本 論 文 に用 い た 用 語 の 定 義 は 、 次 の 通 りで あ る。
母 細 胞 :一 般 に母 細 胞 とは 出芽 中 にお け る 出芽 させ る側 (母 核 )の 細
胞 を い うが 、 本 論 文 で は 出芽 痕 を保 有 した 細 胞 、 す な わ ち 出
芽 (出 産 )経 験 の あ る細 胞 全 て を母 細 胞 と定 義 す る。 ま た 、
出芽 痕 が 多 い 細 胞 を成 熟 細 胞 あ る い は老 齢 細 胞 とす る。
娘 細 胞 :一 般 に娘 細 胞 とは 出芽 中 にお け る母 細 胞 か ら 出芽 す る細 胞 部
分 を い うが 、本 論 文 で は 出芽 に よ つ て 発 生 した 細 胞 お よび 出
芽 (出 産 )経 験 の な い 細 胞 全 て を 娘 細 胞 と定 義 す る。
世 代 構 成 :出 芽 酵 母 の 母 細 胞 と娘 細 胞 の 比 率 お よび 出芽 痕 数 毎 の 分 布
状 態 を 世 代 構 成 と定 義 す る。 ス テ ー ジ 構 成 は世 代 構 成 と同 義
語 とす る。
保 存 則 :出 芽 痕 の 数 と 出芽 に よ つ て 生 まれ た 娘 細 胞 の 数 は 同 じで あ る
法 則 を い う。
保 存 則 比 :保 存 則 の 保 持 状 況 を 数 値 にて 表 した も の 。 総 出芽 痕 数 を 総
細 胞 数 に て 割 っ た 値 とな り、完 全 に 保 存 され て い る 場 合 は 1
とな る。
少 子 化 パ ラ ドック ス :増 殖 環 境 が 悪 化 し、集 団 全 体 の 増 殖 率 が 低 下 し
た 場 合 に 、 子 供 の 比 率 が 増 え る とい う逆 理 を い う。
セ パ レー シ ョン :母 細 胞 と娘 細 胞 と の 出芽 を開 始 す る ま で に 至 る時 間
の 相 異 や 、 娘 細 胞 の 出芽 は 抑 制 す る が 、 母 細 胞 の 出芽 は 抑 制
出
され な い こ とか ら発 生 す る 二 極 化 現 象 を い う。
芽 :娘 細 胞 を 出産 す る行 為 が 出芽 とな るが 、 本 論 文 で は 、 出芽 し
た こ とを 単 に 出産 と捉 え るば か りで は な く、 年 齢 を重 ね た こ
と と同 義 語 的 に 扱 う。 す な わ ち 、 3回 出芽 した 細 胞 よ り 5回
出芽 した 細 胞 の 方 が 高齢 と解 釈 す る。 そ れ に は 、 出芽 行 為 が
連 続 的 で あ り、 一 定 時 間 に て 定 期 的 に な され る こ とが 前 提 と
な るが 、本 論 文 で は そ の よ うに解 釈 す る 。
ス テ ー ジ :出 芽 酵 母 の 出産 回数 を寿 命 と定 義 す る。 出芽 経 験 1回 の 細
胞 が ス テ ー ジ 1と な る◇
生 理 的 寿 命 :physiO10gical life span(PLS)。
最 適 な条 件 下 で 実 現 す る
ポ テ ン シ ャ ル と して の 寿 命 。主 に遺 伝 子 の 背 景 で 規 定 され る。
生 態 的 寿 命 :ec010gical life span(ELS)。 そ の 生 物 が 生 活 して い る場
で 見 られ る現 実 的 な寿 命 。 環 境 の 様 々 な 要 因 に よ り規 定 され
る。
経 時 的 寿 命 :chrOnologicaHife span(CLS)。
分 裂 停 止 後 の 出芽 酵 母 細
胞 が 生 き延 び る時 間 か ら規 定 され る寿 命 。通 常 同 じ培 地 中 で 、
長 期 培 養 を 行 つ た 後 に 、細 胞 を再 び 増 殖 で き る寒 天 培 地 上 に
移 して 何 %の 細 胞 が コ ロ ニ ー を作 れ た か に よ つ て 測 定 され る
細 胞 集 団 の 平 均 値 と して 規 定 され る。
分 裂 寿 命 :replicative life span(RLS)。 出芽 酵 母 が 分 裂 に適 した 条 件
下 で 行 え る分 裂 可 能 な 回 数 と して 規 定 され る。 生 理 的 寿 命 の
一 種 で あ る。
遺 伝 子 、 タ ン パ ク 質 、遺 伝 子 欠 失 株 の 表 記 お よび 遺 伝 子 命 名 は 以 下 に 従 つ
た。
表記
遺 伝 子 :VH■5
タ ン パ ク 質 :Whi5
遺伝子欠失株
:%″ σ∠
遺伝 子命名
HISθ :遺 伝 子 座 ま た は 優 性 対 立 遺 伝 子
カカθ:要 求 性 を生 ず る遺 伝 子 座 ま た は劣 性 対 立 遺 伝 子
カカチ:ヒ ス チ ジ ン 非 要 求 性
力お
:ヒ ス
チ ジ ン要 求 性
Vl
序
章
緒論
1
研 究 目的
近 年 力 β〃力ο、す な わ ち シ リ コ ン 内 で (コ ン ピュー タ を用 い て )実 験 解
析 す る手 法 が 増 加 して き た 。 そ の 背 景 に は 、 ゲ ノ ム解 析 や 速 度 論 的解 析 に
お い て 、膨 大 な 情 報 量 を扱 う よ うに な り、 この 解 析 にお い て 、 コ ン ピュー
タ の 力 を借 りな けれ ば 処 理 で き な くな つ て き た こ とが 考 え られ る 。 ま た 、
カ オ ス 理 論 の 進 歩 に よ り、非 線 形 的 な対 象 を扱 うこ とが で き る よ うに な つ
た こ とや 、 コ ン ピ ュー タ の 能 力 が 向 上 し、複 雑 な シ ミ ュ レー シ ョン が 可 能
に な っ た こ と も要 因 と して 考 え られ る。 一 方 、 こ こ 30年 にお け る分 子 生
物 学 の 発 展 は 日覚 ま し く、1985年 に 提 唱 され た ヒ トゲ ノ ム 解 析 計 画 も、当
初 の 予 定 を は るか に上 回 る速 さで 解 析 が進 み 、 ス タ ー トか ら 15年 後 に終
了す る計 画 で あ つ た も の が 、13年 に短 縮 され 2003年 に は全 て の 解 読 が 完
了 した (International Human GenOme Sequencing COnsortium,2004)。
さ らに 、解 読 され た 情 報 を用 い た 研 究 が 飛 躍 的 に 増 加 し、 生 命 機 能 に 関す
る知 見 も爆 発 的 に 増 加 した 。 そ して 、 そ の 後 の 変 化 と して 、 単 に 実 体 の み
を解 析 す る こ とに 留 ま らず 、数 学 モ デ ル を定 式 化 し、 コ ン ピ ュー タ シ ミ ュ
レー シ ョン や 数 理 解 析 に よ り、 そ の 変 化 を予 測 し、複 雑 な 系 を理 解 しよ う
とす る試 み もな され て い る。 ま た 、 これ と並 行 し、 これ ま で は実 験 科 学 と
して 扱 われ て き た 生 物 学 にお い て も、数 理 生 物 学 、数 理 生 態 学 な ど、数 学
を用 い た 解 析 が 従 来 に も増 して盛 ん に な され る よ うに な っ て き た 。
これ ま で の 科 学 の 進 歩 は 、実 験 科 学 と理 論 科 学 とで な され て き た も の で
あ るが 、研 究 す る対 象 に よ り、 そ の 重 み付 け が 異 な っ て い た 。 物 理 学 や 天
文 学 に お い て は 、理 論 化 し易 い こ とや 実 験 す る こ とが 困難 で あ る こ とな ど
か ら理 論 科 学 が 重 要 視 され て きた 。 一 方 、化 学 や 生 物 学 に お い て は 、現 象
そ の も の が 複 雑 で 数 学 的 解 析 が 困難 な 分 野 と され て き た 。 しか しな が ら、
測 定機 材 の 進 歩 、解 析 手 段 と して の コ ン ピ ュー タ の 能 力 向 上 な ど工 学 的 な
進 歩 に よ り、 実 験 科 学 と理 論 科 学 と の 垣 根 が 年 々 低 くな つ て きた 。 い ず れ
は 、実 験 科 学 が 主 体 と され る分 野 にお い て も、対 象 とす る 現 象 にお い て は 、
理 論 が 先 行 し、 そ の 証 拠 を実 験 に て 確 認 す る時 代 が 来 る の で は な い か と予
測 され て い る 。 例 え ば 、 医薬 品 の 開発 にお い て は 、 lin θ〃力ο創 薬 、 す な わ
ち IT技 術 を 導 入 した 、 実 験 を伴 わ な い 創 薬 手 法 が 一 般 化 して お り、 膨 大
な 化 学 構 造 式 デ ー タ ベ ー ス を基 に 、 必 要 とす る薬 理 活 性 を持 つ 化 合 物 を選
ゴ
οο創 薬 技 術 は 、今 後 の 創 薬 現 場 にお
出す る場 合 に用 い られ て い る。 Lsゴ ′
い て必 須 に な る 技 術 で あ る と考 え られ 、 コ ン ピュー タ の 処 理 能 力 が 勝 敗 を
分 け る とま で 言 われ て い る。 ま た 、 基 礎 生 物 学 の 分 野 にお い て も、 生 命 現
象 を つ か さ どる 分 子 メ カ ニ ズ ム に 関す る知 見 が 膨 大 とな り、 これ らを 系 統
的 に理 解 す る上 にお い て コ ン ピ ュー タが 利 用 され る よ うに な つ て き た 。 具
体 的 に は 、細 胞 間 動 態 の 数 学 的 モ デ ル 化 、 生 物 学 的組 織 の 機 構 に 関 す る数
学 的 モ デ ル 化 、 ニ ュー ロ ンや 発 癌 の 数 学 的 モ デ ル 化 、酵 素 反 応 速 度 論 に 関
す る理 論 化 、 さ らに 、細 胞 内代 謝 を全 て シ ミ ュ レー シ ョンす る e‐ Cellプ ロ
ジ ェ ク ト (http:〃 www.ttck keio.ac.jp/1AB/cOmputer‐ science/)や 、 生 命
シ ス テ ム の ロバ ス トネ ス (頑 健 性 )を 探 る 出芽 酵 母 の 細 胞 周 期 の 数 理 モ デ
ル とそ の 解 析 、 な どが あ り、 どの よ うな ア プ ロー チ が 可 能 で あ る か を理 解
す る上 にお い て 良 き例 と考 え る。
この よ うな背 景 の 中 、本 研 究 は 、先 行 研 究 にお け る出芽 酵 母 の 増 殖 お よ
び 世 代 構 成 に 関す る数 理 解 析 結 果 を 、最 新 の 実 験 手 法 に よ る実 験 結 果 と照
ら し合 わせ る こ とで 、 理 論 研 究 と実 験 研 究 と の 接 点 の 模 索 、す な わ ち数 理
解 析 の 可 能 性 と応 用 に お け る 問題 点 の 抽 出 を 目的 に行 つ た も の で あ る。 さ
らに 、数 理 解 析 に て 得 られ た 興 味深 い 現 象 を 、 実 験 的 に確 認 し、 そ の メ カ
ニ ズ ム の 解 析 を試 み た 。 具 体 的 に は 、 これ ま で 報 告 され て き た 中 で 、 い ま
だ に 解 決 が な され て い な い 疑 間 、す な わ ち 、 な ぜ 出芽 酵 母 は 増 殖 を 続 けて
い る と娘 細 胞 の 比 率 が 増 え て しま うの か ?そ の 原 因 を、母 細 胞 と娘 細 胞 と
の 世 代 時 間 の 相 異 の み で 説 明 す る こ とが 可 能 か ?ま た 、 なぜ 出芽 酵 母 は 栄
養 リ ッチ な寒 天 培 地 中 で 増 殖 を 止 め て しま うの か ?そ こ に は密 度 効 果 等
に よ る 原 因 が あ る の か ?な どに 関 す る知 見 を得 る こ と を 目的 に 実 施 した 。
さ らに 、出芽 酵 母 が 保 有 す る、世 代 構 成 の 確 認 が 可 能 で あ る利 点 を生 か し、
細 胞 集 団 内 に お け る個 の 応 答 に着 日 した 研 究 を実 施 した 。 研 究 を進 め て い
く中 で 、 先 行 研 究 で は 報 告 され て い な い 早 期 にお け る細 胞 死 が 、 実 験 に よ
る保 存 則 の 確 認 過 程 と、 そ れ を数 理 解 析 す る こ とで 、 わ ず か な変 化
(1%
未 満 )と して 捕 え る こ とが で き た 。 さ らに死 滅 した 細 胞 を 染 め る こ とに よ
り確 か な も の と した 。 これ ら の 知 見 は 、新 規 性 が 高 い も の と判 断 し、 さ ら
な る検 討 と して 、 ス トレス 応 答 、 老 化 、寿 命 に 関連 す る遺 伝 子 を欠 失 して
い る変 異 株 も材 料 と して 用 い 、細 胞 死 が 発 生 す る原 因 の 究 明 も合 わせ て 行
つ た 。 加 えて 、 出 芽 を 抑 制 す る物 質 、細 胞 死 を誘 発 す る物 質 の 特 定 に つ い
て も試 み た 。
な お 、本 論 文 で の 研 究 対 象 とす る 出芽 酵 母 は真 核 生 物 で あ り、母 細 胞 か
ら娘 細 胞 を 出芽 す る こ とで 子 孫 を 増 や す 増 殖 形 態 を示 す 。 ま た 、 増 殖 は 、
分 裂 酵 母 や 細 菌 な ど と 同様 に ロ ジ ス テ ィ ッ クな 増 殖 パ タ ー ン を示 す 。 出芽
酵 母 は 、 この よ うな 非 対 称 な 増 殖 をす る 単 細 胞 生 物 で あ り、 か つ 出芽 した
際 に傷 と して 残 る 出芽 痕 を数 え る こ とで 、成 熟 度 あ る い は老 化 度 を推 測 す
rO実 験 に
る こ とが 可 能 (世 代 構 成 の 確 認 が 可 能 )と な り、 生 態 学 の カ ガι
適 して い る。 そ の た め 、 細 胞 分 化 や 細 胞 系 譜 の 研 究 モ デ ル と して 汎 用 され
て い る (Thorpe θι′′
.,2009)。 ま た 、 出芽 酵 母
.,2008、 Neumuller θ″′′
に も寿 命 が あ る こ とが約
50年 前 に 明 らか とな り (Mortimer 1959)、 老 化
の 研 究 モ デ ル と もな っ て い る (Bitterman θオ′■,2003、 Fabrizio θ ′
`′
2008、 Steinkraus θι′■,2008、 Barea θι′′,2009)。
,
研 究 に よ つ て 得 られ た 成 果 は 、 出芽 酵 母 を用 い た 実 験 結 果 の 解 釈 にお い
て 、 あ る い は数 理 解 析 をす る上 に お い て 有 用 な 情 報 に な る も の と考 え る。
さ らに 、 あ る特 定 の 物 質 に対 す る 出芽 酵 母 へ の 作 用 点 を予 沢1す る に あた り、
様 々 な作 用 点 に対 す る実 験 結 果 の パ タ ー ン化 とそ れ に至 る シ ミ ュ レー シ
ョン を数 学 的 に予 め 設 定 して お く こ とで 、未 知 な る物 質 の 作 用 点 予 測 を容
易 に す る こ とが 可 能 に な る も の と考 え る。
4
2
先行研 究
1)出 芽 酵 母 の 世 代 構 成 にお け る数 理 解 析
酵 母 は 、人 類 に と つ て 係 わ りの 深 い 微 生 物 で あ る。パ ン 、酒 な どの 食 料 ・
嗜 好 品 と して の 利 用 も さ る こ とな が ら、 酵 母 が 保 有 す る特 殊 性 に よ り、研
究 にお け る 「モ デ ル 生 物 」 と して の 価 値 も高 い 。 後 に 、 ノ ー ベ ル 医 学 ・ 生
理学賞
(2001年 )の 受 賞 に つ が な る 、 Hartwellに よ る細 胞 周 期 の 主 要 な
制 御 因 子 の 発 見 や 、細 胞 周 期 の チ ェ ック ポ イ ン トとそ の 制 御 に 関 わ る遺 伝
子 群 の 発 見 、 さ らに 2000年 以 降 、 飛 躍 的 に研 究 が進 ん で い る寿 命 遺 伝 子
に 関す る研 究 も、酵 母 を用 い た 実 験 が 引 き金 とな って い る。 酵 母 に は 、 分
裂 酵 母 と出 芽 酵 母 とが あ る が 、 この 内 出芽 酵 母 は 、 前 述 した よ うに母 細 胞
か ら娘 細 胞 を 出芽 す る こ とで 子 孫 を 増 や す 非 対 称 な 増 殖 形 態 を示 す 。 娘 細
胞 が 母 細 胞 か ら分 離 す る と、母 細 胞 に は 出芽 痕 が 残 る。 そ の た め 、 出芽 痕
を数 え る こ とで 出芽 回数 が 特 定 で き る。 出芽 回数 が 多 い 細 胞 は成 熟 した 細
胞 あ る い は老 化 した 細 胞 で あ る と推 測 す る こ とは 十 分 可 能 で あ るた め 、 増
殖 と老 化 を解 析 す る の に適 して い る。
ま た 、 出芽 酵 母 は 世 代 時 間 が 短 く、 一 倍 体 世 代 ・ 三 倍 体 世 代 が 安 定 して
存 在 し、 自由 に行 き来 で き る こ とや 、突 然 変 具 体 を容 易 に 得 る こ とが 可 能
で あ る こ とな ど、 多 く の 利 点 を持 つ て い る。 さ らに 、 出芽 の 状 態 に よ り
Gl期 、S期 、G2期 か ら M期
に 分 別 す る こ とが 可 能 で あ る こ とや 、温 度 感
受 性 変 異 株 な どを 用 い る こ とで 、増 殖 を コ ン トロー ル す る こ とが 可 能 で あ
。
る こ と (Cho θι′′
,1998)な どか ら、細 胞 周 期 に 関 す る研 究 に も積 極 的 に
用 い られ て い る。
この よ うに 優 れ た 特 徴 を 有 す る 出芽 酵 母 を用 い た 、世 代 構 成 に 着 日 した
増 殖 に 関す る研 究 は 、 主 に 、 Hartwellら 、 」ohnstonら 、浜 田 ら、 泰 中 ら
に よつ て な され て きた 。 そ の 方 法 は 、数 理 生 態 学 的解 析 を基 礎 に して 、 こ
れ と実 験 結 果 とを比 較 し、 理 論 的 に 現 象 を論 述 す る こ とで 行 わ れ て き た 。
増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動 を予 測 す る上 で 重 要 な ポ イ ン トは 、 母 細 胞 と
娘 細 胞 の 世 代 時 間 を どの よ うに 設 定 す る か に あ る。 世 代 時 間 を設 定 す る方
法 と して は 、顕 微 鏡 下 で 出芽 か ら出芽 ま で の 時 間 を測 定 す る方 法 や 娘 細 胞
の 出現 比 率 を基 に理 論 的 に決 定 す る方 法 な どが あ る。Hartwellら は 、理 論
解 析 に お け る 初 期 設 定 にお い て 、細 胞 周 期 に は 出芽 の 周 期 と DNA合 成 の
周 期 が あ り、 そ れ らの 開始 を コ ン トロー ル す る部 分 が あ る こ とを 報 告 した
.,1974)。 ま た 、非 対 称 な 増 殖 をす る 出芽 酵 母 に あ つ て は 、
(Hartwell θ ′
`′
母 細 胞 と娘 細 胞 と の 世 代 時 間 は異 な り、結 果 と して ス テ ー ジ が 2ラ イ ン と
な る Two‐ stageモ デ ル を提 唱 した (Hartwell θι″ .,1977)(図 2)。 この
こ とに よ り、 そ れ ま で のモ デ ル (One‐ stageモ デ ル :細 菌 と 同様 な 増 殖 モ
デ ル )(図
1)を 飛 躍 的 に 向 上 させ た 。 さ らに 、そ の 後 の 研 究 にお い て 泰 中
らは 、 〔娘 ―母 〕 モ デ ル と 〔
未 成 熟 ―成 熟 〕 モ デ ル か らな る Two― stageモ
デル に、 〔
未 成 熟 小 型 細 胞 ―成 熟 大 型 細 胞 〕 モ デ ル を加 え た Three― stage
モ デ ル (図 3)を 報 告 (Tainaka θι′■,2006)し 、 よ り現 実 に近 い も の と
した 。
一 方 、浜 田 らは 、増 殖 中 の 細 胞 集 団 にお い て 、 出産 回数
nに お け る細 胞
頻 度 (■ )が 一 定 に 達 した とき 、 母 細 胞 と娘 細 胞 の 出芽 率 の 比 が母 細 胞 の
分 裂 回数 に よ らず 一 定 (4=均 =… Fn=g駒 、 Fn:単 位 時 間 あ た り娘 細 胞 を生
む確 率 )で あれ ば 、 4は 全 て
,(“
と rθ の比 率)の み に よつ て 表 現 で き る
Hamada θι′工,1985)。 これ は 、 対 数
こ とを 報 告 した (Hamada,1982、
増 殖 期 の 細 胞 集 団 にお い て 各 ス テ ー ジ の 細 胞 頻 度 (■ )と 全 体 の 増 殖 率 (Fl
を確 認 す る こ とで 母 細 胞 と娘 細 胞 の 出産 率 と世 代 時 間 を求 め る こ とが 可
能 で あ る こ とを 示 して い る。
nの 出 産 率
ふ :ス テ ー ジ nの 細 胞 数
■ :ス テ ー ジ nの 頻 度
0の 出 産 率
為 :ス テ ー ジ 0の 細 胞 数
る :ス テ ー ジ 0の 頻 度
rn:ス
莉 :ス テ ー ジ
テー ジ
9′ ′″ と rθ の ″ 事
対 数 増 殖 期 が 長 く続 く と、ん が 一 定 に な る (定 常 ス テ ー ジ 構 造 )。
全 体 の 増 殖 率 お よび 細 胞 数 を rと xと す る とき 、 Xク と 為 の 時 間
変 化 は 以 下 の よ うに な る。
為
■
∞
［
﹃
“
ヽ
／
〓
鍋丁
αXn
dt
―rnXn+rn-1為 _.
この 理 論 に基 づ き、 西 村 らは 、 対 数 増 殖 期 と対 数 増 殖 後 期 で の 、 母 細 胞
と娘 細 胞 の 世 代 時 間 の 変 化 と増 殖 率 の 低 下 との 関係 に つ い て 調 べ た とこ
ろ 、対 数 増 殖 期 か ら対 数 増 殖 後 期 へ の 移 行 に 伴 い 全 体 の 増 殖 率 が 低 下す る
と、 主 と して 娘 細 胞 の 世 代 時 間 が 延 び 、娘 細 胞 の 大 き さ も小 さ くな る こ と
を明 らか に した (Nishimura,1983)。 この こ とは 、そ れ 以 前 に 報 告 され て
い た 、娘 細 胞 が 出芽 可 能 に至 る ま で に は 、 あ る 一 定 の 大 き さに な る ま で の
時間が必 要 で あ る こ と
(」
ohnstOn θ ■,1977)や 、増 殖 率 と細 胞 の 大 き
`′
さに は 関連 が あ り、増 殖 率 が 高 い 場 合 は 母 細 胞 と娘 細 胞 の 大 き さに大 き な
開 き は な い も の の 、 増 殖 率 が 低 い 場 合 は娘 細 胞 が 小 型 化 す る報 告
(Hartwell θι′工,1977、 Carter θ′′■,1978、 Wheals θι′ヱ,1980) とも
一 致 す る。
以 上 の よ うに 、数 学 的 な 理 論 と して 、 One― stageモ デ ル か ら Two― stage
モ デ ル ヘ 、 TwO‐ stageモ デ ル か ら Three― stageモ デ ル ヘ と変 遷 し、 そ の 都
度 精 度 の 向 上 が 成 され 、解 析 に お い て も十 分 な る 検 討 が加 え られ て き た 。
しか しな が ら、 そ の 検 討 を 裏 付 け る実 験 にお い て は 、 当 時 に お け る研 究機
材 の 限 界 等 に よ り、標 本 の 作 製 か ら観 察 ま で 、 実 験 者 の テ ク ニ ック に 依 存
す る と こ ろ が 強 く、再 現 性 等 にお い て 改 良 の 余 地 が あ る と判 断 せ ざ る を得
な い も の で あ っ た 。 例 え ば 、 出芽 痕 の 算 定 にお い て は 、細 胞 を 一 旦 ホル マ
リ ン 固 定 し、 これ を ス ライ ドグ ラ ス 上 に 載 せ て 観 察 す る も の で あ るが 、 出
芽 痕 に お い て は 、 出芽 痕 6個 以 上 を 正 確 に 算 定 す る こ とが 難 し く、必 要 に
応 じて 細 胞 を微 妙 に動 か しな が ら算 定 して い た の が 現 状 で あ る。 この こ と
は 、保 存 則 の 確 認 にお い て 多 大 な影 響 を示 す も の で あ り、詳 細 な 検 討 を加
え る に は不 向 き で あ る とい わ ざ る を得 な い も の で あ っ た 。 本 研 究 で は 、先
行 研 究 に て 用 い られ て きた 実 験 手 法 の 見 直 しを行 い 、 これ ま で の 方 法 と比
較 して 、原 理 的 に 読 み 取 り誤 差 が な く、 デ ー タ の 保 存 性 も 向 上 す る方 法 を
確 立 した 。 さ らに 、 この 方 法 に よ り詳 細 な 検 討 を加 え た 結 果 、 前 述 した よ
うな 「予 期 しな い 細 胞 の 早 期 消滅 」 の 発 見 に つ な が っ た 。
,プ
○
二
〇″
世代時間
図
:娘 細 胞
〃 :母 細 胞
ユ
g:2の
成長率
1 0ne‐ stageモ デ ル
細 菌 な ど と 同様 な 直 線 的 な 増 殖 モ デ ル 。 世 代 時 間 は 成 長 時 間 と ほ
ぼ 同等 とな る。 シ ン プル な ロ ジ ス テ ィ ッ ク 方 程 式 に て 解 析 可 能 。
娘細胞 の世代 時 間
二 ●4げ ―→
θ盟
↑
:未 成 熟 な 娘 細 胞
∂ゴ
0
∂ :成 熟 した 娘 細 胞
“
g:'ゴ の 成 長 率
:∂
r“ ′
￨
の 出産 率
“
母細胞 の世代 時 間
区12
Two‐ stageさモデ ル
One― stageモ デ ル の 母 細 胞 と 娘 細 胞 の 区 別 に 加 え 、成 熟 細 胞 と 未
成 熟 細 胞 の 区 別 を加 え た モ デ ル 。
娘細胞 の世代 時間
6-聟 ● 彙 げ _.6
「
2 0卜
:未 成 熟 な 娘 細 胞
θ″:成 熟 した 娘 細 胞
〃 :母 細 胞
ユ
g:,メ の 成 長 率
の 出産 率
r″ が
↑
物
'“
:〃 の 出 産 率
母 細胞 の 世代 時 間
図
3 Three‐ stageモ デ ル
母 細 胞 と娘 細 胞 の 区別 、成 熟 細 胞 と未 成 熟 細 胞 の 区別 に 、成 熟
大 型 細 胞 と未 成 熟 小 型 細 胞 の 区別 を加 え た モ デ ル 。
2)出 芽 酵 母 にお け る細 胞 死 と寿 命
細 胞 死 は 、非 ア ポ トー シ ス 細 胞 死 とア ポ トー シ ス 細 胞 死 に 大 別 す る こ と
が で き る。 さ らに 、非 ア ポ トー シ ス 細 胞 死 は 、ATPを 使 つ て 積 極 的 に実行
され る細 胞 死 (オ ー トフ ァ ジ ー を伴 う細 胞 死 と転 写 抑 制 あ る い は リ ソ ソー
ム を介 した ネ ク ロー シ ス 様 細 胞 死 )(Shimizu θ′′′
.,2004、 Yu θι′ヱ,2004)
と ATPの 涸 渇 に よ る受 動 的 な細 胞 死 (ネ ク ロー シ ス )に 分 け られ る。オ ー
食 )を 伴 う細 胞 死 は 、病 原 体 に感 染 した 細 胞 の生 体 防御 反
応 等 に よ り惹 起 され る。 ネ ク ロー シ ス は 、個 々 の 細 胞 にお け る障 害 性 あ る
トフ ァ ジ ー
(自
い は病 的 な細 胞 死 で あ る。 そ の 特 徴 と して 、細 胞 内小 器 官 の 膨 潤 や 細 胞 自
体 の 破 壊 等 が 発 生 す る。 ネ ク ロー シ ス は長 期 間 に わ た り漸 次 進 行 して い く。
ネ ク ロー シ ス の 発 生 原 因 は 、補 体 に よ る細 胞 破 壊 や 、薬 物 、 紫 外 線 な どが
報 告 され て お り、 細 胞 外 環 境 に よ る影 響 が 大 とな る。
一 方 、 ア ポ トー シ ス は 、 1972年 に病 理 学 者 で あ る Kerrと Wメ lieら が
ネ ク ロー シ ス とは 異 な る形 態 を した 細 胞 死 が あ る こ とを 発 見 し、 これ を ア
ポ トー シ ス 〔
枯 葉 が 落 ち る様 子 、 apo(離 れ る)と ptosis(落 ち る )と の
造 語 〕 と命 名 した こ とか ら始 ま る (Kerr θι′ム,1972)。 い わ ゆ る形 態 学 的
な 定 義 と して の 分 類 用 語 で あ る。 そ の 後 、 ア ポ トー シ ス は 、 管 理 ・ 調 節 さ
れ た 細 胞 の 自殺 、 す な わ ち能 動 的 に プ ロ グ ラ ム され た 細 胞 死 全 般 (狭 義 に
は caspaseに 依 存 す る も の )を 指 す よ うに な り、 現 在 に至 っ て い る 。
TNFリ ガ ン ドや サ イ トカ イ
ア ポ トー シ ス は 、腫 瘍 壊 死 因子 TNF受 容 体 ‐
ン Fas(Apo‐ 1/CD95)‐ Fasリ ガ ン ドな どの 誘 導 因子 の 発 見 (Trauth θι2ス
1989、 Yonehara θ ヱ,1989、 Itoh θ ′
.,1991)、 ノσθや ら″フ な ど の ア
`′
,
`′
ポ トー シ ス 関連 遺 伝 子 の 発 見 (Debbas θ′′■,1993、 Hengartner θ′′′
1994)、 Caspaseの 発 見 (Miura θル ス,1995)、 ア ポ トー シ ス の 決 定 (ces‐ 1,
,
ces‐ 2,egl‐ 1)、
実行
(ced‐ 3,ced‐ 4)、
抑制
(ced‐ 9)、
死 細 胞 の取 込 み
(ced‐ 1,
ced‐ 2)な
どの 発 見 に よ り、そ の 意 義 が深 く認 識 され る よ うに な つ た 。ま た 、
ア ポ トー シ ス は 、DNAの 断 片 化 、核 の 凝 縮 、核 の 断 片 化 、ア ポ トー シ ス 小
体 の 形 成 、細 胞 膜 ホ ス フ ァチ ジル セ リ ンの 露 出 、 シ トク ロ ム Cの ミ トコ ン
ドリア か ら細 胞 質 へ の 露 出 、 細 胞 の 凝 縮 と断 片 化 な どが 特 徴 とな り、短 時
間 に進 行 す る。 神 経 ネ ッ トワ ー ク の 形 成 や 、 昆 虫 /両 生 類 の 変 体 、 自 己 反
応 性 T細 胞 の 除 去 な ど も ア ポ トー シ ス で あ る。 さ らに 、癌 細 胞 の 不 死 化
(Wy71lie,1992、
Lotem θι′′.,1998、 Sachs θ ′.,1993)RP AIDS(Meyaard
`θ
θι′■,1992)と の か か わ りも報 告 され て い る。
ア ポ トー シ ス は 、細 胞 集 団 内 にお け る集 団 の 利 益 の た め に 計 画 的 に発 生
す る 個 の 細 胞 死 で あ る。 そ の た め 、 ア ポ トー シ ス は 多 細 胞 生 物 の み に認 め
られ る 現 象 で あ る と長 く認 識 され て き た 。 しか しな が ら、 単 細 胞 生 物 の 出
芽 酵 母 にお い て も、長 期 培 養 中 の 栄 養 源 飢 餓 、DNA障 害 、活 性 酸 素 な どに
よ リア ポ トー シ ス 様 の 細 胞 死 が 誘 導 され る こ とが 判 明 して きた
′■,1997、
(MadeO θ
Yamaki θ ′,2001、 」in C θ 工,2002、 Eva Herker θ
`′
`′
`2■
`
,2004、
Gabriela θι′ス,2006、 Paola Fabrizio θ′′■,2008、 Patrick Rockenfeller
θ ■,2008)。 単 細 胞 生 物 の ア ポ トー シ ス の 生 理 学 的意 義 と して は 、 ク ロ
`′
ー ン 中 か ら DNA等 が 傷 付 い て 変 異 を起 こす 可 能 性 の あ る細 胞 を積 極 的 に
除 去 す る こ とや 、 栄 養 源 飢 餓 時 に 、 一 部 の 細 胞 が 死 ぬ こ とで 細 胞 の 内容 物
を培 地 中 に放 出 し、残 りの ク ロー ン の 細 胞 に 栄 養 を与 え る こ と等 が 考 え ら
れ て い る。
次 に 、生 物 の 寿 命 とい う場 合 に は 、大 き く分 けて 2つ の 定 義 が 存 在 す る。
一 つ は 、条 件 を整 えた 場 合 に 実 現 す るポ テ ンシ ャ ル と して の 寿命 で あ り生
理 的 寿 命 と呼 ばれ る。 も う一 つ は 、 生 物 が 実 際 に 生 活 して い る場 で 見 られ
る寿 命 で あ り生 態 的 寿 命 と呼 ばれ る。 この 場 合 に は 、 そ の 生 物 が 生 存 して
い る環 境 が 大 き な 影 響 を及 ぼ す 。 生 物 界 全 体 を見 た 場 合 、原 核 生 物 に は 生
理 的 寿 命 に 相 当す る も の が な く、 生 理 的 寿 命 が 存 在 す る の は真 核 生 物 に 限
つ た も の で あ り少 数 派 で あ る。 生 物 の 進 化 史 で 見 た 場 合 で も、約 半数 に あ
た る期 間 は 、真 核 生 物 は 存 在 して お らず 、 生 物 に生 理 的 寿 命 は 存 在 して い
な か つ た 。 む しろ 、 生 理 的 寿 命 は進 化 の 過 程 で 獲 得 した 特 質 と も い え る。
ま た 、 ヒ トな どは 生 態 的 寿命 と生 理 的 寿 命 とが 近 い 生 物 で あ るが 、 多 く の
生 物 に と つ て 、 生 態 的 寿 命 は 生 理 的 寿 命 よ りか な り短 い 。
寿 命 の 研 究 に お け る 出芽 酵 母 の 貢 献 は 高 く、 SIR2フ ァ ミ リー (サ ー チ
ュ イ ン )の NAD依 然 性 脱 ア セ チ ル 化 酵 素 活 性 の 発 見 は 、 出芽 酵 母 を用 い
た 実 験 に よ る も の で あ る (Klar θ′′ム,1979)。 SIR2タ ン パ ク 質 は 、 NAD
依 存 性 に ヒス トン H4の 16番 の リジ ン に 特 異 的 に 脱 ア セ チ ル 化 す る 。これ
は 、転 写 が 不 活 性 化 (遺 伝 子 サ イ レン シ ン グ )す る際 の ク ロマ チ ンの 構 造
を確 立 す る上 で重 要 な 役 割 を担 っ て い る (Imai θ ■,2000)。 さ らにサ ー
`′
チ ュ イ ン は 、 カ ロ リー 制 限 に よ る老 化 の 抑 制 効 果 、寿 命 の 延 長 効 果 に 関 与
して い る (Imai,2007、 Haigis θ″′ヱ,2010、 Imai θ ′,2010)。 ま た 、
`′
動 物 に お い て も、 サ ー チ ュ イ ンが 同様 な 働 き を もつ こ とが 報 告 され て い る
(Guarente θι2■ ,2000)。
一 方 、細 胞 の 経 時 的 寿命 に大 き くか か わ る機 構 と して は 、TOR(target of
グナ ル 伝 達 径 路 が よ く知 られ て い る。TORは 栄 養 源 の 有 無
を感 知 して 、細 胞 の イ ベ ン トを 制 御 す るプ ロテ イ ン キナ ー ゼ で あ る (Evans
θ 工,2010)。 TORの 活 性 が 低 い と経 時 的 寿 命 が 伸 び る (Kaeberlein θ ′
rapamycin)シ
,
`′
`′
10
摂 取 す るカ ロ リー を 7割 程 度 に 抑 制 す る と、 生 物 の 老 化 が 遅 れ 寿
命 が 延 び る とい う現 象 が 酵 母 か らア カ ゲ ザ ル ま で 広 く観 察 され る
(Fontana θ′′′,2010)。 TORは 栄 養 源 飢 餓 で 不 活 性 化 され 、 カ ロ リー 制
2005)。
限 に よ る老 化 抑 制 、寿 命 延 長 に深 く関 わ つ て い る。逆 に言 え ば 、TORは 栄
養 源 飢 餓 に よ るア ポ トー シ ス を促 進 す る と言 え る。
本 研 究 で は 、 これ ま で の 先 行 研 究 を参 考 に して 、「予 期 しな い 細 胞 の 早
期 消 滅 」 の 原 因 を探 る と と も に 、世 代 構 成 へ の 影 響 を細 胞 死 と寿 命 の 観 点
か ら確 認 す る こ とを 目的 と して 検 討 を加 え た 。
3
論文構成
本 論 文 は 、序 章 と、本 体 部 分 に 相 当す る 3章 お よび 終 章 か ら成 る。 各 章
で 記 述 した 内容 は 以 下 の とお りで あ る。
序 章 は 、研 究 目的 と 出芽 酵 母 の 世 代 構 成 にお け る数 理 解 析 お よび 細 胞 死
と寿 命 に 関 す る先 行 研 究 に つ い て 記 述 した 。
第 一 章 は 、 世 代 構 成 を解 析 す るた め の 手 法 に つ い て 記 述 した 。 数 理 解 析
手 法 で は 先 行 研 究 にお け る解 析 法 を 紹 介 した 上 で 、今 回用 い た泰 中 らが 報
告 した 格 子 気 体 モ デ ル に Three‐ stageモ デ ル を拡 張 した 方 法 に つ い て 記 述
した 。 ま た 、 実 験 的 手 法 と して は 、 出芽 痕 の 読 み 取 り精 度 を 向 上 させ るた
め に 導 入 した 、細 胞 を 断層 的 に 解 析 す る方 法 を 従 来 法 との 比 較 で 紹 介 した 。
第 二 章 は 、液 体 培 養 した 場 合 に お け る 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動 を確 認
した 結 果 に つ い て 記 述 した 。野 生 株 と して S288C、 S288Cの 栄 養 要 求 性 株
と して BY4741、
写 阻 害株 で あ る
BY4741に 対 す る遺 伝 子 ノ ッ ク ア ウ ト株 と して G1/S期 転
″力″ ∠、GO期 進 入 抑 制 株 で あ る βο
力θ∠ を用 い 、増 殖 開始
か ら定 常期 ま で の 濁 度 ・ 細 胞 数 の 変 化 と、対 数 増 殖 期 か ら定 常期 ま で の 世
代 構 成 の 変 化 を 確 認 した 結 果 を 、ま た S288Cを 用 い た 細 胞 の 大 き さ と増 殖
過 程 (細 胞 周 期 )を 確 認 した 結 果 を記 述 した 。 さ らに 、 実 験 に て 得 られ た
デ ー タ と数 理 解 析 との 比 較 を行 つ た 結 果 に つ い て も記 述 した 。
第 二 章 は 、 四 節 構 成 と し、第 二 章 に て 得 られ た 結 果 の 原 因 を探 る 目的 で
実 施 した 実 験 結 果 を記 述 した 。 い ず れ の 影 響 も ス トレス と捉 え 、 第 一 節 に
栄 養 源 飢 餓 に よ る影 響 を 、第 二 節 に活 性 酸 素 に よ る影 響 を 、 第 二 節 に密 度
効 果 お よび そ の 他 の 影 響 を 、第 四節 に これ らの 影 響 をお よば す 物 質 の 特 定
に 関 す る 試 み に つ い て 記 述 し た 。 細 胞 死 の 確 認 は 、 Annexin‐ Vに
Propidium iOdideと Calcofluor Whiteを 加 え た 二 重 染 色 に よ るア ポ トー
シ ス とネ ク ロー シ ス の 発 生 頻 度 に よ り行 つ た 。
第 一 節 の 栄 養 源 飢 餓 にお い て は 、 栄 養 源 と して 炭 素 源 に 着 日 し、 グル コ
ー ス の 影 響 に つ い て 記 述 した 。
第 二 節 の 活 性 酸 素 にお い て は 、 SOD遺 伝 子 を欠 損 した βο″ ∠ (細 胞 質
局 在 型 )と ,α ´ ∠ (ミ トコ ン ドリア型 )を 用 い た 、野 生 株 と の 比 較 の 結 果 、
増 殖 曲線 に て 差 が 発 生 し始 め る タ イ ミ ン グ と娘 細 胞 の 比 率 が 変 化 し始 め
る タイ ミ ン グ とが 一 致 した こ とに ヒ ン トを 得 て 実 施 した 結 果 を記 述 した 。
第 二 節 の 密 度 効 果 お よび そ の 他 の 影 響 にお い て は 、密 度 効 果 を キ ー ワー
ドと した 影 響 評 価 に つ い て 記 述 した 。 ま た 、寒 天 培 地 を用 い て 実 施 した 揮
発 ガ ス に よ る影 響 に つ い て も記 述 した 。 さ らに 、 そ の 他 の 影 響 と して 、 老
化 ・ 寿 命 に 関 連 す る遺 伝 子 を欠 損 した 、 ん″ ∠ (rDNA領 域 の 組 み 換 え が
つ４
r2∠ (長 寿 遺 伝 子 SIR2が 欠 損 した 株 )、 ″ ′fZ(ア ポ
抑 え られ た株 )、 βゴ
トー シ ス に 関連 す る遺 伝 子 が 欠 損 した 株 )を 用 い た 検 討 結 果 と、 実 験 とそ
の 数 理 解 析 に お い て 得 られ た 細 胞 消 滅 の 原 因 を 探 る た め に 用 い た 、 わ″グθ
∠ (セ プ チ ン カ ラ ー に 異 常 を持 つ 株 )、 ″ρ■2Z(細 胞 壁 の 安 定 性 に 関 与 す
る MPKl遺 伝 子 を欠 損 した 株 )で の 検 討 結 果 を記 述 した 。
第 四 節 の 出芽 抑 制 お よび 細 胞 死 を誘 発 す る物 質 の 特 定 にお い て は 、培 養
1日 日お よび 6日 目の 細 胞 懸 濁 液 を用 い 、 そ の 上 澄 み お よび 酵 母 細 胞 を抽
出 /分 画 した 画 分 か ら、 出芽 抑 制 を促 す 物 質 お よび 細 胞 死 を 誘 発 す る物 質
の 特 定 を試 み た 結 果 に つ い て 記 述 した 。
終 章 は結 論 で あ り本 研 究 の 内容 と成 果 を ま とめ た 。 さ らに 、 今 後 の 課 題
に つ い て 論 述 した 。
13
第 一章
出芽酵母 の世 代構 成解 析 手法
14
1
数理解析 法
実 世 界 の 現 象 を理 解 し予 測 す るた め に用 い る数 理 モ デ ル は 、そ の 目的 に
よ り求 め られ る内容 が 異 な っ て くる。 複 雑 な現 象 を ユ ニ ッ ト化 し、 それ ぞ
れ の 影 響 を 評 価 す る場 合 で は 、 単 純 化 す る こ とが重 要 とな り、 そ の こ とに
よ り実 世 界 で は 見 え な い も の が 見 えて く る場 合 が あ る。 ま た 、複 雑 な系 を
モ デ ル 化 す る場 合 に は 、 実 世 界 に て 得 られ る情 報 の 質 が 問 われ 、変 動 要 因
の 緻 密 な分 析 が 求 め られ る。 出芽 酵 母 の 世 代 構 成 に 着 目 した 増 殖 に 関す る
研 究 は 、 実 世 界 の 現 象 を モ デ ル 化 す る こ とを 目的 と した も の で あ る。
生 物 の 個 体 数 の 動 態 は 、個 体 群 の ダイ ナ ミ ッ ク ス と して 常微 分 方 程 式 に
て 得 られ る。 い わ ゆ る ロ ジ ス テ ィ ク方 程 式 で あ る。 最 も シ ン プ ル な 系 は 、
倍 々 で 増 加 す るネ ズ ミ算 で あ り、細 菌 の 増 殖 は これ に 相 当す る。 個 体 数 を
χ と表 し、 個 体 数 を時 間 ιの 関数 と考 え る と、 増 加 速 度 が 集 団 サ イ ズ に比
例 す る こ と とな る。
α一
置
比 例 定 数 ″ は 1個 体 当た りの 増 加 率
=η χ
これ を満 た す 解 は 、 Xの =XO)e"`で あ り、 Xの が 1よ りず つ と小 さい 環 境
が 続 く と個 体 数 が 指 数 関数 (対 数 増 殖 )を 描 い て 増 加 す る こ とを表 して い
る。 しか しな が ら、 この 式 で は無 限 に 増 殖 す る こ と とな る が 、 実 世 界 で は
栄 養 源 の 涸 渇 な ど 、 生 息 環 境 の 悪 化 に よ り増 殖 は鈍 化 し定 常 期 に 移 行 す る。
この 現 象 を数 式 化 した も の が ロ ジ ス テ ィ ク方 程 式 で あ る。
霧
=″ く 1-#)
この 式 で 得 られ る図 形 は
S字 曲線 とな る。
一 方 、 出芽 酵 母 の 場 合 は細 菌 とは 異 な り、母 細 胞 か ら娘 細 胞 が 出芽 す る
こ とで 増 加 して い く非 対 称 な増 殖 形 態 を示 す 。 この こ とか ら、 ロ ジ ス テ ィ
ック方 程 式 に 、 非 対 称 な増 殖 要 因 を付 加 させ る必 要 が あ る。 母 ―娘 モ デ ル
で の 、母 細 胞 を ルヘ 娘 細 胞 を
下 の よ うに な る。
>′
'に
'
ル年 0→ ル件 ′
全個 体数
,と
した 時 の 出芽 酵 母 の 増 殖 プ ロセ ス は 、以
(増 殖 率
:均 )
(増 殖 率
:助
X=摯 ,と
)
な る。
この とき の 指 数 増 殖 は以 下 の 式 で 表 され る。
dX/d`=′χ
(全 体 の 増 殖 率 :r)
娘 細 胞 の 比 率 力 は ケ ク (″ 午〕 と表 され る 。
F√
(1-力 )r■■a
助 =Fdr/(1-力 )
15
と
rご
r“
の 関 係 は 、 娘 細 胞 が 母 細 胞 に な る ま で の 時 間 に 起 因 し、 常 に
ん と な る 。母 細 胞 と 娘 細 胞 の 増 殖 に 伴 う個 体 数 密 度 変 化 は 図
4の
rグ ≦
よ うに な
り、 娘 細 胞 の 密 度 が 母 細 胞 を 上 回 る 結 果 と な る 。 ま た 、 増 殖 す る 様 子 を 気
体 分 子 モ デ ル (格 子 モ デ ル )に て 解 析 し 、 空 間 パ タ ー ン を 各 細 胞 に よ る 色
分 け に て 表 す と、 図
5の
よ うに な る 。
粍種言
撃
華肇
理嚢
華
理弄髪
輩
瑳基顎理聾垂
個体数密度
my難1轟攀曇
灘κ詈
埒
藝貪量
星
攀重
図
4母 細 胞
と娘 細 胞 の 時 間 変 化 を 示 す 。
図
に す る と、 図
(rグ
6の
格 子 モ デル 空 間パ ター ン
■ D:娘 細 胞
娘 細 胞 の 密 度 が 母 細 胞 を 上 回 る。
さ らに 、 増 殖 率
5
)の 変 化 に お け る ス テ ー ジ 構 造
■ M:母 細 胞
(力 )の 推 移 を グ ラ フ
よ うに 、 娘 細 胞 の 増 殖 率 が 上 が る と娘 細 胞 の 比 率 が 減 少
(r)が 上 が る と 、母 細 胞 の 増 殖 率 が ほ ぼ 一 定 で
す る 。 ま た 、全 体 の 増 殖 率
あ る こ と に 対 し 、娘 細 胞 で は 増 殖 率 が 増 加 す る (図
7)。
す な わ ち 、全 体 の
増 殖 率 は 娘 細 胞 の 増 殖 率 に だ け 影 響 を 及 ぼ して い る 。
1
0.9
ス
0.45+― 一一一一一一一―一
08
1 07
母
035
06
孫
造
o5
結03
04
胞
o娘 の増殖率 (0
102
率 ol ___一
o■
―
―
日母の増殖率 (rm)
一 ――
―
―
T―
―
―
一
―
一
―
―
一
一
04
06
一
―
一
一
一
一
08
娘 細 胞の 増 旭 ¥(0
全体の増殖率{r)
―
図 6 増 殖 率 とス テ ー ジ構 造 の 関係 を
示 す 。 増 殖 率 が 高 い 程 、娘 細 胞 の構
所 比 率 が 低 下 す る。
図 7 全 体 増 殖 率 に 対 す る母 ・ 娘 細 胞
の増 殖 率 の比 較 を示 す 。 全 体 増 殖 率 が
上 が る と 、娘 細 胞 の 増 殖 率 が 低 下 す る 。
16
一 方 、 母 ―娘 モ デ ル と 成 熟 ―未 成 熟 モ デ ル を 合 体 させ た Three―
stageモ
デ ル で は 、 母 細 胞 と娘 細 胞 を 以 下 の 対 応 関 係 で 設 定 す る 。
娘
大 き い 一小 さ い
:未 成 熟 娘 細 胞 (出 芽 痕 0個 )
,″ :成 熟 娘 細 胞 (出 産 経 験 無 )(出 芽 痕 0個
協 :母 細 胞 (出 芽 痕 n個 )(n≧ 1)
'ゴ
)
θ :空 地
ス テ ー ジ構 成 は 、 母 細 胞 の 個 体 数 を 払
娘細胞 の個体数 を
〃
I)′ P2
a
,と
した 時 の 、
娘 細 胞 の 比 率 力 は 以 下 の よ うに な る。
,=,ゴ +ク ″
ケ
'/(胎
,)
母 細 胞 と 未 成 熟 娘 細 胞 お よ び 成 熟 娘 細 胞 の 増 殖 に 伴 う個 体 数 密 度 変 化 は
8の
図
よ う に な り、 成 熟 娘 細 胞 の 密 度 が 母 細 胞 を 上 回 る 結 果 と な る 。 さ ら
に 、 未 成 熟 娘 細 胞 の 比 率 は 20 stepを ピ ー ク に 、 以 後 減 少 して い く。 増 殖
す る 様 子 を 気 体 分 子 モ デ ル (格 子 モ デ ル )に て 解 析 す る と 図
9の
よ うに な
る。
個体数密 度
￨:liIIIIII:菫 :三
‐
「
f
02上
o
図
8
l≡
l。
m幡
o母
蜘細胞の 密度
￨ ￨
￨
___=鼻 _____―li蔦篇:蔦 情 ￨_￨
:“
「
二
三≡
≡
≡
肩
′「
■娘細胞 (Dr;の 密度
娘細胞 1〕 Iの 密度
.‐
10
20
30
40
so
50
70i
時 間 (step)
母 細 胞 と娘 細 胞 の 密 度 の 時 間 変
図
化 を示 す 。 時 間 の 経 過 と と も に娘 細 胞
9
格 子 モ デ ル 空 間 パ ター ン
クゴ:娘 細 胞
の 密 度 が 上 昇 す る。
■ Jビ
■ ″ :娘 細 胞
“
:イ 摯糸
包
田月
加 え て 、 ス テ ー ジ 構 造 の 時 間 変 化 を 、 密 度 効 果 の あ る な しで 比 較 した と こ
ろ、図
10お
よび
11に 示
した よ うに 、 密 度 効 果 を 想 定 し た 場 合 に お い て 、
娘 細 胞 の 比 率 の 上 昇 が 認 め られ た 。 す な わ ち 、 増 殖 に よ り空 地 が な く な る
と 、 娘 細 胞 の 母 化 が 抑 制 され 、 そ の 比 率 を 上 昇 させ る こ と が 推 察 さ れ る 。
17
この よ うに 、泰 中 らが 報 告 した 、格 子 気 体 モ デ ル に Three― stageモ デ ル を
拡 張 した 方 法 は 、詳 細 な 確 認 が 可 能 で あ るた め 出芽 酵 母 の 増 殖 に 関す る検
討 を加 え る数 理 解 析 法 と して 有 用 で あ る。
晰
晰
５
・
晰 晰 幌 ０
娘 綱 胞 の比率
娘 56
綱 o55
胞 。54
の
53
比
率 052
0・
0・
昭
時間 (step)
図
10
密 度 効 果 が ない場合 で の娘 細 胞
図
11
密 度 効 果 が あ る場 合 で の 娘 細 胞
の 比 率 を 示 す 。 一 旦 上 昇 し以 後 低 下 し
の 比 率 を示 す 。 密 度 効 果 と と もに比 率
安 定 的 に な る。
が 上 昇 す る。
18
2
実験的手法
出 芽 酵 母 の 母 細 胞 と娘 細 胞 の 比 率 お よ び 出 芽 痕 数 毎 の 分 布 状 態 と な る
世 代 構 成 を 確 認 す る 実 験 的 手 法 と し て は 、 出 芽 痕 を 染 め る こ と か ら始 ま る 。
図 12に 出 芽 酵 母 像 を 示 し た が 、 小 さ な 細 胞 が 娘 細 胞 で あ り 、 へ そ の よ う
写真 は 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る もの で あ るが 、
通 常 の 顕 微 鏡 で は 出芽 痕 を 見 分 け る こ とが で
Ｆ 一
な も の (出 芽 に よ っ て で き た 傷 :出 芽 痕 )を 保 有 した 細 胞 が 母 細 胞 で あ る 。
き な い 。そ こ で 、そ の 部 分 を 染 色 す る こ と と な
る が 、染 色 は 細 胞 壁 に 含 ま れ る キ チ ン を 染 め る
こ と で 行 う。キ チ ン は 出 芽 に 伴 い 出 芽 部 位 に 集
ヽr・〉鶴¶蛛
中 す る こ と か ら 、出 芽 痕 に 多 数 存 在 して い る こ
メtt壺
と と な り 、キ チ ン を 染 め る こ と で 出 芽 痕 を 識 別
(BacOn θι′ノ.,1966)。
CalcofluOr Whiteを 用 い る 。
す る こ とが 可 能 と な る
キチ ンの染 色 に は
図
12
:
出芽 酵 母 像
ま た 、 実 験 にお い て 注 意 す べ き こ とは 、 ① 培 養 条 件 を揃 え る こ と 、② 細
胞 凝 縮 を防 ぐ手 立 て を施 す こ と 、③ 明確 な 判 定 基 準 を設 定 す る こ とで あ る。
① に つ い て は 、 細 胞 の 培 養 は 、 前 々 培 養 、 前 培 養 と 2度 の 前 処 理 を加 え 、
か つ そ の 採 材 ポ イ ン トも揃 え る よ うに す る。 これ は 播 種 した 細 胞 の 世 代 分
布 構 成 を均 一 化 す る こ とが 目的 とな る。 ② に つ い て は 、細 胞 凝 縮 を 防 ぐ方
法 と して 、超 音 波 処 理 を用 い る。③ に つ い て は 、具 体 的 な も の を 後 述 す る。
一 方 、 本 研 究 を 行 うに あ た り、 従 来 法 か ら改 良 した 点 が あ る 。 一 つ は 、
観 察 時 に 断 層 写 真 を流 用 した 点 で あ る。 これ ま で に 実 施 され て きた 方 法 に
5mMの
Na2P04 Cirtic acid buffer(pH5.8)に て 洗 浄 し、
2 mg/mLの snail enzyme処 理 後 、 再 度 bufferに て 洗 浄 した 後 、 4%ホ ル
マ リ ン で 固 定 を 行 い 、超 音 波 処 理 を加 えた 後 、 遠 心 しそ の 沈 査 に O.1%
Calcofluor Whiteを 終 濃 度 1× 107cellS/mLに な る よ うに加 え 、1時 間 室 温
よ る と、細 胞 は
にお い た も の を ス ライ ドグ ラ ス に 滴 下 しカ バ ー グ ラ ス を か け鏡 検 す る も
の で あ る。鏡 検 は 、蛍 光 顕 微 鏡 に て 行 い 、 1処 理 に 800∼ 1000細 胞 の 出芽
痕 を 数 え る。 出芽 痕 の 算 定 に お い て は 、 一 つ 一 つ の 細 胞 毎 に ピン ト合 わせ
を行 い 、 必 要 に応 じて 細 胞 を 微 妙 に動 か し、読 み 取 り漏 れ が な い よ うに す
る。 この 方 法 にお い て は 出芽 痕 が 6個 以 上 の 細 胞 にお い て は 正 確 な 数 を 数
え る こ とが 困難 とな るた め 、 6個 以 上 の 場 合 は 一 括 して 「6個 以 上 」 と数
え る こ と とな る。 しか しな が ら、 この 点 は大 き な 問題 とな り、保 存 則 の 確
認 と世 代 構 成 の 評 価 に 影 響 す る。 そ こで 、細 胞 の 読 み 取 り誤 差 を な くす た
19
称 )す な わ ち 、 0.25 μm毎 に 顕 微 鏡 の 深 度 を 変
化 させ 、 そ の 像 を全 て 画 像 に て 残 し、 そ の 画 像 を基 に 出芽 痕 を 数 え る方 法
め に 、 細 胞 ス ライ ス 法
(自
を採 択 した 。 この 方 法 を用 い る こ とで 、 い つ で も、何 度 で も確 認 す る こ と
が 可 能 とな る。 ま た 、読 み 取 り漏 れ も皆 無 とな る。 さ らに細 胞 の 大 き さを
計 測 す る の に も都 合 が 良 い 。 図 13は 断層 撮 影 した 連 続 画 像 とな る。 実 験
で は 、一 視 野 あ た り 100細 胞 近 辺 に な る よ うに細 胞 懸 濁 液 を 調 整 す る。細
胞 数 が 多 い 場 合 は 細 胞 に重 な りが 生 じ、 正 確 な 算 定 が 困難 とな る 。 ま た 、
少 な い 場 合 は必 要 とす る画 像 の 枚 数 が 増 え て しま う。
↓出芽痕
↓出芽 痕 4
図
13
3
細胞 ス ライ ス法
鏡 検 時 に 深 度 を 変 更 (0.25 μmづ つ )し 、 そ の 中
で 出 現 す る 出 芽 痕 を 全 て 読 み 取 る 。上 記 の 写 真 は
7つ と な
AxioVisiOnソ
そ の 一 部 と な り 、こ の 例 で は 出 芽 痕 数 は
る 。 〔実 験 で は 、 Zeiss顕 微 鏡 に て
フ トを用 い解析〕
い ま 一 つ は 、 増 殖 状 況 を よ り詳 細 に 確 認 す る た め に 、 母 細 胞
分 類 の み に 留 ま らず 、 Gl期 、 S期 、 G2期 か ら
M期
0娘 細 胞 の
に 分 け て 分 類 した こ と
で あ る。 以 下 に そ の 分 類 基 準 を記 述 す る。
Gl期
Gl期
G2/M期
S期
図 14 出芽 痕 の 算 定
写 真 は 出 芽 痕 3と す る。
:出 芽 し て い な い 細 胞
S期 :出 芽 中 で あ るが 、 娘 細 胞 部 分 が 母 細 胞 の 1/2未 満 の も の
G2/M期 :娘 細 胞 部 分 が 母 細 胞 の 1/2以 上 の も の
さ ら に 、 鏡 検 に お い て は 、 出 芽 中 の 娘 細 胞 部 分 が 1/2以 上 で あ っ て も 、
完 全 に 分 離 して い な い も の は 娘 細 胞 と し て カ ウ ン トは し な か っ た (図 14)。
ま た 、出 芽 中 の 細 胞 か 、細 胞 分 離 が で き て い な い と こ ろ か 迷 う場 合 は 、DIC
に て 立 体 観 察 を し 、 接 合 部 分 の 状 況 を 確 認 した 上 で 判 定 した 。 分 離 が 確 認
で き た もの は
2つ の 細 胞
と して カ ウ ン ト し 、 分 離 が 明 確 で な い も の は 出 芽
中 細 胞 と して カ ウ ン ト した 。
20
第 二章
出 芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動
つ４
1
要旨
出芽 酵 母 は 、母 細 胞 か ら娘 細 胞 を 出芽 す る こ とで 子 孫 を増 や す 増 殖 形 態
を示 す 。 ま た 、 出芽 酵 母 の 増 殖 は 、 分 裂 酵 母 や 細 菌 な ど と 同様 に ロ ジ ス テ
ィ ッ ク な 増 殖 パ タ ー ン を示 す 。 出芽 酵 母 の 母 細 胞 ・ 娘 細 胞 の 比 率 に 着 目 し
た 増 殖 に 関す る研 究 は 、古 くは Hartwellら Johnstonら 浜 口 ら泰 中 らに よ
っ て な され て きた が 、 出芽 痕 数 を正 し く算 出す る こ と 、 と りわ け 出芽 痕 の
多 い 細 胞 の 出芽 痕 数 を算 出す る こ とは容 易 な こ とで は な く、得 られ て い る
結 果 も限 られ た も の で あ っ た 。 ま た 、 そ れ を補 うた め に 増 殖 シ ミ ュ レー シ
ョン に よ る数 理 解 析 が 試 み られ て き た 。 我 々 は 、顕 微 鏡 観 察 時 に焦 点深 度
を 自動 変 動 させ る こ とで 、細 胞 中 に 存 在 す る 出芽 痕 を漏 れ な く算 定 す る方
法 を採 択 し、 この 方 法 を用 い て 、増 殖 ス テ ー ジ にお け る母 細 胞 と娘 細 胞 の
比 率 、母 細 胞 に 存 在 す る 出芽 痕 の 数 、 並 び に細 胞 の 大 き さに よ る比 較 を行
つ た 。 さ らに 、数 理 解 析 結 果 と、 実 測 値 との 比 較 を試 み た 。
そ の 結 果 、娘 細 胞 の 挙 動 にお い て 、密 度 効 果 が 現 れ て い な い 状 況 で 定 常
期 へ の 準 備 が 始 ま っ て い る こ と、定 常 期 以 後 に 娘 細 胞 の 増 カロと母 細 胞 の 高
齢 化 が 認 め られ る こ とを観 察 した 。 この 変 化 は 、 野 性 株 (S288C)に 留 ま
力″ ∠,θ θ∠)に お い て も 同様 に認 め られ た 。
らず 、 変 異 株 (BY4147,レ′
一 方 泰 中 は 、 出芽 酵 母 の 出芽 様 式“
か ら推 測 し、 出芽 され る娘 細 胞 の 総 数
(結 果 と して 細 胞 の 総 数 )と 出芽 痕 数 の 総 数 とに 一 致 性 が 認 め られ 、 生 育
環 境 が整 っ て い れ ば こ の 状 態 が 保 持 され て い る と考 え る「保 存 則 」(図 15)
を提 唱 した 。 しか しな が ら、 これ ま で の 実 験 手 法 で は 正 確 に 出芽 痕 を 数 え
る こ とが 困難 で あ り、 そ れ を実 証 す る に は至 っ て い な か っ た 。 今 回 、精 度
の 高 い 方 法 に よ り検 証 をカロえ た 結 果 、保 存 則 が 成 り立 つ こ とが 確 認 で き た 。
さ らに 、 そ の 状 況 を精 査 して い る 中 で 、 保 存 則 が 成 り立 つ 場 合 、 総 細 胞 数
と総 出芽 痕 数 の 比 率 は 1.0に な る は ず で あ るが 、実 測 値 にお い て 0.75程 度
の も の が 観 察 され た 。 ま た 、 対 数 増 殖 後 期 前 後 の 標 本 にお い て 壊 れ た 細 胞
が 散 見 され た 。 そ こで 、保 存 則 が 成 り立 た な くな つ た 原 因 を細 胞 消滅 と捉
え 、細 胞 消 滅 頻 度 を任 意 に設 定 しシ ミ ュ レー シ ョン した 結 果 、 出芽 痕 数 が
6以 上 の 細 胞 に細 胞 消 滅 が 発 生 す る と仮 定 した 場 合 に理 論 値 と実 測 値 とに
近 似 が 得 られ た 。 さ らに 、細 胞 消 滅 の 発 生 が 対 数 増 殖 後 期 に 一 過 性 に発 生
す る こ とが 確 認 され 、 そ の 頻 度 は 0.8%以 下 で あ つ た 。
以 上 の こ とか ら、今 回 用 い た 方 法 は 、増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動 を確 認
す る方 法 と して 優 れ て い る と判 断 した 。 ま た 、 そ の 結 果 と して 、増 殖 環 境
の 悪 化 に 伴 い 集 団 全 体 の 増 殖 率 が 低 下 した 場 合 、子 供 の 比 率 が 増 え る とい
う逆 理 (少 子 化 パ ラ ドッ ク ス )、 母 細 胞 と娘 細 胞 と の 出 芽 を 開 始 す る ま で
つを
０４
に至 る時 間 の相 異 や 、娘 細 胞 の 出芽 は抑 制 す るが 、母 細 胞 の 出芽 は抑 制 さ
れ な い こ と か ら発 生 す る 三 極 化 現 象 (セ パ レー シ ョ ン )、 な ら び に 対 数 増
殖 後 期 に 一 過 性 の 細 胞 消 滅 が 発 生 す る こ と が 認 め られ た 。
○
出芽痕
二
〇 一 ●
○
○ ―
図
細 胞 (緑 色 ):1
出芽痕
:1
細 胞 (緑 色 )
出芽痕
15
保存則
出 芽 痕 の 数 は 、 そ の 細 胞 か ら生 み 出 され た 娘 細 胞 の 数 と 同 じに な る 。 す な
わ ち 理 論 的 に は 母 細 胞 、 娘 細 胞 の 世 代 時 間 に か か わ りな く 、 細 胞 の 総 数 と
出 芽 痕 の 総 数 は 一 致 す る 。 こ れ を 「保 存 則 」 と い う。 図 は 、 出 芽 に よ り細
胞 が 増 え て い く様 子 を 現 した も の で あ る 。 一 度 目 の 出 芽 に よ り娘 細 胞 が 一
つ と 出 芽 痕 が 一 つ 発 生 す る。三 度 目の 出 芽 に よ り さ ら に 一 つ の 細 胞 が 増 え 、
成 長 した 娘 の 出 芽 と 合 わ せ 二 つ の 細 胞 が 発 生 し 、 出 芽 痕 も 二 つ とな る (オ
レ ン ジ 色 の 細 胞 は オ リ ジ ナ ル 細 胞 で あ り 、細 胞 数 に は 含 め な い )。
この よ う
に 、 理 論 的 な 保 存 則 が 成 り立 つ た め 、 あ る 特 定 の 実 験 に よ る結 果 を 解 釈 す
る場 合 に お い て 、 世 代 毎 の 比 較 を す る こ とが 容 易 とな り、 こ の こ とが 生 態
学 へ の 応 用 が 可 能 と考 え る 所 以 で あ る。
23
2
序論
多 細 胞 生 物 に は老 化 ス テ ー ジ の 異 な る細 胞 が 混 在 して い る。 そ れ らが 、
細 胞 分 裂 や 老 化 に ど の よ うに か か わ りあ つ て い るか は 、 ほ とん ど理 解 され
て い な い 。 出芽 酵 母 は 単 細 胞 生 物 で は あ る が 、 出産 回数 に 等 しい 数 の 出芽
痕 を もつ た め 、個 々 の 細 胞 の 老 化 ス テ ー ジ を求 め る こ とが で き る。さ らに 、
寿 命 制 御 に 関 与 す る遺 伝 子 は 、酵 母 か ら ヒ トま で 高 度 に保 存 され て い る た
め (Bitterman θ
.,2003、 Fabrizio θι′′
.,2008、 Steinkraus θ ′
.,2008、
`2′
`′
Barea θι′ヱ,2009)、 出芽 酵 母 は真 核 細 胞 の 老 化 ・ 寿 命 の 研 究 に適
して い
る (Thorpe θι′′
.,2008、 Neumiller θι′′,2009)。 老 化 の 進 ん だ 出芽 酵
母 の 母 細 胞 中 に は 、 ERCs(extrachrOmOsomal ribOsOmal DNA circles)
と呼 ばれ る染 色 体 か ら切 断 され た DNA断 片 、 お よび 活 性 酸 素 に よ リダ メ
ー ジ を受 け た ミ トコ ン ドリア や タ ン パ ク 質 が 蓄 積 す る も の の 、 これ らは 分
裂 中 の 娘 細 胞 に は 分 配 され な い 保 護 機 能 が 備 わ つ て い る (Sinclair θι′ス
1997、 Lai θ ′,2002、 Aguilaniu θι′′
.,2003、 ShcheprOva θι2■ ,2008、
,
`′
Kaeberlein,2008、 Erjavec θ ′
.,2007、 Ganley θι′■,2009)。
この よ う
`′
に 、 出芽 酵 母 は形 態 的 の み な らず 、細 胞 内部 の 構 造 体 に 関 して も、非 対 称
的 な 分 裂 様 式 を も つ て い る。 そ の た め 、 分 裂 を重 ね るた び に 、 母 細 胞 の 老
化 が進 む と考 え られ る。
出芽 酵 母 の 寿 命 と して は 、 分 裂 可 能 な 回数 か ら規 定 され る分 裂 寿 命
(RLS:Replicative life span)と 分 裂 停 止 後 の 細 胞 が生 き延 び る時 間 か ら
規 定 され る経 時 的 寿 命 (CLS:chron。 10gical life span)と が 知 られ て い る。
分 裂 寿 命 は 、通 常 、 寒 天 培 地 上 に 置 かれ た 一 つ の 母 細 胞 か ら娘 細 胞 が 出芽
す るた び に顕 微 鏡 下 で 取 り除 き、何 個 の 娘 細 胞 を 出芽 で き る か を調 べ る こ
とで 測 定 され 、 一 般 に 出芽 酵 母 の 分 裂 寿 命 (本 論 分 で は 、 分 裂 回 数 で ス テ
ー ジ を規 定 す る )は 20‐ 30回 程 度 で あ る (Mortimer θι′′,1959、 Matt θι
′′
.,2005、
Kristan θι′′,2009)。
しか しこれ は 周 囲 に 他 の 酵 母 が い な い
条 件 下 の 分 裂 回数 で あ り、これ が 実 際 の 細 胞 集 団 内 で の 寿 命 (生 態 的 寿 命 )
を反 映 して い るか ど うか は 不 明 で あ る。
一 方 、経 時 的 寿 命 にお い て も、 これ は 、液 体 培 地 に て 培 養 した 定 常 期 の
細 胞 の 培 養 を続 け て 一 定 時 間後 に細 胞 を寒 天 培 地 に 蒔 い て 出 現 す る コ ロ
ニ ー 形 成 率 か ら求 め られ るた め 、 そ の 際 の ス テ ー ジ の 異 な る個 々 の 細 胞 の
経 時 的 寿 命 は不 明 で あ る。 こ の よ うに 、様 々 な世 代 が 混 在 す る細 胞 集 団 内
にお い て 、 ス テ ー ジ の 異 な る細 胞 の 増 殖 と老 化 が どの よ うに 制 御 され て い
るか は ほ とん ど理 解 され て い な い 。 そ こで 我 々 は 、 出芽 酵 母 を用 い 、集 団
内 にお け る個 の ス テ ー ジ の 分 布 を 調 べ る と と も に 、時 間 の 経 過 に 伴 う変 化
24
を確 認 した 。
出芽 酵 母 は 出芽 に よ つ て 生 じた 娘 細 胞 が 母 細 胞 か ら分 離 す る と、母 細 胞
に は 出芽 痕 が残 るた め 、個 々 の 細 胞 の ス テ ー ジ が 判 断 で き、 ス テ ー ジ に応
じた 増 殖 と老 化 を解 析 す る の に適 して い る。 そ の 際 、 出芽 痕 の 数 は 、 そ の
細 胞 か ら産 み 出 され た 娘 細 胞 の 数 と同 じに な る。 つ ま り、 理 論 的 に は 、 母
細 胞 、娘 細 胞 の 世 代 時 間 に か か わ りな く、細 胞 の 総 数 と出芽 痕 の 総 数 は 一
致 す る。 い わ ゆ る 「保 存 則 」 が 成 立 す る。
出芽 酵 母 の 母 細 胞 と娘 細 胞 との 比 率 お よび 保 有 出芽 痕 (ス テ ー ジ )数 毎
の 分 布 状 態 で あ る 「世 代 構 成 」 に着 目 した 増 殖 に 関す る研 究 は 、数 理 解 析
を基 に し、 これ と実 験 結 果 とを比 較 して理 論 的 に 現 象 を論 述 す る こ とで 行
.,1997、 Hamada,
われ て き た (Hartwell θι′■,1974,1977、 Johnson θ ′
`′
1982,1985、 Tainaka θ ノ
.,1978、 Wheals,1980)。
.,2006、 Carter θ ′
`′
`′
しか しな が ら、 これ ま で の 研 究 で は 、 出芽 痕 数 を正 確 に 算 定 す る こ とが 難
し く、 か つ 多 大 な 労 力 と時 間 を 要 して い た こ とか ら、 そ の 解 析 は 十 分 な も
の で は な か っ た 。 我 々 は 、 出芽 痕 の 特 定 にお い て 、顕 微 鏡 下 で Z軸 方 向 に
ス ライ ス して 断層 的 に 画 像 を撮 影 し、 そ の 画 像 を解 析 す る こ とで 算 定 す る
方 法 を採 択 した 。 そ の 結 果 、従 来 法 に比 較 して よ り詳 細 な確 認 が 可 能 とな
った。
本 章 で は 、実 験 に て 詳 細 な 検 討 を加 え た結 果 得 られ た 、環 境 の 悪 化 に伴
う娘 細 胞 の 比 率 の 増 力日と母 細 胞 の 多 産 化 傾 向 に つ い て 論 述 す る。 ま た 、 実
験 に て 確 認 した 保 存 則 か らの 実 測 値 の ズ レ を数 理 解 析 した 結 果 、 ス テ ー ジ
の 高 い 細 胞 の 選 択 的 細 胞 死 が 示 唆 され た こ とに 関 し論 述 す る。
25
3 材 料 お よび 方 法
(1)使 用 株
出芽 酵 母 (3密 あ ′Fο ″ノοθS Oθ Fθ
7ゴ
S力 θ、以 下 同 じ)は 、
野 生 株 と して
S288C
(Mortimer θι′■,1986)、 S288Cの 栄 養 要 求 性 株 と して BY4741
BY4741に 対 す る遺 伝 子 ノ ック ア ウ ト株 と し
.,2004)、 βあ θ∠ (GO期 進
て %″
転 写 阻 害株 )(Michael θ′′′
入 抑 制 "(G1/S期
株 )(Casamayor θι′ム,1999)を 用 い た 。そ れ ぞ れ の 株 の Genotype
(Brachmann
θ′′ム 1998)、
お よび 遺 伝 子 の 機 能 を 表 7お よび 表 8に 示 した 。
(2)使 用 培 地
1,000 mLあ た り、 1.7gの Yeast nitrogen bese、 5gの 硫 酸 ア ンモ ニ ウ
ム 、 20gの グル コ ー ス (終 濃 度
complete)合 成 培 地 を用 い た 。
2%)に 以 下 の ア ミノ 酸 を加 えた SC(SD
IsOleucine
18.8 mg
Valine
93.8
12.5
12.5
12.5
62.5
18.8
12.5
Adenine hemisuifate
Aargnin HCl
Histidine H Cl monohydrate
Leuclne
Lysine HCl
Methionine
Phenylalanine
Threonlne
Tryptophan
Tyrosine
Uracil
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
313 mg
125 mg
12 5 mg
18.8 mg
12.5 mg
(3)培 養 条 件
1,000 mL用 の 三 角 フ ラ ス コ に 200 mLの SC合 成 培 地 を加 え 、30℃ の 培
養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。 播 種 酵 母 数 は 、 前 々 培 養 (約 24時 間 )お よび
前 培 養 (約 24時 間 )し た酵 母 を 8× 104/mL(終 濃 度 )に 調 整 し培 養 液 に加
えた 。
(4)サ ンプ リ ン グ
細 胞 の 増 殖 状 態 を確 認 す るた め に 、 濁 度 (OD600)測 定 お よび 細 胞 数 算
定 を行 つ た 。 濁 度 測 定 お よび 細 胞 数 算 定 の た め の サ ン プ リ ン グは 、培 養 開
26
始 か ら 3時 間 お き に 36時 間後 ま で 行 つ た 。 母 細 胞 ・ 娘 細 胞 の 分 布 お よび
出芽 痕 数 算 定 用 ス ライ ドを 作 製 す るた め の サ ンプ リ ン グ は 、S288Cで は 培
9,12,15,18,21,36時 間 後 、 BY4741、 %″
"、
24,27,30,36時 間後 に行 つ た 。
養
sο
力
で は 培 養 18,21,
`必
(5)標 本 の 作 製 お よび 観 察
採 取 した
l mL液 を遠 心 分 離
(卓 上 遠 心 機
:VORTEX 5秒 間 )し 、 この
沈 澄 を蒸 留 水 に て 洗 浄 した 後 、再 度 遠 心 分 離 (同 上 )し た 。この 沈 澄 に 100
μLの Calcofluor White液 (l mg/mL)(Sigma社 製 、No F3543)を 力日え 、
3分 間染 色 した 。 再 度 遠 心 分 離
(同 上 )後 、蒸 留 水 に て
2度 洗 浄 し、 洗 浄
後 、 蒸 留 水 を 500 μL加 え た 。 これ を 、 氷 冷 下 に て 超 音 波 処 理 (20秒 間 、
約 65」 )し 、弱 く結 合 して い る細 胞 同 士 を 分 離 させ た 。 そ れ を再 び 遠 心 分
離 (同 上 )し 、 一 定 濃 度 (顕 微 鏡 観 察 時 に 一 視 野 100細 胞 程 度 に な る よ う
に 調 整 )の 懸 濁 液 を 作 製 した 。 この 懸 濁 液 を ス ライ ドグ ラ ス に 1.7 μL滴 下
し、 これ に カ バ ー グ ラ ス を載 せ 、 さ らに透 明 な マ ニ キ ュ ア に て カ バ ー グ ラ
ス の 辺 縁 を 覆 い 、乾 燥 を 防 止 した 。標 本 の 観 察 は 、蛍 光 顕 微 鏡 (Carl Zeiss,
AxiO Imager M l)を 用 い 、 UV励 起 に て 63倍 の 油 浸 レン ズ を用 い て 630
倍 に て 鏡 検 した 。鏡 検 時 に 、焦 点 深 度 を 自動 で 0.25 pm毎 に 変 動 させ る こ
とで 細 胞 の 断 層 面 の 画 像 を取 得 した 。 この 画 像 を基 に 、母 細 胞 と娘 細 胞 の
比 率 、 出芽 痕 の 数 的 分 布 の 時 間変 化 、 な らび に 出芽 中 の 細 胞 を
Gl期 、 S
期 、 G2/M期 に 分 類 して 計 数 した 。 ま た 、 それ ぞ れ の 株 の 増 殖 に 伴 う娘 細
胞 の 大 き さに よ る比 較 を 行 つ た 。 細 胞 の 大 き さは 、画 像 解 析 ソフ ト (Axio
Vision Re1 4.6)に て 行 っ た 。
(6)数 理 解 析
.,2006)
出芽 酵 母 の 増 殖 モ デ ル の 解 析 は 、 泰 中 らが 報 告 (Tainaka θι′′
した 、 格 子 気 体 モ デ ル に Three‐ stageモ デ ル を拡 張 した 方 法 に て 行 つ た 。
さ らに 、 実 験 に て 得 られ た 結 果 とシ ミ ュ レー シ ョン結 果 と の 比 較 を行 い 、
ズ レが 発 生 した 場 合 は 、 そ の 原 因 を探 る た め 、新 た な設 定 条 件 を加 え る こ
とで 両 間 の ズ レ補 正 を行 い 、 実 験 で の 結 果 が 何 を意 味 す る も の か 予 測 した 。
η‘
０４
4
実験結果
(1)細
胞 の増殖 状 況
細 胞 の 増 殖 状 況 を 、 細 胞 濁 度 (単 位 培 養 液 中 の 生 体 量 、 細 胞 の 大 き さ に
よ っ て 変 化 す る )お よ び 細 胞 数 (単 位 培 養 液 中 の 細 胞 数 )に よ り確 認 した 。
(S288C)と
、 そ れ とは 異 な る細 胞 増 殖 プ ロ フ ァイ ル を
ヾた 。 BY4741は S288C
も つ 株 BY4741,助 ″ J∠ お よ び sθ 力θ∠ を 用 い て 調 ン
実験 には、野生株
由 来 の 栄 養 要 求 性 株 で あ り 、 そ の た め 増 殖 が 遅 延 す る 。 ″力″ ∠ と
は
BY4741由
と
SCH9(TORの
来 の 株 で あ り 、そ れ ぞ れ
sθ 力θ∠
Nm5(G1/S進 行 を 抑 制 す る 遺 伝 子
)
下 流 で 働 く プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ の 遺 伝 子 )を 欠 損 して い
る 。 そ の た め 、 ″r力 ″ ∠株 は 娘 細 胞 が 大 き く な る 前 に
G1/S進 行 が 起 こ り 、
そ の 結 果 、 細 胞 が 小 さ く な る 。 一 方 、 sθ 力θ∠ も 細 胞 成 長 に 欠 損 を 持 つ た め
細 胞 が 小 さ くな る。
S288C,BY4741,″ L渉 ∠ ,sθ 力θ∠ の 増 殖 に 伴
を図
16お
よび
17に 示
う濁 度 お よ び 細 胞 数 の 変 化
した 。
０
８
§８ ︶Щ興
︵
S288C
BY4741
６
″力/J∠
sσ 力′∠
４
21
24
27
30
21
24
27
30
33
36
１
０
１
§８ ︶撻興
︵
０
１
「
18
．
0.01
0.001
0
3
6
9
12
15
18
33
36
培 養 時 間 (hr)
図
16
は
"の
30時 間 、 sθ 力θ∠ は 27時 間
、 %西
細 胞 増 殖 曲線
濁 度 の 変 化 を 上 段 は 自然 数 、 下 段 は 対 数 に て 表 記 した 。 増 殖 の 速 さ は 、
S288C<BY4741,sθ 力θ∠<″ 万
順 とな っ た 。S288Cは 24時 間 、BY4741
28
"は
33時 間 以 降 に 定 常 期
とな っ た。
10.0000
S288C
３ミ ∞
２ ｘ︶ 輛 星 軍
BY4741
1.0000
″カノJ∠
sσ 力′∠
0.1000
0.0100
0.0010
0.0001
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
培 養 時 間 (hr)
図
17
細 胞 増 殖 曲線
細 胞 数 の 変 化 を示 した 曲線 の 印 は 図 16と 同 じ。
野生株
S288Cに 対
し 、BY4741,"「 力″ ∠ お よ び
sθ 力θ∠ は
い ず れ と も増 殖
遅 延 が 認 め られ た 。 そ の 度 合 い は 、 S288C<BY4741,sθ力θ∠ <″ 力″ ∠ の 順
で あ つ た 。 さ ら に 、 sθ 力θ∠ は 増 殖 遅 延 に 加 え 、 定 常 期 の 濁 度 が 低 下 し た 。
細 胞 数 に つ い て は 、栄 養 要 求 性 、 ノ ッ ク ア ウ ト株 と も に
S288Cよ
り緩 や か
な 増 殖 と な っ た 。 S288C以 外 の 遺 伝 子 欠 損 株 に 関 して は 、細 胞 数 の 増 加 は
ほ ぼ 同 じで あ っ た (対 数 増 殖 期 に お け る 倍 加 時 間 は 、S288Cが 約 1.5時 間 、
そ の他 が約
(2)培
2時 間 で あ つ た )。
養 中の娘 細胞 の大 き さ
Hartwell,Carter,Whealsら
は 、増 殖 率 と 細 胞 の 大 き さ に は 関 連 が あ り 、
増 殖 率 が 高 い 場 合 は 母 細 胞 と娘 細 胞 の 大 き さ に 大 き な 開 き は な く 、 増 殖 率
が 低 下 した 場 合 、娘 細 胞 が 小 型 化 す る と 報 告 した (Hartwell θ′′ノ
。
,1977、
Carter θ′′ノ.,1978、 Wheals θ′ノ 。
,1980)。 こ れ を 検 証 す る た め に 、 娘 細
胞 の 大 き さ を 測 定 した 。 そ の 結 果 、 い ず れ の 株 に お い て も 対 数 増 殖 期 か ら
(S288Cは 18時 間 、BY4741は 27時 間 、″力″ ∠ は 30時 間 、
27時 間 :細 胞 数 に て 評 価 )ま で は 、 細 胞 の 小 型 化 が 認 め られ た
対数 増殖後期
sθ 力θ∠ は
(表
1、
図 18)。 そ の 後 、 減 ″ ∠ と
ん だ が 、 S288C(21時 間 )、
sθ 力θ∠ は 定
BY4741(36時
常 期 ま で さ らに 小 型 化 が 進
間 )で は 、 そ れ ま で の 小 型 化
傾 向 か ら 、 肥 大 化 に シ フ ト した 。 ま た 、 細 胞 の 大 き さ を 株 毎 で 比 較 した と
こ ろ 、培 養 期 間 中 の 全 て の 時 期 に お い て 、BY4741は
型 で あ っ た (表
∠と
1、
sθ力θ∠ の 細
S288Cよ
りも常 に小
図 18)。 ま た 、培 養 期 間 中 の 全 て の 時 期 に お い て 、 ″力″
胞は
BY4741細 胞 よ り も さ ら に 小 型 で あ っ た
29
(表
1、
図
ち な み に 、培 養 36時 間後 の 娘 細 胞 の 大 き さを株 毎 で 比 較 した と こ ろ 、
S288Cで は 3 μm未 満 が 28.0%に 対 し 3 μm以 上 が 72.0%、 BY4741で は
18)。
67.1%と 32.9%、 助″例 で は 91.4%と 8.6%、
sθ 力θ
∠で は
71.5%と 28.5%
と、野 生 株 に 対 し変 異 株 は い ず れ も小 型 化 して い た 。 特 に 肋薔測 が 顕 著 で
あ つ た 。これ は 、過 去 の 報 告 (Jorgensen θιノ.,2002、 Zhang θ′ノ。
,2002)
と一 致 して い た 。
S288C
21｀
hr
e
t
θ ・Ｌ
ン
●
ザ
(
● ′
・
18 hr (
15 hr
BY4741
18け
′
争.主
1響
●
《
′tt
・
.
)
.0
￨「
、
曖7 hr
F
36 hF→
ヽ
｀
摯
●
●
●
″力/J∠
蹄
．
21け
27 hr
●
・ ‐
″●
`.Ct
一
ヽ
中
、
。
●
sθ 力θ∠
ヽ
．
27 hr
ｒ
一ｈ
=
６
■６
21 hr
0
●●
.
ヽ・
●
し
ご
、 、
図
(3)世
18
′
実 験 に用 い た 株 の 培 養 時 間 毎 の 代 表 的 な 写 真 像 を示 す 。
代 構 成 お よび 出芽 痕 の発 生 状 況
培 養 過 程 に お け る 母 細 胞 と娘 細 胞 の 比 率 、 出 芽 痕 の 数 的 分 布 の 時 間 変 化
につ い て は、 図
19お
よび 表
2か
ら
5に 示
した 。
そ の 結 果 、 い ず れ の 株 に お い て も対 数 増 殖 期 か ら対 数 増 殖 後 期 ・ 定 常 期
に か け 、 娘 細 胞 の 比 率 が 上 昇 した 。 そ の 上 昇 率 は 最 大 で 、 S288Cが 1.28
倍 、 BY4741が
1.15倍 、"「 カゴσ∠ が 1.26倍 、sθ 力θ∠ が 1.20倍 で あ っ た 。
30
ま た 、 出 芽 痕 数 を 総 細 胞 数 で 割 つ た 値 (保 存 則 の 保 持 状 況 の 確 認 、 図 中
で は 青 色 実 線 )に つ い て は 、 S288Cで は 0。 74∼ 0。 96、 BY4741で は 0。 78
∼ 0.97、 %″ σ∠ で は o。 76∼ 0。 97、 sα iθ ∠で は 0。 73∼ 0。 95と 、 株 に お け る
大 差 は な く、 ほ ぼ 同程 度 で あ っ た。 ま た そ の値 は 、全 て の株 にお い て 、 対
数 増 殖 期 で 高 く 、 対 数 増 殖 後 期 ・ 定 常 期 で 低 い 傾 向 が 認 め られ た 。
S288C
出芽痕数
BY4741
100%
90%
90%
80%
80%
70%
70%
■7
60%
60%
■6
50%
40%
50%
■5
40%
■4
出現率
100%
10
凛9
:8
■3
30%
30%
20%
20%
10%
10%
0%
0%
9 hr
12 hr
15 hr
18 hr
21 hr
■2
1
0
36 hr
21 hr 24 hr
27 hr
30 hr
36 hr
培養時間
N憔
sa力 θ∠
ヘ
100%
100%
90%
90%
10
日9
80%
80%
70%
70%
■7
60%
60%
■6
50%
50%
■5
40%
40%
■4
30%
30%
20%
20%
10%
10%
0%
18 hr
21 hr
24 hr
27 hr
30 hr
,8
■3
■2
1
0
0%
36 hr
18 hr
21 hr 24 hr
27 hr
30 hr
36 hr
19
培 養 中 の 細 胞 の ス テ ー ジ 分 布 と保 存 則 比 の 変 化
培 養 時 間 中 の 細 胞 の ス テ ー ジ (出 芽 痕 0∼ 10)分 布 を 棒 グ ラ フ の 色 で
図
示す。 出芽痕 数
0の 娘 細 胞 の 出 現 比 率 が 増 加 す る こ と を 示 す 。 参 考 の
た め 、増 加 前 の値 を薄 い 青 ライ ン に て 示 す 。 棒 中 の数 値 は総 出芽 痕 数
を総 細 胞 数 に て 割 つ た 値 を示 す 。 保 存 則 比 の 低 下 が 発 生 す る こ とを 青
色 曲線 に て 示 す 。
００
さ らに 、 母 細 胞 の 出 芽 痕 数 毎 に お け る 出現 率 の 比 較 で は 、 図
20に 示 す
よ う に 、 密 度 効 果 が 認 め られ る 前 で は 出 芽 痕 の 少 な い 母 細 胞 が 多 く 、 密 度
効 果 が 現 れ た 後 は 出 芽 痕 の 少 な い 細 胞 が 減 少 し、 出 芽 痕 の 多 い 細 胞 が 増 加
す る傾 向 が 認 め られ た 。
S288C
RY4741
BY4741
25
-21 hr
-24
hr
甕 L=27 hr
-15 hr
-18 hr
５ ０
出現率
・→卜
● 21 hr
`“
-30●
hr
バ
、
-36 hr
o・ ra●
36 hr
％
ヽ
″力/J∠
…
sθ 力θ∠
-21
-24
-27
-30
hr
hr
hr
hr
a― ,-36
-21
hr
‐口 ‐
■卜 24 hr
い
ヽ
・
● -127 hr
-30 hr
15
hr
s,F`・
‐36 hr
10
123456
12345678910
20
母 細 胞 の 出芽 痕 数 毎 にお け る 出現 率 の 比 較
培 養 時 間 の 経 過 に 伴 い 、出 芽 回数 が 少 な い 母 細 胞 は 減 少 し、出 芽 回 数 が 多 い
母 細 胞 が 増 加 し、 母 細 胞 の 多 産 化 傾 向 が 認 め られ る 。
図
加 え て 、 Gl期 、 S期 、 G2‐ M期 で の 比 較 で は 、 対 数 増 殖 期 か ら対 数 増 殖
後 期 に か け 、娘 細 胞 が
S期 、G2… M期
の 比 率 を 著 し く低 下 さ せ る の に 対 し 、
母 細 胞 で は 平 行 あ る い は 僅 か な 減 少 で あ つ た 。 ま た 、 S期 お よ び G2-M期
の 出 現 比 率 に お い て 、 出 芽 回 数 が 多 い 細 胞 へ の シ フ トが 認 め られ た 。 こ の
傾 向 は い ず れ の 株 に お い て も認 め られ た が 、 増 殖 が 緩 や か な ″力″ ∠ 、 増
殖 に お け る 頭 打 ち 現 象 が 認 め られ る
sθ 力θ∠で
は 弱 く 、 S288C、
BY4741で
は 顕 著 で あ っ た 。 加 え て 、 対 数 増 殖 後 期 以 降 、 S期 、 G2-M期 の 出 現 は ほ
と ん ど 認 め られ な か っ た (表
6)。
32
(4)対 数 増 殖 後 期 にお け る死 細 胞
顕 微 鏡 観 察 時 に 壊 れ た 細 胞 が 散 見 され た が 、 そ の 発 生 頻 度 は 、対 数 増 殖
後 期 前 後 に 多 か っ た (図 21)。 この 壊 れ た 細 胞 の 発 生 原 因 と して 、標 本 作
製 時 にお け るア ー テ ィ フ ァ ク トを疑 い 、超 音 波 処 理 条 件 (超 音 波 処 理 を し
な い 条 件 も含 め )、 撹 拌 処 理 条 件 、遠 心 分 離 条 件 、標 本 へ の 滴 下 条 件 な ど、
様 々 な 検 討 を加 え た が 発 生 状 況 に 変 わ りは な か っ た 。 そ の 壊 れ た 細 胞 はす
べ て 母 細 胞 で あ り、 且 つ 多 産 化 した も の が 多 い 傾 向 が 認 め られ た 。
S288C21hr
○
A
□
C
G
F
D
巨
21
壊 れ た細胞 像
した 母 細 胞 の 細 胞 壁 に 亀 裂 が 入 つ て い る
壊 れ た 細 胞 の 出 現 状 況 (S288C培 養 21時 間 後 )。
図
A,B:多 産
(S288C培
D,E:Dに
養
21時 間 後 )。 C:
Calcofluor White
Eに Propidium iodide染
染色像 を
色 像 を 示 した 。 2つ の 細 胞 が 死 細 胞 と して 赤
い
く染 色 され て る が 、壊 れ た 細 胞 は 染 色 され て い な い 。Gは 壊 れ た 細 胞 か ら漏 れ
出 た ク ロマ チ ン が 染 色 され て い る像 で あ る が 、Eの 壊 れ た 細 胞 も 同 様 に ク ロマ チ
ン が 流 出 して しま い 染 ま っ て い な い 可 能 性 も あ る (詳 細 は 第 二 章 第 二 節 を 参 照 )。
33
5
数理解析結果
出芽 酵 母 の 増 殖 モ デ ル の解 析 は 、 泰 中 らが 報 告 した 格 子 気 体 モ デ ル に
Tree‐ stageモ デ ル を 拡 張 した 方 法 に て 行 つ た 。 ま た 、 実 験 結 果 に お い て 、
対 数 増 殖 後 期 前 後 に 壊 れ た 細 胞 が 散 見 され る 現 象 が 認 め られ た た め 、 モ デ
ル に 細 胞 消 滅 に 関 す る 要 素 を 加 え 解 析 し た 。 各 細 胞 は 次 の よ うに 定 義 し た 。
Di:未 成 熟 娘 細 胞
0個
Dm:成 熟 娘 細 胞 (出 芽 痕 0個
Mn:出 芽 痕 保 有 細 胞 (出 芽 痕 n個 )(n≧
(出 芽 痕
)
)
1)
0:空 地
各 細胞 の反 応 式 は以 下 を用 い た。
Di一 二 → Dm
Dm+O Ml+Di
M.1+0-M.+Di
Mn一
〇
g:未 成 熟 娘 細 胞 か ら成 熟 娘 細 胞 へ の 成 長 率
rnd:娘 細 胞 の 出 芽 に よ る 増 殖 率
rm:出 芽 痕 保 有 細 胞 の 出 芽 に よ る増 殖 率
ま た 、 こ の モ デ ル で は 以 下 の 仮 定 を加 え た 。
・ 出芽痕保 有 細胞 の増殖 率 は、 出芽痕数
これ は Hartwellと
nに よ る違 い が な い も の と した 。
Unggerら の 幸艮告 と近 似 して い る。
・ 各 格 子 セ ル に は 1つ の 細 胞 しか 入 れ な い 。
・ 母 細 胞 の 消 滅 率 は 、 ml≦ m2≦
mnと
した 。
一 方 、 平 均 場 近 似 に お け る 数 値 計 算 と して 、 各 細 胞 の 密 度 の 時 間 変 化 を
微 分 方 程 式 で 示 す と 、 以 下 の よ うに な る 。
生=_威 +布′
Q。 +犠
塔4フ
傷
〆
λθ
争=ρ ―
%4ο ―
%4 おrノ =L2フ
争 =%″ 几―
サ
=布 に ο―られ
・
34
1
こ れ ら を 用 い て 、 各 細 胞 数 密 度 の 時 間 変 化 、 出 芽 痕 数 と細 胞 数 と の 関 係 を
調 べ 、 実 験 値 と比 較 した 。 ま た 、 シ ミ ュ レー シ ョ ン に お け る 初 期 密 度 の 設
定 は 、 一 度 定 常 状 態 に な っ た 各 細 胞 の 密 度 を 測 定 し、 そ の 時 の 密 度 組 成 を
初 期 状 態 の 比 率 と して 用 い た 。 さ ら に 、 細 胞 消 滅 は 以 下 の 条 件 を加 え た 。
出 芽 痕 が 6以 上 の 細 胞 が 消 滅 す る と 仮 定 した 条 件
ml=… ・=m5=0,m6=m7=… 。=mn=1
出 芽 痕 が 7以 上 の 細 胞 が 消 滅 す る と 仮 定 した 条 件
ml=… ・=m6=0,m7=m8=… 。=mn=1
8以 上 の 細 胞 が 消 滅 す る と仮 定 した 条 件
ml=… ・=m7=0,m8=m9=… ・=mn=1
出芽痕 が
細胞 数 密度 の時 間変化 を図
22に 示
した 。
0.1
細
°01
胞 ・
密
度 0.001
0.01
BY4741
S288C
″カゴσzl
0.001
sθ 力θ」
0.0001
0.000
0
10
20
30
40
培 養 時 間 (hr)
50
0
20
30
40
各 パ ラ メー タの数 値
各 パ ラ メー タの数 値
(g):0.7
(rmd=rm):o.3
増 殖 率 (密 度 効 果 後 rmd):0.0
密 度 効 果 発 生 時 間 :15
消 滅 率 (青 線 ):0.0
消 滅 率 (赤 線 ):1.0
消 滅 開 始 出 芽 痕 数 :6
(g):0.7
(rmd=rm):o.3
増 殖 率 (密 度 効 果 後 rmd):0.0
密 度 効 果 発 生 時 間 :25
消 滅 率 (青 線 ):0.0
消 滅 率 (赤 線 ):1.0
消 滅 開 始 出 芽 痕 数 :6
成長率
成長率
増殖率
図
10
22
増殖率
細胞数密 度 の時 間変化
数 理 解 析 に て 得 られ る 増 殖 曲 線 と 実 測 値 と の 比 較 を示 す 。
シ ミ ュ レー シ ョ ン は
100回 試 行
し 、 ア ン サ ン ブ ル 平 均 で 算 出 した 。 そ の
結 果 、 細 胞 密 度 の 時 間 変 化 は 、 い ず れ の 株 も シ ミ ュ レー シ ョ ン 結 果 と 実 験
結 果 と が 近 似 した 。 ま た 、 細 胞 消 滅 に お け る 細 胞 数 減 少 の 影 響 は 非 常 に 少
な く 、 総 細 胞 数 の 時 間 変 化 に ほ と ん ど 影 響 は 見 られ な か っ た 。 ち な み に 、
stageモ デ ル で は 密 度 効 果 を 計 算 式 に 付 加 して お り 、 そ の 結 果 と して 、
密 度 効 果 後 の 成 熟 娘 細 胞 の 出 生 率 は 0と な る 。 な お 、 シ ミ ュ レー シ ョ ン に
お け る 初 期 状 態 は 、 娘 細 胞 8に 対 し 母 細 胞 2の 割 合 で 検 証 した 。
Tree‐
35
次 に 、 上 記 の 微 分 方 程 式 を 用 い て 、 出 芽 痕 と細 胞 数 の 保 存 則 の 成 立 状 況
を シ ミ ュ レー シ ョ ン した 。 出 芽 痕 数 毎 の 細 胞 密 度 の 時 間 変 化 を 図
23に 示
した (打 点 が 実 測 値 、 実 線 が シ ミ ュ レー シ ョ ン 結 果 と な る )。
娘細胞
出 芽 痕 数 毎 の細 胞 密 度
I r szaac
■母 細 胞 、 出芽 痕
1
0母 細 胞 、 出 芽 痕
2
◆母 細 胞 、 出芽痕
3
母細胞 、出芽痕 4
●母 細 胞 、 出 芽 痕
5
母細胞 、出芽痕 6
-娘 糸田月包
― 母細胞 、出芽痕 1
‐
・母 細 胞 、 出 芽 痕 2
0
5
10
15
20
25
30
35
-母 細 胞 、 出 芽 痕
-母 細 胞 、 出 芽 痕
40
培 養 時 間 (hr)
図
23
出芽 痕 数 毎 の細 胞 数 密 度 の 時 間変化
3
4
… 母細胞 、出芽痕
5
-母 細 胞 、 出 芽 痕
6
数 理 解 析 に て 得 られ る 世 代 構 成 分 布 と実 測 値 と の 比 較 を 示 す 。
「
そ の 結 果 、 実 測 値 と シ ミ ュ レー シ ョ ン 結 果 と が 近 似 した 。 な お 、 シ ミ ュ
増 殖 率 :rmd=rm=0056、
レ ー シ ョ ン で は 、 成 長 率 :g=0.67、
Di=Dm=Ml=M2=0。 001を パ ラ メ ー タ と して 設 定
初期密 度
した 。 さ ら に 、実 験 に て 得
られ た 保 存 則 の 結 果 と 細 胞 消 滅 を 計 算 値 に 加 え た 結 果 と を 比 較 した 。 細 胞
消 滅 は 、 消 滅 開 始 の 出 芽 痕 数 の 違 い に よ る 変 化 を シ ミ ュ レー シ ョ ン し た 。
S288Cで の 結 果 を 図 24に 、 BY4741、
〃力″ ∠ 、 sθ 力θ∠ で の 結 果 を 図
25に
示 した 。
各 パ ラ メー タの数値
(g):0.7
(rmd=rm):o.3
増 殖 率 (密 度 効 果 後 rmd):0,0
密 度 効 果 発 生 時 間 :15
消 滅 率 (密 度 効 果 前 ):0.05
消 滅 率 (密 度 効 果 後 ):1.0
-出 芽 痕 5以 上 が 消 滅
成長率
増殖率
６ ４
保存則比
― 出 芽 痕 6以 上 が 消 滅
… 出 芽 痕 7以 上 が 消 滅
S288C
10
― 出 芽 痕 8以 上 が 消 滅
20
30
40
50
一 出 芽 痕 9以 上 が 消 滅
,一
培養時間
(hr)
24
出 芽 痕 10以 上 が 消 滅
細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョ ン .保 存 則 比 の 実 測 値 と 数 理 解
析 に よ る 細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョ ン 結 果 と の 比 較 を 示 す 。
図
36
各 パ ラメー タの数値
(g):0.7
(rmd=rm):o.3
増 殖 率 (密 度 効 果 後 rmd):0.0
密 度 効 果 発 生 時 間 :25
消 滅 率 (密 度 効 果 前 ):0.05
消 滅 率 (密 度 効 果 後 ):1.0
-出 芽 痕 5以 上 が 消 滅
成長率
0.8
増殖率
保 0.6
存
貝J
4
上ヒ0・
BY4741
0.2
,予
― 出 芽 痕 6以 上 が 消 滅
うゴσzl
出 芽 痕 7以 上 が 消 滅
sθ 力θ」
― 出 芽 痕 8以 上 が 消 滅
… 出 芽 痕 9以 上 が 消 滅
… 出 芽 痕 10以 上 が 消 滅
0
0
10
20
30
40
50
培 養 時 間 (hr)
図
25
細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョ ン
保 存 則 比 の 実 測 値 と 数 理 解 析 に よ る 細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョン
結 果 との 比 較 を 示 す 。
シ ミ ュ レー シ ョ ン は
100回 試 行
し 、 ア ン サ ン ブ ル 平 均 で 算 出 した 。 そ の
結 果 、い ず れ の株 にお い て も 出芽 痕 数
6以 上 の 細 胞 が 消 滅 す る と 仮 定
した
場 合 に 、 実 測 値 と シ ミ ュ レー シ ョ ン 結 果 が 近 似 した (図 26)。
1
0.8
６ ４ ２
保存則比
0
20
30
培養時間
図
26
50
0
10
(hr)
細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョ ン
保 存 則 比 の 実 測 値 と数 理 解 析 に よ る細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョン
結 果 で の 近 似 値 との 比 較 を 示 す 。
さ ら に 、 細 胞 が 消 滅 す る 頻 度 を 任 意 に 設 定 し 、 時 間 軸 に よ る シ ミ ュ レー
シ ョ ン を 行 っ た 。 設 定 は 、 密 度 効 果 が 現 れ る 前 は 、 消 滅 率 を 0.05∼
と し、 密 度 効 果 が 現 れ た 後 は 、 消 滅 率 を
は
100回 試 行
1。
0%と
1.0%
した 。 シ ミ ュ レー シ ョ ン
し 、 ア ン サ ン ブ ル 平 均 で 算 出 した 。
そ の 結 果 、 密 度 効 果 前 の 消 滅 率 を 変 化 させ て も 、 全 体 の 細 胞 の 消 滅 割 合
37
0.8%を 超 え る こ と は な か っ た 。 ま た 図 27お よ び 28の 結 果 は 、 密 度 効
果 前 の 消 滅 率 は 0.05の 時 に 最 も 実 験 結 果 に 近 い シ ミ ュ レー シ ョ ン が 得 ら
は
れ る こ と を 表 して い る 。 こ の 傾 向 は 、 S288Cお よ び
BY4741と
もに 同様 で
あ った。
細胞消滅率
各 パ ラ メー タの数 値
成長率
(g):0.7
％
増 殖 率 (rmd=rm):o.3
増 殖 率 (密 度 効 果 後 rmd):0.0
密 度 効 果 発 生 時 間 :15
消滅 開始 出芽痕数
0
10
20
培 養 時 間
図
30
40
50
(hr)
一
出 密 度 効 果 前 細 胞 消 滅 率 0.05%、
―
出 密 度 効 果 前 細 胞 消 滅 率 0.5%、
効果後
一
出 密 度 効 果 前 細 胞 消 滅 率 1.0%、
効果後
27
:6
1.0%
1.0%
1.0%
効果後
細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョ ン
数 理 解 析 に よ る細 胞 消 滅 頻 度 の 予 測 を示 す 。
0。
8
BY4741
０
０
％
６ ４ ２
０
細胞消滅率
各 パ ラ メー タの数 値
(g):0.7
(rmd=rm):o.3
増 殖 率 (密 度 効 果 後 rmd):0.0
密 度 効 果 発 生 時 間 :25
消 滅 開 始 出 芽 痕 数 :6
成長率
増殖率
0
10
20
培 養 時 間
図
28
30
40
50
(hr)
一
出 密 度 効 果 前 細 胞 消 滅 率 0.05%、
―
出 密 度 効 果 前 細 胞 消 滅 率 0.5%、
効果後
―
出 密 度 効 果 前 細 胞 消 滅 率 1.0%、
効果後
1.0%
1.0%
1.0%
効果後
細 胞 消 滅 予 測 シ ミ ュ レー シ ョ ン
数 理 解 析 に よ る細 胞 消 滅 頻 度 の 予 測 を示 す 。
38
これ を 、 細 胞 数 密 度 の 時 間 変 化 、 い わ ゆ る細 胞 増 殖 曲線 と、 保 存 則 の 保
存 状 況 を 時 間 軸 に て 表 し 、 細 胞 消 滅 予 測 を シ ミ ュ レー シ ョ ン し 、 実 測 値 と
シ ミ ュ レー シ ョ ン 結 果 と が 一 致 した 曲 線 と を 重 ね る と 図
29の
よ うに な る 。
そ の 結 果 、 対 数 増 殖 後 期 に 一 過 性 に 細 胞 消 滅 が 発 生 す る こ とが 分 か る。
ま た 、 一 過 性 の 細 胞 消 滅 の 後 に 保 存 則 の 低 下 が 認 め られ 、 保 存 則 比 に 細 胞
消 滅 が 影 響 し て い る こ と が 分 か る 。 こ の 傾 向 は 、 S288Cお よ び
BY4741と
もに 同様 で あ っ た。
S288C
BY4741
細胞密度
0.01
0.01
0.001
0.001
0.0001
0.0001
0
1
0.8
0.8
６
0.6
４
0.4
保存則比
1
２
0.2
0
0
0.8
0.8
％
６ ４ ２
細胞消滅率
0.6
―
0.4
0.2
20
培養時間
図
29
0
30
(hr)
細 胞 密 度 、保 存 則 比 、 細 胞 消滅 率 の比 較
S288C,BY4741と
も に 、 対 数 増 殖 後 期 か ら保 存 則 比 が 減 少 す る 。
ま た 、対 数 増 殖 後 期 に 一 過 性 の 細 胞 消 滅 が 発 生 す る 。赤 線 は 変 曲 点 、
す な わ ち 個 体 数 が 最 終 平 衡 状 態 の 半 分 (密 度 が 1/2)に な る 時 間 を
示す。
39
6
考察
本 研 究 は 、 これ ま で に 報 告 され て き た 世 代 構 成 に 対 す る数 理 解 析 結 果 と
実 験 に よ る実 測 値 との 比 較 結 果 を参 考 に して 、 出芽 痕 数 計 測 の 精 度 を高 め
る こ とに よ り、よ り詳 細 な検 討 をカロえ る こ とを 目的 に実 施 した 。実 験 で は 、
出芽 酵 母 の 、増 殖 過 程 にお け る濁 度 お よび 細 胞 数 を基 と した 増 殖 挙 動 の 確
認 お よび 娘 細 胞 と 出芽 回数 を加 味 した母 細 胞 の 分 布 に よ る ス テ ー ジ 構 成
の 変 動 に つ い て 検 討 を加 えた 。
(1)娘 細 胞 の 増 加
そ の 結 果 、野 生 株
S288Cに お い て 、対 数 増 殖 期 以 降 に 連 続 的 に娘 細 胞 の
増 加 と母 細 胞 の 減 少 が 認 め られ た 。 この 傾 向 は 、既 に報 告 され た も の と一
致 して い た 。 ま た 、S288Cの 栄 養 要 求 性 株 BY4741に お い て も同様 な傾 向
が 認 め られ 、栄 養 要 求 性 に よ り細 胞 の 成 長 速 度 に影 響 す る も の の 、 ス テ ー
ジ 構 成 に は 顕 著 な 影 響 を 及 ぼ さな い こ とを意 味 す る。
さ らに 、細 胞 周 期 に 関す る遺 伝 子 を欠 損 した %″ σ∠、 sο 力θ∠ に お い て
も同様 な傾 向 が 認 め られ た 。 %″ σ∠は
G1/S進 行 が 野 生 株 に比 較 し早 め に
促 進 され 、出芽 の タイ ミ ン グが 早 ま る。 %″ σ∠で は 、出芽 細 胞 の 出現 率 が
最 も高 か つ た に も か か わ らず 、 細 胞 の 増 殖 に 伴 う娘 細 胞 の 増 加 に 関 して 、
同 じよ うな傾 向 が 認 め られ た こ とは 、 出芽 の タイ ミ ン グが 異 な っ て も ス テ
ー ジ構 成 に は顕 著 な影 響 を及 ぼ さな い こ とを意 味す る 。ま た 、TORの 下 流
で 働 くプ ロ テ イ ン キナ ー ゼ 遺 伝 子 を欠 損 して い る sあ θ∠株 に お い て も同
様 な傾 向 を示 した こ とは 、TORシ グナ ル 伝 達 経 路 が ス テ ー ジ 構 成 に深 く関
与 して い る 訳 で は な い こ とを示 唆 して い る。
調 べ た 複 数 の 変 異 株 か ら得 られ た知 見 は 、環 境 の 変 化 (外 部 影 響 )に よ
り細 胞 はそ れ に応 答 した 世 代 構 成 を取 り得 るが 、多 少 の 遺 伝 型 (内 部 影 響 )
の 変 化 が あ つ て も、 そ れ に 対 応 で き る 柔 軟 性 を持 つ こ とを示 して い る。 な
お 、娘 細 胞 の 出芽 は 抑 制 され るが 、母 細 胞 の 出芽 が 抑 制 され な い こ とか ら
多 産 化 傾 向 が 認 め られ 、 そ の 結 果 と して 二 極 化 現 象 (セ パ レー シ ョン)が
発 生 す る こ とは 、 これ ま で に 報 告 が な され て い な い 。 本 研 究 にお い て 詳 細
な 分 布 確 認 を行 つ た 成 果 と判 断 した 。
環 境 の 悪 化 (密 度 効 果 )が 高 ま る に つ れ 、娘 細 胞 の 出芽 の み 抑 制 され た
結 果 と して 、少 子 化 パ ラ ドッ ク ス 、す な わ ち集 団 全 体 の 増 殖 率 が 低 下 す る
環 境 に お い て 、子 供 の 比 率 が 増 え る とい う逆 理 が 発 生 した 。 そ の 機 構 は 未
だ不 明 で あ るが 、 この 生 物 学 的 理 由 は な ん で あ ろ うか 。 出芽 分 裂 に よ つ て
新 た に生 じた 娘 細 胞 が 母 に な り、 出芽 す るた め に は 、 細 胞 の 成 長 (細 胞 体
40
積 の 増 加 )が 必 要 とな る の に 対 して 、 母 細 胞 は す で に大 き くな つ て い るた
め 、分 裂 後 す ぐに ま た 出芽 して 娘 細 胞 を作 る こ とが で き る。 そ の た め 、 対
数 増 殖 後 期 に な り、炭 素 源 が や や 涸 渇 して それ ま で の 発 酵 か ら呼 吸 に シ フ
ト (diauxic shift)す る時 期 に 、 細 胞 数 を少 な い 栄 養 源 で 増 す た め に は 、
母 細 胞 に細 胞 分 裂 を させ た 方 が 利 に 叶 つ て い る。 そ れ に加 えて 、 娘 細 胞 は
ス トレス に 対 し死 に 易 い (第 二 章 参 照 )事 か ら考 え る と、 ス トレス に 対 し
て の 適 応 も ま だ 備 わ つ て お らず 、 そ の 点 にお い て も細 胞 分 裂 を行 うの に 適
して い な い の か も しれ な い 。
(2)娘 細 胞 の 小 型 化
一 方 、 対 数 増 殖 期 以 降 の 増 殖 率 の 低 下 に 伴 い 、娘 細 胞 の 小 型 化 お よび 出
芽 制 限 が 認 め られ た こ とは 、Hartwellら 、Carterら 、Whealsら の 報 告 と
同様 で あ つ た 。増 殖 時 に G1/S進 行 が 遅 れ た 場 合 に は 、Gl期 が 長 引 くた め
細 胞 は 大 き くな る。 しか し、小 型 化 が 同 時 に観 察 され た とい うこ とは 、Gl
初 期 で 細 胞 周 期 が 停 止 して い る こ とを示 唆 して い る。 これ は 、栄 養 源 が 不
足 して 定 常 期 に入 る と一 般 的 に 認 め られ る細 胞 の 応 答 と一 致 して い る。
(3)保 存 則 の破 綻 と酵 母 の 生 態 的 寿 命
ま た 、 総 出芽 痕 数 と総 細 胞 数 に よ る実 測 値 は 、保 存 則 か ら の 乖 離 が 対 数
増 殖 後 期 で 大 き くな つ た 。 保 存 則 比 が 低 下 す る こ とは 、 出 芽 痕 総 数 が 総 細
胞 数 よ り少 な くな る こ とを意 味 す るが 、 この 原 因 と して 出芽 痕 を多 く保 有
す る母 細 胞 の 消 滅 を想 定 した 。 数 理 モ デ ル に細 胞 消 滅 要 素 を加 え た と こ ろ 、
理 論 値 と実 測 値 との双 方 にお い て 近 似 が 認 め られ た 。 ま た 、 この 結 果 に基
づ き、 さ らに詳 細 な実 験 標 本 に よ る画 像 解 析 を行 つ た 結 果 、 ほ ぼ 同 時期 に
死 細 胞 が 多 数 観 察 され た 。 この こ とは 、 老 化 の 進 ん だ 細 胞 が 対 数 増 殖 後 期
で選 択 的 に死 ん で い る こ とを示 唆 す る。
出芽 酵 母 は 、母 細 胞 か ら娘 細 胞 を 出芽 す る こ とで 子 孫 を 増 や す 増 殖 形 態
を示 して い る。 出芽 酵 母 は不 均 等 分 裂 で あ り、 老 化 の 原 因 と され る extra―
chromosomal DNA circle(ERC)(Sinclair θι′■,1997)は 分 裂 に 際 し母
細 胞 に の み 残 され る。ま た 、老 化 に は rDNAの 不 安 定 化 も関 与 して い るが 、
母 細 胞 の rDNAは 出芽 の 度 に不 安 定 化 して い く も の の 、娘 細 胞 で は rDNA
が 安 定 化 して い る (Austen θι′′
.,2009)。 出芽 回数 (分 裂 寿 命 )に は ヒス
トン脱 ア セ チ ル 化 酵 素 Sir2遺 伝 子 が 関 与 して お り、 この Sir2は 栄 養 が 少
な い 状 態 にお い て 母 細 胞 の 寿 命 を延 期 させ る機 能 を も つ て い る (Lin θ ′
,
`′
この Sir2の 分 裂 寿 命 制 御 に は 、 少 な く と も ERC量 の 制 御 を介 す
るが 、 ERCが 検 出 され な い 哺 乳 類 細 胞 で も同様 に Sir2に よ る寿 命 制 御 が
2002)。
41
存 在 す るた め 、共 通 した 別 径 路 を介 す る制 御 も存 在 す る と考 え られ て い る。
一 般 的 に 、母 細 胞 は約 10回 の 出産 を繰 り返 す こ とで 老 化 が 顕 著 とな り、
分 裂 周 期 の 遅 延 や 細 胞 の 肥 大 化 が 起 こ り、 さ らに約 10回 程 度 の 出芽 を し
た 後 に 死 滅 す る と言 わ れ て い る (Mortimer θ′′′,1959)。 ま た 、本 研 究 で
用 い た BY4741の 場 合 、マ イ ク ロマ ニ ュ ピュ レー タ ー を用 い た 同 一 母 細 胞
に よ る 分 裂 寿 命 を確 認 す る と、 母 細 胞 の 平 均 出産 回数 は
25回 で あ り、 10
回 以 内 に死 ん で しま う (出 芽 しな くな る )細 胞 は 10%に も満 た な い こ とが
報 告 され て い る (Kaeberlein θι2′ .,2005)。 これ を数 理 モ デ ル に 取 り込 ん
だ 場 合 、少 な く と も出芽 痕 が 10以 上 の も の は 13個 (平 均 倍 加 時 間 を 3時
間 、 12回 出芽 を想 定 した 値 )、 6か ら 9の も の は 189個 (同 上 )検 出 され
て しか る べ き で あ る。 しか しな が ら、今 回 の 実 験 に お い て は 、 12,908の 細
胞 を観 察 した も の の 、出芽 痕 が 10以 上 の も の は 6(理 論 値 に 対 して 46%)、
6か ら 9の も の が 106(理 論 値 に対 して 56%)と 、計 算 値 と比 較 して 少 な
い 数 とな っ て い る。 そ の 原 因 を 、 実 測 値 を基 と した 数 理 解 析 シ ミ ュ レー シ
ョン に て 検 討 した 結 果 、 よ り早 い 段 階 で母 細 胞 の 消滅 、特 に 出芽 痕 数 が 多
い 母 細 胞 の 消 滅 が 発 生 して い る こ とが 示 唆 され た 。
興 味深 い こ とに 、娘 細 胞 へ の 影 響 、 母 細 胞 へ の 影 響 が 、 一 般 に言 わ れ る
密 度 効 果 が 現 れ て い な い 対 数 増 殖 期 時 点 に お い て 、既 に そ の 傾 向 が 始 ま っ
て い る点 に あ る。 密 度 効 果 に つ い て は 、 そ の 原 因 と して 、 栄養 飢 餓 に よ る
も の 、 増 殖 に 伴 い 発 生 す るオ キザ ロ酢 酸 が
C02を 増 加 させ 、 これ に よ り
pHが 酸 性 側 に 変 化 す る こ とで発 生 す る増 殖 抑 制 に よ る も の (Hayashi
θ′
′■,1998)、 容 量 的 フ ァ ク タ ー に よ る も の 、 な ど様 々 な 原 因 が 報 告 され て
い る が 、い ず れ も密 度 効 果 が 発 生 す る環 境 に起 因 して い る。 しか しな が ら、
今 回 の 結 果 は 、 そ れ よ りも 早 い 段 階 で 準 備 が 始 ま っ て い る こ とが 確 認 され
た 。 こ の よ うな こ とを起 こ させ る原 因 に 関す る 検 討 結 果 を 第 二 章 に て 記 述
す る。
０ん
′仕
第 二章
出 芽 酵 母 の ス トレス 応 答 に よ る
増 殖 へ の影 響 お よび細 胞 死
43
1
要旨
第 二 章 で は 、対 数 増 殖 期 以 降 に何 らか の ス トレス が 発 生 し、 そ れ に よ り
娘 細 胞 の 出芽 が 抑 制 され る こ と、対 数 増 殖 後 期 に ス テ ー ジ の 進 ん だ母 細 胞
の 細 胞 死 が もた ら され る こ と を示 した 。 本 章 で は 、 ス トレス の 一 因 と想 定
され る栄 養 源 飢 餓 、活 性 酸 素 、 そ の 他 の 影 響 に つ い て 検 証 を加 え 、 さ らに
定 常 期 で の 世 代 構 成 と細 胞 死 に つ い て も、 老 化 、寿 命 等 に 関連 す る遺 伝 子
に変 異 を持 つ 変 異 株 を用 い て 調 べ た 。 加 え て 、 出芽 お よび 細 胞 死 に 影 響 を
も た らす 物 質 の 特 定 も試 み た 。
そ の 結 果 、栄 養 源 飢 餓 に 対 す る検 討 で は 、 対 数 増 殖 期 の グル コー ス の 濃
度 に 依 存 した 増 殖 阻 害 物 質 が 発 生 して い る こ とが示 唆 され た 。 活 性 酸 素 に
対 す る検 討 で は 、 活 性 酸 素 の 除 去 に 関 与 す る SOD遺 伝 子 を欠 損 した βο′ゴ
∠ (細 胞 質 局在 型 )お よび sα″ ∠ (ミ トコ ン ドリア 局 在 型 )に お い て 、 い
ず れ も増 殖 の 抑 制 が 観 察 され た 。ま た 、そ の 増 殖 抑 制 は sο ごゴ∠に お い て ア
ス コル ビン 酸 を加 え る こ とで 緩 和 され た 。 この こ とは 、 少 な く とも増 殖 過
程 で 発 生 す る活 性 酸 素 が 細 胞 の 増 殖 抑 制 に 関 与 して い る こ とを示 す 。 さ ら
に 、細 胞 壁 の 安 定 性 に 関 与 す る MPK■ 遺 伝 子 を欠 損 した ″′上ゴ∠で は 、対
数 増 殖 後 期 に お い て ア ポ トー シ ス が 誘 導 され て い た 。 分 裂 寿 命 が 延 び る欠
損 株 ん″ ∠ (rDNA領 域 の 組 換 え 抑 制 )と βル′Z、 さ らに 、 ア ポ トー シ ス
に 関 与 す る caspaseを 欠 損 した
yι ′
′∠で は 、い ず れ の 株
にお い て も経 時 的
寿 命 が 短 くな つ た 。 さ らに 、 セ プ チ ンカ ラ ー に異 常 を持 ち 、 娘 細 胞 の 老 化
が もた ら され る ろ″ごδZに お い て は 、 定 常 期 の ア ポ トー シ ス が 増 加 した 。
一 方 、 出芽 お よび 細 胞 死 に影 響 を もた らす 物 質 の 特 定 に 関 して は 、 酵 母
細 胞 に は 存 在 せ ず 、培 養 液 中 に あ る こ と、 ま た ヘ キ サ ン 、酢 酸 エ チ ル に て
抽 出 した 水 層 お よび 透 析 後 に 得 られ た 分 子 量 3500以 下 の 画 分 に活 性 が あ
り、原 因 物 質 の 存 在 が示 唆 され た 。た だ し、物 質 の 特 定 に は 至 っ て い な い 。
44
2
序論
第 二 章 に て 、 出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動 を 、実 験 と数 理 解 析
に て 検 討 を加 え た 。そ の 結 果 、増 殖 に伴 い 娘 細 胞 の比 率 が 増 加 す る こ と (少
子 化 パ ラ ドッ ク ス )お よび 娘 細 胞 の 出芽 が 抑 制 され 母 細 胞 の 出芽 が 抑 制 さ
れ な い こ とか ら起 こ る 二 極 化 現 象 (セ パ レー シ ョン )を 実 験 に て 認 め た 。
さ らに 、対 数 増 殖 後 期 に 一 過 性 の 細 胞 消滅 が 発 生 す る こ と (選 択 的 細 胞 死 )
を実 験 とそ の 数 理 解 析 に よ り認 め た 。 しか し、 そ の 原 因 、機 構 に 関 して は
不 明 で あ る。
生 物 は 、細 胞 、組 織 、個 体 の レベ ル で 様 々 な刺 激 や ス トレス の 影 響 を受
け て い る。 外 部 か らの ス トレス と して は 、 温 度 、 湿 度 、 光 (紫 外 線 な ど の
特 定 波 長 に よ る影 響 を 含 む )、 放 射 線 、 栄 養 素 の 存 在 比 率 、 化 学 物 質 等 が
あ り、 内部 か らは 、 酸 化 的 ダ メ ー ジ や DNAダ メ ー ジ 等 が あ る。 しか しな
が ら、 両 ス トレス は あ る局 面 に お い て は分 ち難 い 。 例 え ば 、放 射 線 に よ る
ス トレス は 、細 胞 外 部 に ダ メ ー ジ を与 え るだ けで は な く、細 胞 内 部 の DNA
の 化 学 修 飾 お よび 切 断 を 引 き起 こす 。 一 般 に生 物 は 、 これ ら の ス ト レス に
適 応 す るた め の メ カ ニ ズ ム を保 持 して い る 。
第 二 章 に て 記 述 した 生 物 反 応 も、増 殖 に 伴 い 発 生 す る上 記 の 外 部 お よび
内部 ス トレス に よ る環 境 応 答 と考 え られ る。 出芽 酵 母 が 液 体 培 地 中 に て 増
殖 して い く過 程 で は 、栄 養 源 、代 謝 に よ り発 生 す る老 廃 物 (エ タ ノ ー ル 等 )、
pHの 変 化 、 浸 透 圧 ス トレス 等 が 環 境 制 限 要 因 と して 考 え られ る。 これ ら
の 環 境 制 限 要 因 に つ い て は い くつ か の 報 告 が あ り、 例 え ば 、鎌 田 らは窒 素
源 飢 餓 に よ リオ ー トフ ァ ジ ー が 誘 発 され る こ とを 報 告 して い る (Kamada
θι′ヱ,2004)。 広 島 大 学 の 林 らは密 度 効 果 が 認 め られ る段 階 にお い て オ キ
ザ ロ酢 酸 が 生 成 され 、 C02が 増 力日し pHが 酸 性 に な る こ とで 増 殖 が 抑 制 さ
れ る と報 告 して い る (Hayashi θ ′,1998)。 北 垣 は エ タ ノ ー ル に よ つ て
`′
ミ トコ ン ドリア が 分 裂 し、 ア ポ トー シ ス が 起 こ る こ とを 報 告 して い る
(Kitagaki θι′■,2009)。 上 園 らは 浸 透 圧 ス トレス に よ り翻 訳 開始 の 制 御
機 構 に 影 響 が 出 る こ とを 報 告 して い る (Uesono θι′■,2002)。
期 培 養 が 続 く と酵 母 は徐 々 に死 滅 して ゆ く。
さ らに 、長
一 方 、 単 細 胞 で あ る酵 母 に も高 等 動 物 に 存 在 す る よ うな ア ポ トー シ ス 機
構 が あ る。 さ らに酵 母 の ア ポ トー シ ス を実 行 す るた め の 径 路 も動 物 細 胞 と
類 似 して い る (Madeo θ′′■,2009、 Carmona― Gutierrez α ′■,2010)。
酵 母 の ア ポ トー シ ス も、caspase、 cytochrome c、 AIF(apoptosis― inducing
factOr)、
AⅣ IID (apoptosis― inducing factOr(AIF)‐ like mitOchondrion
associated inducer of death)、
EndoGヌ ク レア ー ゼ が 関 与 す る。
45
これ らの 事 実 は 、 ア ポ トー シ ス とい うシ ス テ ム が 、進 化 の 過 程 で 単 細 胞
生 物 に お い て 既 に 獲 得 され て い た こ とを示 す 。 定 常期 にお け る酵 母 の 細 胞
死 も ア ポ トー シ ス で あ る (Fabrizio θ ム,2008)。 つ ま り、 経 時 的 寿 命 は
`′
ア ポ トー シ ス に よ り制 御 され て い る 。
これ ら の こ とを視 野 に入 れ 、本 章 で は 、 少 子 化 パ ラ ドック ス 、 セ パ レー
シ ョン 、細 胞 死 を発 生 させ る原 因 を探 るた め に 、栄 養 源 飢 餓 に よ る影 響 (第
一 節 )、 活 性 酸 素 に よ る影 響 (第 二 節 )、 老 化 ・ 寿 命 等 に 関連 す る遺 伝 子 を
欠 損 させ た 株 を用 い た 、 そ の 他 に よ る影 響 (第 二 節 )、 物 質 の 特 定 (第 四
節 )を 検 討 した 。 そ の 過 程 で 、長 期 定 常期 培 養 にお い て 、分 裂 寿 命 の 進 ん
だ細 胞 が 優 先 的 に ア ポ トー シ ス を起 こす こ とを 見 出 した 。 これ ら の 結 果 と
ア ポ トー シ ス の 生 物 学 的 意 義 に つ い て 考 察 す る。
46
第 一節
1
栄 養 源 飢 餓 に よ る影 響
は じめ に
真 核 生 物 の 細 胞 の 増 殖 は 、細 胞 周 期 (基 本 的 に Gl期 → S期 → G2期 → M
期 )の 各 段 階 が (」 orgensen θι′ム,2004)正 し く進 行 す る こ とで 正 確 に な
され る。 そ の 細 胞 周 期 は チ ェ ック ポ イ ン トに よ つ て 制 御 され て い る (Lew
θォ′■,1995、 Elledge 1996、 Muhual)。 例 え ば 、G1/Sチ ェ ック ポ イ ン ト、
G2/Mチ ェ ック ポ イ ン ト、微 小 管 重 合 チ ェ ック ポ イ ン ト等 が 存 在 す る。 こ
れ らの シ ス テ ム は 、酵 母 か ら ヒ トま で 保 存 され て い る。
G1/S進 行 は細 胞 に と つ て 増 殖 を 開始 す る重 要 な 時期 で あ る。出芽 酵 母 の
G1/S進 行 の 推 進 を担 つ て い る転 写 因 子 が Swi4‐ Swi6複 合 体 か
らな る SBF(SCB Binding Factor)と Mbpl― Swi6か ら MBF(MCB Binding
Factor)で あ る。 SBFと MBFは そ れ ぞれ SCB(Swi4‐ Swi6 cell cycle
box, "CACGAAA")と MCB(Mlu l cell cycle box, "ACGCGTNA")と 呼
場 合 、 この
ば れ る プ ロモ ー タ ー の
DNA配
列 に 結 合 しそ の 遺 伝 子 の 転 写 を促 進 す る
主 に 出芽 に 関 わ る CInl,2な ど の 遺 伝 子 発
(Dirick θι′ム,1992)。 SBFは
現 を促 進 し、 一 方 、 MCBは 主 に DNA合 成 や 修 復 に 関 わ る Clb5,6な どの
遺 伝 子 の 発 現 を促 進 す る。 そ の 後 、 SBFに よ つ て 転 写 され た Clnl,2は
Whi5と Clb/CDK阻 害 因 子 Sic lを リ ン酸 化 し抑 制 す る こ とで 、さ らに G1/S
期 の 進 行 を促 進 させ て い る (Dirick θι′′,1995、 Skotheim θι′■,2008)。
G1/S進 行 は 増 殖 細 胞 にお け る細 胞 体 積 に 影 響 す る。細 胞 成 長 は Gl期 に
お い て 起 こ り、 あ る 一 定 の 閾 値 に 達 しな い と G1/S進 行 は 起 こ ら な い
(FOster θι′■,2010)。 これ が Glノ Sチ ェ ッ ク ポ イ ン トで あ る。 つ ま り、
G1/S進 行 が 早 まれ ば細 胞 は小 さ くな り、遅 れ れ ば大 き くな る。細 胞 サ イ ズ
を どの よ うに細 胞 が 判 断 して い るか の 詳 細 は 哺 乳 類 細 胞 で は 不 明 だ が 、酵
母 の 場 合 に は以 下 の よ うな機 構 が 存 在 す る。 Gl前 期 に は SBFと MBFは
Whi5に
.,2004)。
よ つ て 機 能 が 阻 害 され て い る (CostanzO θι′′
転 写 因 子 Mcmlが M/Gl期 に Glサ イ ク リ ン CIn3の 転 写 を行 う(Mclnerny
θι′■,1997)。 細 胞 が あ る程 度 大 き くな るま で は Cln3は 小 胞 体 に 蓄 積 し続
け るが 、 閾値 に達 す る と細 胞 質 へ 放 出 され る (Verges θ ■,2007)。 この
阻害 因子
複 合 体 を形 成 し、 SBFと MBFの 阻 害 因 子
リ ン 酸 化 し核 外 に放 出 し分 解 を促 進 す る 。これ に よ り SBFと MBF
の 抑 制 が 解 除 され る (de Bruin θι′工,2004)。 Nmb欠 損 株 で は 時 期 尚早
CIn3は
Whi5を
CDKで あ る Cdc28と
`′
G1/S進 行 が 起 こ り、細 胞 は小 さ くな る (」 orgensen θル ′.,2002)。 さ ら
に 、 栄 養 シ グナ ル も G1/Sチ ェ ック ポ イ ン トを活 性 化 す るた め 、 栄 養 が 不
な
47
足 して い る状 況 下 で は
G1/S進 行 が 抑 制 され る (Foster
θ′′ヱ,2010)。 窒
素 源 も し くは炭 素 源 等 の 欠 乏 は 細 胞 の Gl期 にお け る細 胞 成 長 と と もに 、
G1/S進 行 の 抑 制 に よ る細 胞 増 殖 を 抑 制 す る。 TOR(target of rapamycin)
キナ ー ゼ は 、栄 養 シ グナ ル に応 答 し細 胞 の 成 長 と分 裂 を制 御 す る 中 心 的 な
タ ンパ ク 質 で あ る (Foster θ′′′,2010)。 栄 養 源 が 涸 渇 す る と、TORが 不
活 性 化 し、Glノ S進 行 が 抑 制 され 細 胞 は
Gl期 に 蓄積 す る 。 一 方 、栄 養 源 が
低 下 した 場 合 に は 、 Gl期 に細 胞 の 大 き さが 十 分 に大 き くな る こ とを 待 た
.,2004)。 こ
ず に G1/S進 行 が 起 こ り、細 胞 は 小 型 化 す る (」 orgensen θ′′′
の 応 答 に は TOR、 RAS/PKAお よび TOR下 流 の プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ Sch9
が 関 与 して い る
(」
orgensen θι′′。
,2004)。 θCH9を 欠 損 した 細 胞 で は 、
Gl期 で 細 胞 の 大 き さが 十 分 に大 き くな らず に S期 に進 行 す るた め 、 細 胞
の 大 き さが 小 さ くな る。
そ れ に加 え て 、 栄 養 源 飢 餓 は
TORを 介 して 飢 餓 と対 抗 す るた め の 様 々
な細 胞 内 で の 応 答 を誘 導 す る。 以 前 か ら、 出芽 酵 母 、 分 裂 酵 母 で は 栄 養 源
飢 餓 時 に 、 RNAや タ ン パ ク質 の 分 解 を促 進 す る こ とが 知 られ て い た
(Tsuboi θ′′ム,1975,1976、 Tsuboi θ ス,1978、 NIcFarlane,1980、 Swida
`′
θみ′ノ,1981、 Ryk θ ′,1985)。 窒 素 源 飢 餓 に 対 して は 、 自 ら窒 素 源 を供
`′
給 す るた め の 液 胞 (リ ソ ソー ム )内 で の RNA、 タ ンパ ク 質 、 ミ トコ ン ドリ
ア を 含 む 細 胞 内容 物 の 大 規 模 分 解 、 い わ ゆ るオ ー トフ ァ ジ ー (自 食 作 用 )
が 誘 導 され る 。 オ ー トフ ァ ジ ー は 多 くの Иrθ 遺 伝 子 群 に よ り実 行 され る
(Suzuki θι2■ ,2007)。 栄 養 源 飢 餓 に よ るオ ー トフ ァ ジ ー の 誘 導 制 御 に は
関 与 して お り、 TORの 特 異 的 阻 害 剤 で あ る ラパ マ イ シ ン は オ ー ト
フ ァ ジ ー を 誘 導 す る (Bjedov θ ′,2010))。 栄 養 が 豊 富 な 状 態 で は 、TOR
TORが
`′
は Atg13を 直 接 リ ン 酸 化 す る こ とで オ ー トフ ァ ジ ー を 抑 制 して い る が 、栄
養 源 飢 餓 時 に は TORが 不 活 性 化 す る こ とに よ り Atg13が 脱 リ ン 酸 化 され 、
これ が 引 き金 とな リオ ー トフ ァ ジ ー が 誘 導 され る (Kamada θル ′
.,2010)。
一 方 、炭 素源 飢 餓 に 対 して は 、糖 新 生 お よび 炭 素 源 の 貯 蔵 形 態 で あ る グ リ
コ ー ゲ ン の 蓄積 が 誘 導 され る (Slone θι′■,1959)。
前 述 の よ うに (第 二 章 参 照 )、 対 数 増 殖 後 期 に な る と、 炭 素 源 が 涸 渇 し
て き て 、 それ ま で の 発 酵 に 頼 っ て い た ATP産 生 か ら呼 吸 に よ る ATP産 生
ヘ シ フ ト (diauxic shift)す る (主 に グル コ ー ス を用 い て の 研 究 に よ る )。
つ ま り、 この 時 期 に は主 に 炭 素 源 の 欠 乏 が 起 こ る。 こ の 炭 素 源 欠 乏 が 、 こ
の 時 期 に起 こ る娘 細 胞 の 割 合 の 増 加 と一 過 的 な細 胞 死 の 原 因 に な つ て い
る の か 不 明 で あ る 。 一 方 、 グル コー ス 培 地 で 培 養 され た 酵 母 が 対 数 増 殖 期
後 期 に な る と、 グル コ ー ス の 低 下 と と も に 、培 地 中 に は発 酵 で 生 じた アル
48
コ ー ル が 増 加 す る。 この アル コー ル の 増 加 も増 殖 に 阻 害 的 に働 く と考 え ら
れ るが 、 しか し、 そ の 寄 与 の 程 度 は 明 らか で は な い 。
本 節 に お い て は 、炭 素 源 涸 渇 とア ル コー ル の 増 加 に 着 日 し、酵 母 の 対 数
増 殖 期 に 対 す る 両者 の 影 響 を 検 討 した 。
49
2 材 料 お よび 方 法
(1)使 用 株
1:出 芽 酵 母 は W303由 来 の US356(b″ 」Z)を 用 い た 。 US356
実験
の
Genotypeお よび 遺 伝 子 の 機 能 を表 7お よび 表 8に 示 した 。
実験
2:同 上
実験
3:BY4741を 用 い た 。 BY4741の Genotypeお
を表
よび 遺 伝 子 の 機 能
7お よび 表 8に 示 した 。
(2)使 用 培 地
実 験 1 :YPA溶 液 (1,000 mL当 り Yeast extract 5 g、 Peptone 10 g、
ア デ ニ ン 50 mg)に グル コ ー ス (終 濃 度 は 1,2,4%)を カロえた 。
実験
2:SC合
実験
3:同 上
組 成 は 第 二 章 3(2)を 参 照 〕。 た だ し、 グ
成 培 地 を用 い た 〔
ル コー ス の 終 濃 度 は 1,2,4%と し、 そ れ ぞ れ の 培 養 液 を設 け た 。
(3)培 養 条 件
実 験 1:100 mL用 の 三 角 フ ラ ス コ に 10 mLの YPA培 地
(グ ル コー ス
1,2,4%)を 加 え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。 播 種 酵
母 は 、 前 培 養 (約 24時 間 )し た 酵 母 を濁 度 (OD600)0.1に 調 整 し培
終濃 度
養 液 に加 え た 。
実 験 2:100 mL用 の 三 角 フ ラ ス コ に 10 mLの SC合 成 培 地 (グ ル コ ー
ス 終 濃 度 1,2,4%)を 加 え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。 播 種
酵 母 は 、前 培 養 (約 24時 間 )し た 酵 母 を濁 度 (OD600)0.1に 調 整 し
培 養 液 に加 えた 。 そ の 後 、20
3 mL加
mL用
の 試 験 管 に 後 述 す る① か ら⑥ 液 を
え 、 30℃ の 恒 温 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。
実 験 3:300 mL用 の 三 角 フ ラ ス コ に 60 mLの SC合 成 培 地 (グ ル コ ー
ス 終 濃 度 1,2,4%)を 加 え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。 播 種
酵 母 は 、前 々 培 養 (約 24時 間 )お よび 前培 養 (約 24時 間 )し た酵 母
(OD600)0.1に 調 整 し培 養 液 にカロえた 。 そ の 後 、 200 mL用 の
三 角 フ ラ ス コ に 後 述 す る i)i)面 )に て 調 整 した 培 養 液 を 20 mL加
を濁 度
え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。
50
(4)方 法
実 験 1:濁 度 の 測 定 は 、 酵 母 を 増 殖 培 地 に加 え て か ら 30時 間後 ま で 2
48時 間値 を加 え た 。 増 殖 の 定 常化 が 確 認 さ
れ た 段 階 (培 養 26時 間 後 )で 、 20%グ ル コ ー ス を lmL(終 濃 度 2%
時 間 お き に行 い 、 これ に
相 当 )加 え 、 そ の 後 の 挙 動 を確 認 した 。 ま た 、 これ とは別 に 、培 養
8,
24,72時 間後 に濁 度 を確 認 す る系 を設 け た 。
実験
2:濁 度 の 測 定 は 、酵 母 を 増 殖 培 地 に加 え て か ら定 常 期 とな り、 以
下 の 処 理 を加 えて か ら 、12時 間 後 ま で は
24,36,48時
2時 間 お き に 測 定 し、これ に
間値 を加 えた 。
i)酵 母 を SC合 成 培 地
(グ ル コ ー ス 終 濃 度
1,2,4%)10 mLに
て定常
期 (培 養 24時 間 )ま で 増 殖 させ た 。
i)こ の 液 を 3,000回 転 で 3分 間遠 心 分 離 した 。
面 )遠 心 分 離 後 、上 清 を 以 下 の比 率 で 新 た な SC合 成 培 地 (終 濃 度
グル コ ー ス 含 む )と 混 和 した 。
2%
①液 1(4%グ ル コ ー ス 上 清 1 5mL):1(SC合 成 培 地 1.5mL)
②液 1(2%グ ル コ ー ス 上 清 1 5mL):1(SC合 成 培 地 1.5mL)
③液 1(1%グ ル コー ス 上 清 1.5mL):1(SC合 成 培 地 1.5mL)
④液 SC合 成 培 地 3.OmL)
⑤液 2%グ ル コ ー ス 3.OmL
⑥液 l(2%グ ル コ ー ス 上 清 1 5mL):1〔 SC(‐ D:グ ル コ ー ス 含
まず )合 成 培 地 1.5mL〕
市)そ れ ぞれ の液 に 、 出芽酵母 を濁度 0.5に な る量 を加 えた 。
v)30℃ にて 24時 間培養 し、2時 間お きに濁 度 を測 定 した。
実験
3:細 胞 外 の環境 変化 に よる影 響 を確認 す る群 、細 胞 内 の 変化 に よ
る影 響 を確 認 す る群 、揮 発 性 物 質 の 影 響 を確 認 す る群 にて構 成 した 。
1)細 胞 内 の 変化 に よる影 響確認
① 酵母 を SC合 成 培 地 (グ ル コー ス 終濃度 1,2,4%)60 mLに て
30時 間培養 した 。
② 培養 終 了後 、遠 心 分離 (3,000rpm× 5分 間 )し 、そ の 沈澄 を得
た。
③ 沈澄 の 全量 に 新 た な SC合 成 培 地 (グ ル コー ス 終濃度 2%)を
加 え 6 mLと し、 そ の l mLを 三 角 フ ラ ス コ に加 えた 。
④ 三 角 フ ラ ス コ に 、新 た な SC合 成培 地 を 20 mL加 えた 。
⑤ 培養 を継 続 し、 4,8,12時 間後 に濁 度 を測 定 した 。
51
1)細 胞 外 の 環境 変化 に よる影 響確 認
① 酵母 を SC合 成 培 地 (グ ル コー ス 終濃度
30時 間培養 した 。
1,2,4%)60 mLに
て
② 培養 終 了後 、遠 心 分離 (3,000rpm× 5分 間 )し 、そ の上 澄 み を
得 た。
③ これ とは別 に 、② の 時点 で 培養 21時 間 とな る酵 母懸濁液 (グ
ル コー ス 終濃度 2%)を 準備 し、 これ を遠 心 分離 (同 上 )し て
上 澄 み を除去後 、酵母 の み と した もの に SC合 成培 地 (グ ル コ
ー ス 終濃度
2%)を
6 mLカ ロえ 、そ の l mLを 三 角 フ ラ ス コ に
加 えた 。
④ 三 角 フ ラ ス コ に 、③ で 得 た液 を 10 mLと 新 た な
(グ ル コー ス 終濃 度 2%)を 10 mL加 えた 。
SC合 成 培 地
⑤ 培養 を継 続 し、 4,8,12時 間後 に濁度 を測 定 した 。
五)揮 発性 物 質 の 影響確 認
① 酵母 を SC合 成 培 地 (グ ル コー ス 終濃度
30時 間培養 した 。
1,2,4%)60 mLに
て
② 培養 終 了後 、遠 心 分 離 (3,000rpm× 5分 間 )し 、そ の上 澄 み を
得 た。
③ 得 られ た上 澄 み を、 100℃ 温水 中 で 10分 間 加 温 した 。
④ これ とは別 に 、② の 時点 で 培養 21時 間後 とな る酵母 懸濁液 (グ
ル コー ス 終濃 度 2%)を 準備 し、 これ を遠 心 分離 (同 上 )し て
上 澄 み を除去後 、酵母 の み と した も の に SC合 成培 地 (グ ル コ
ー ス 終濃度 2%)を 加 え 6 mLと し、 そ の
コ に加 えた 。
l mLを 三 角 フ ラ ス
⑤ 三 角 フ ラ ス コ に 、② で 得 た液 を 10 mLと 新 た な SC合 成 培 地
10 mLを 加 えた 。
⑥ 培養 を継続 し、 4,8,12時 間後 に濁 度 を測 定 した 。
52
3
結果
(1)実
験
1(グ
ル コー ス 濃 度 が 増 殖 に 与 え る影 響 )
培 養 液 中 で の グ ル コ ー ス 濃 度 が 、 ど の よ うに 細 胞 の 増 殖 に 影 響 を 与 え る
1,2,4%を
か を検 証 す る た め に 、 グル コー ス
含 む培 養 液 で の酵 母 の増 殖 を
比 較 した (通 常 の グ ル コ ー ス 濃 度 は 2%)。 密 度 効 果 が グ ル コ ー ス 濃 度 の 低
下 に よ り起 こ る な ら ば 、 グ ル コ ー ス が 低 下 した 後 (定 常 期 に 入 つ た 後 )、
グ ル コ ー ス を 追 加 し て 与 え る こ と で 増 殖 が 回 復 す る 可 能 性 が 考 え られ る 。
そ れ に つ い て も 検 証 した (図 30)。
董 ―――――.ttltZ
10
６ ４ ２ ０
§８ ︶赳興
︵
￨￨―
/
0
2
4
6
8
10 12
14 16
18 20 22 24 26 28 30 48
培 養 時 間 (hr)
図
30
グル コ ー ス 濃 度 可 変 に よ る 増 殖 へ の 影 響
グル コ ー ス 濃 度
1,2,4%を 含 む YPA培
地 に 、 酵 母 を濁 度 (OD600)0。
1
に 調 整 した も の を加 え 、 培 養 器 内 (30℃ )に て 振 盪 培 養 した 。 培 養 26
時 間 後 に 、 1,2%液 に グ ル コ ー ス を追 加 した と こ ろ 、 回復 へ の 影 響 が と
もに認 め られ 、 そ の 強 さは
1%>2%で あ つ た 。
定 常 期 に 入 りか け て い る 播 種 16時 間 後 ま で は 、 グ ル コ ー ス 濃 度 の 違 い
に よ る 細 胞 増 殖 へ の 影 響 は 認 め られ な か っ た (図 30)。 つ ま り 、 対 数 増 殖
後 期 か ら定 常 期 進 入 時 に か け て の 細 胞 増 殖 の 応 答 に は 、 こ の 範 囲 の グ ル コ
ー ス 濃 度 で は 影 響 しな い こ と と な る 。 しか しな が ら 、 そ れ 以 降
ま で 、 グル コー ス 濃 度
1%お
よび
2%に 対
26時 間 後
して 、 4%の も の で は 僅 か な が ら
定 常 期 に お け る 細 胞 濁 度 が 高 か っ た 。 た だ し、 グ ル コ ー ス 量 の 比 を 考 え る
と 、 こ の 条 件 下 で の 細 胞 の 増 殖 に 対 して 、 グ ル コ ー ス
る と 考 え られ る 。 つ ま り 、 通 常 の
2%グ ル
1%は 十 分 な 量 で あ
コー ス 存 在 下 に あ つ て 、 グル コ
ー ス 濃 度 低 下 が 主 要 因 で 、 細 胞 増 殖 が 制 限 され て い る の で は な い こ と を 示
唆 す る。
こ の 示 唆 を 支 持 す る 現 象 と して 、播 種
液 に終 濃 度
2%グ ル
26時 間 後 の グ ル
コー ス
1%液 、2%
コ ー ス を 添 加 した と こ ろ 、 細 胞 増 殖 の 再 開 が 認 め られ
53
た 。 特 に 、 1%液 で よ り増 加 が 認 め られ た (図 30)。 そ れ と 反 対 に 、 グ ル コ
ー ス 4%の も の に 、同 様 に 2%グ ル コ ー ス を 加 え て も ほ と ん ど 増 殖 再 開 を 誘
導 し な か っ た (デ ー タ 示 さ ず )。
も し グ ル コ ー ス 不 足 で 増 殖 が 制 限 され て
い る の で あ れ ば 、 どれ も 回 復 率 は 同 じ に な る 筈 で あ る 。 つ ま り 、 グ ル コ ー
ス 以 外 で 細 胞 の 増 殖 阻 害 に 働 い て い る別 の 環 境 要 因 が 存 在 して お り 、 そ れ
4%グ ル コ ー ス で の 培 養 液 中 に よ り 多 く存 在 す る こ と を 示 唆 して い る 。
さ ら に 、 途 中 で グ ル コ ー ス を 加 え る こ と な しに そ の 後 72時 間 ま で 長 期
は
培 養 を 続 け た と こ ろ 、 72時 間 後 の 細 胞 濃 度 は グ ル コ ー ス 濃 度 と 負 の 相
関 を 示 し 、 1%>2%>4%と な っ た (図 31)。
５ ０
§８ ︶撻頌
︵
“電卜…0%
■ 1%
-2%
-4%
0
培 養 時 間 (hr)
図
31
グル コー ス 濃 度 可 変 に よ る増 殖 へ の 影 響
グル コー ス 濃 度
0,1,2,4%を
含む
YPA培 地 に 、酵 母 を 濁 度 (OD600)0.1
に 調 整 した も の を 加 え 、培 養 器 内 (30℃ )に て 振 盪 培 養 した 。 増 殖 性 の
強 さ は 、グ ル コ ー ス 濃 度 1%>2%>4%の 順 で あ っ た 。 グ ル コ ー ス を加 え
な く て も あ る程 度 の 増 殖 は 得 られ た 。
対 象 実 験 と した グ ル コ ー ス
0%で は 、 細 胞 の 増 殖 は 対 数 増 殖 期 に お い て
悪 く 、 定 常 期 の 細 胞 濁 度 も低 か つ た (グ ル コ ー ス を 全 く加 え な い で も 細 胞
増 殖 が 観 察 され た の は 、Yeast extract中 に 炭 素 源 が 含 ま れ て い る た め と 考
え る )。
(2)実
実験
験
2(培
養 液 中 の成 長 阻 害 物 質 存 在 の検 証 )
1に て 、 定 常 期 培 養 液 中 に は グ ル コ ー ス の 濃 度 に 依 存 した 密 度 効 果
物 質 の 発 生 が 示 唆 され た 。 そ れ を 検 証 す る た め 、 新 鮮 な
SC合 成 培 地
(新
鮮 培 地 )に 定 常 期 ま で 酵 母 を 増 殖 させ 、 酵 母 を 遠 心 で 取 り除 い た 残 り の 培
養 液 (培 養 後 液 )を 等 量 混 合 させ た 液 に て 培 養 を 行 っ た 。 ま た 、 対 照 と し
54
SC合 成 培 地 の み で 増 殖 させ た も の 、グ ル コ ー ス 終 濃 度 2%培 養 液
に グ ル コ ー ス を 含 ま な い SC合 成 培 地 を 等 量 混 合 させ た も の 、 グ ル コ ー ス
て新 鮮 な
の み を設 け た。 結 果 を 図
32に 示
した 。
６ ４
§８ ︶撻唄
︵
― ① 4%+SC
― ② 2%+SC
③ l%+SC
― ④ SC
⑤ 2%
― ⑥ 2%+SC(‐ D)
8
10
12
培 養 時 間 (hr)
図
32
グル コ ー ス 濃 度 可 変 に よ る 培 養 液 の 増 殖 へ の 影 響
1,2,4%を 含 む SC合 成 培 地 に 、酵 母 を濁 度 (OD600)0。 1
に 調 整 した も の を加 え 、 培 養 器 内 (30℃ )に て 24時 間 振 盪 培 養 した 。
そ の 上 澄 み 液 と 、2%グ ル コ ー ス を 含 む 新 鮮 な SC合 成 培 地 を等 量 混 合 し
た も の (① ② ③ )、 新 鮮 培 地 (④ )、 2%培 養 上 澄 み 液 の み (⑤ )、 2%培 養
グル コー ス 濃 度
上 澄 み 液 とグ ル コ ー ス を 含 ま な い SC合 成 培 地 の 等 量 混 合 (⑥ )に て 比
較 した 結 果 、 グル コ ー ス 濃 度 が 高 い ほ ど増 殖 抑 制 が 認 め られ た 。
培 養 後 液 を混 ぜ た もの で は 、 明 らか に 対 照 の新 鮮 培 地 の み の もの に 比 ベ
て 細 胞 増 殖 が 阻 害 され た (図 32)。
そ の 度 合 い は 、 グル コー ス 濃 度 が 高 い
培 養 後 液 を混 ぜ た もの程 、 増 殖 抑 制 が 強 か っ た。 この こ とは 、培 養 後 液 グ
ル コ ー ス 濃 度 に 相 関 して 蓄 積 した 増 殖 阻 害 物 質 が 存 在 して い る こ と を 強
く示 唆 す る 。
グル コー ス は
1%濃 度 で 細 胞 培 養 に は 十 分 で あ
り (図 30)、 グ ル コ ー ス 濃
度 が 低 下 して い る 培 養 後 液 を 混 ぜ た こ と で 、 グ ル コ ー ス 濃 度 が 相 対 的 に 下
が つ た (1∼
2%の
範 囲 )こ と が 原 因 で 、 こ の よ うな 結 果 に な っ た と い う可
能 性 は 考 え難 い 。
(3)実
験
3(高
濃 度 グ ル コ ー ス で 前 培 養 され た 細 胞 は そ の 後 の 増 殖 回 復
が 阻 害 され る )
実 験 1と
2の 結 果 か
ら 、 培 養 後 液 中 に グ ル コ ー ス 濃 度 に 応 じた 増 殖 阻 害
物 質 が 存 在 す る こ と が 強 く示 唆 され た 。 こ の よ うな こ と が 、 細 胞 中 に も 起
55
こ つ て い る か を検 証 す る た め 、 様 々 な グル コー ス 濃 度 を含 む 培 地 で
30時
間 培 養 し 定 常 期 に 達 した 酵 母 細 胞 を 回 収 し 、 新 鮮 培 地 に 移 して そ の 後 さ ら
に 培 養 した 。 細 胞 が 分 裂 を 繰 返 して し ま う と細 胞 中 の 前 歴 が 薄 ま っ て し ま
う可 能 性 を 考 え 、 植 継 い だ 直 後 の 細 胞 の 増 殖 (定 常 期 に 達 し た 細 胞 が 再 び
対 数 増 殖 期 に 進 入 す る 過 程 )を 調 べ た 。
8時 間 ま で は 、 そ れ ら の 増 殖 に は 大 き な 違 い は 認 め られ な
か つ た も の の 、 12時 間 後 は 1%グ ル コ ー ス で 前 培 養 した 酵 母 は さ ら に 増 加
を 示 した (図 33、 上 )。 しか し 、 2%グ ル コ ー ス で の 前 培 養 した も の で は さ
ら な る 増 殖 は 認 め られ ず 、4%グ ル コ ー ス 前 培 養 酵 母 で は 濁 度 の 減 少 が 認 め
培養 液 交換 後
％
％
％
一
０
５
４
３
２
「
１
‐
５
一
日
︱上 ︱ ︱ ■
‐
→
-
０
︲
2%―
細 胞 ■環境
日
濁度
1%一
５
１
30時 間培 養
０
２
細 胞 内 環境
__
０
日日目 □日一¨
られ た 。 つ ま り 、 同 じ定 常 期 に あ つ た に も か か わ らず 、 前 培 養 の 際 の グ ル
コ ー ス 濃 度 に 応 じ て 、 細 胞 の そ の 後 の 増 殖 が 抑 制 され た 。
５
１
0■ ― 一 ― ― 一 一 一 ― 一 一 =― 一 一 一 一 ― ― ― ― ―
上澄 み
―… 沈 澄
図
33
２
数値 はグル コース濃度
３
2%一
４
加熱効果
21時 間培養
8
累 積 時 間 (hr)
グル コ ー ス 濃 度 可 変 に よ る 細 胞 内 環 境 、 細 胞 外 環 境 へ の 影 響
お よび 揮 発 性 物 質 の影 響 確 認
細 胞 内環 境 で は
4%培 養 に て 増 殖 阻 害 が 強 く認 め られ た 。 細 胞 外 環 境 で
は 本 実 験 条 件 下 に お い て グ ル コ ー ス 濃 度 の 違 い に よ る差 は 少 な い も の
で あ っ た 。 揮 発 性 物 質 の 影 響 で は 、濃 度 に 依 存 した 変 化 は 認 め られ な か
った。
56
この こ とか ら、培 養 後 液 中 に グル コ ー ス 濃 度 に応 じた 増 殖 阻 害 物 質 が 存
在 す るだ け で は な く、 そ れ ま で の 培 養 に お け る グル コ ー ス 濃 度 の 履 歴 が 細
胞 中 に残 つ て い る とい う興 味深 い 結 果 が 得 られ た 。
一 方 、21時 間培 養 して 定 常 期 に達 した細 胞 を回 収 し、グル コ ー ス 濃 度 の
異 な る培 養 後 液 (1,2,4%)を 加 え て 、 上 述 の 細 胞 外 で の 影 響 と同様 な確
認 を した 結 果 に お い て は 、 グ ル コ ー ス 濃 度 に応 じた 増 殖 再 開 の 阻 害 は認 め
られ な か つ た (図
中 )。
さ らに 、培 養 後 液 中 の アル コー ル 等 の 揮 発 性 物 質 の 阻 害 作 用 を検 証 す る
33、
目的 で 、 培 養 後 液 を 10分 間煮 沸 した も の を 培 養 に用 い て も、 特 に 増 殖 再
開 の 促 進 は観 察 され な か つ た (図 33、 下 )。 む しろ 、 2%グ ル コ ー ス で は 、
12時 間後 の 増 殖 の 阻 害 が 僅 か な が ら認 め られ た 。
７‘
ＥＵ
4
考察
グル コ ー ス は 、 エ ネ ル ギ ー 源 と して 、 ま た炭 素源 と して 生 物 に と つ て極
め て 重 要 な物 質 で あ る。 細 胞 は 、 細 胞 内 お よび 生 息 環 境 中 にお け る グル コ
ー ス 量 を把 握 して 効 率 的 に利 用 して い る と考 え られ る。 グル コー ス の 終 濃
度 が 低 い 1%の も の で は 、 出芽 酵 母 の 増 殖 す る速 さに影 響 を与 え な か つ た
も の の 、 定 常期 ま で 増 殖 を続 け る時 間 が 延 長 し、 そ の 結 果 定 常 期 の 細 胞 濁
度 が 増 加 した (図 31)。 通 常使 用 され て い る グ ル コ ー ス 濃 度 の 2%が どの よ
うな経 緯 で選 ばれ た も の な の か は不 明 で あ るが 、少 な く と も 2%が 定 常 期
に達 す る酵 母 の 培 養 に 一 番 良 い 条 件 で は な い こ とが示 され た 。 本 実 験 で は
対 数 増 殖 後 期 の タイ ミ ン グ で 、 グ ル コー ス 濃 度 で 顕 著 な差 を認 め な か つ た
た め 、 グ ル コ ー ス 濃 度 の 違 い に よ る娘 細 胞 へ の 影 響 確 認 は行 わ な か つ た 。
定 常 期 に達 した と こ ろ に グル コ ー ス を追 加 添 付 した と こ ろ 、 そ れ ま で の
培 地 中 の グ ル コー ス 濃 度 とは 負 の 相 関 を も つ 増 殖 再 開 を示 した (図 30)。
この こ とは 、細 胞 増 殖 に 伴 い 発 生 す る物 質 が 培 養 液 中 に 蓄 積 し、 そ れ が 細
胞 増 殖 を 阻 害 して い る こ とが 示 唆 され た 。 さ らに 、 グル コ ー ス 濃 度 に 依 存
した 影 響 が 細 胞 内 に残 つ て い る こ とが示 唆 され た (図 32)。
一 方 、 増 殖 に よ り発 生 す る揮 発 性 物 質 、具 体 的 に は ア ル コ ー ル の 影 響 を
疑 い 、加 熱 処 理 を す る こ とで アル コ ー ル の 影 響 を 除 い た も の と比 較 した と
こ ろ 、加 熱 に よ る増 殖 再 開 の 改 善 は認 め られ ず 、本 試 験 条 件 下 で は 、 阻 害
に 対 す るア ル コ ー ル の 関 与 は認 め られ な か つ た 。
炭 素 源 に 着 目 して 、少 子 化 パ ラ ドック ス お よび セ パ レー シ ョンが 発 生 す
る原 因 を探 ろ う と した が 、 い ず れ の 実 験 に お い て もそ れ を 解 明す る に は 至
っ て い な い 。 そ の た め 、発 生 す る原 因 に窒 素 源 あ る い は他 の 要 因 に よ る可
能 性 が あ る も の と推 察 す る。 先 に 記 述 した 、 窒 素 源 涸 渇 に よ り、成 長 過 程
を ス キ ップ した 緊 急 な 出芽 が 行 わ れ 、 そ れ 以 後 停 止 状 態 に な る応 答 に ヒ ン
トが あ る の か も しれ な い 。
58
第二節
1
活 性 酸 素 に よ る影 響
は じめ に
生 物 は 分 子 状 酸 素 の 高 い 化 学 的 反 応 性 を利 用 した エ ネ ル ギ ー 代 謝 の 代
償 と して 「両 刃 の 倹1」 とな る 反 応 性 の 高 い 酸 素 分 子 種 で あ る活 性 酸 素
(reactive Oxygen species,ROS)と の 関 わ りを余 儀 な く され て い る 。ROS
は
1940年 代 に発 見 され 、そ の 後 の 研 究 に よ り、種 々 の ROSに よ る酸 化 ス
トレス が 、DNAや タ ンパ ク 質 。脂 質 に影 響 を及 ぼ し、生 命 活 動 に 多 大 な 関
与 を示 す こ と、生 活 習 慣 病 の 元 凶 に な る こ とが 報 告 され て き た (Taniyama
.,2006)。
θι′ノ,2003、 Sakai θ′′′2003、 MacNee,2005、 Houstis θ′′ノ
さ らに生 物 の 寿 命 を決 定 す る 因 子 の 一 つ で もあ る こ とが 、 Tolmasoffら に
よ つ て 指 摘 され て きた (Tolmasoff θι′′,1980)。 ま た 、 1956年 に は 、 ミ
トコ ン ドリア にお い て ROSが 産 生 され 、「加 齢 は ミ トコ ン ドリア 由来 の フ
リー ラ ジ カ ル に よ つ て 引 き起 こ され る細 胞 損 傷 が 蓄 積 した も の で あ る」 と
の 仮 説 が 報 告 され た (Harman,1956)。 そ の 後 しば ら くは この 仮 説 は 注 目
され る こ とは な か っ た が 、1973年 に過 酸 化 水 素 が 単離 ミ トコ ン ドリア か ら
.,1972,1973)、
産 生 され て い る こ とが 明 らか とな つ て か らは (Boveris θ ′
`′
ミ トコ ン ドリア 呼 吸 鎖 由来 の ROSが 寿 命 に重 要 な役 割 を 演 じて い る こ と
が知 られ る よ うに な つ て き た 。
生 物 は 上 述 の よ うに生 体 反 応 で 不 可 避 的 に 発 生 す る
ROSを
消 去 す るた
め の 系 を有 して い る。 Superoxide(02)を 消 去 す る superoxide dismutase
(SOD)は そ の 防御 系 にお い て 中 心 的 な 役 割 を担 っ て い る (M cCord θι′′.,
SODは 細 胞 質 と ミ トコ ン ドリア に 存 在 し、 そ れ ぞ れ 重 要 な 役 割 を
担 つ て い る (酵 母 で は細 胞 質 SODは Sodl、 ミ トコ ン ドリア SODは Sod2)。
1969)。
第 二 章 に 、対 数 増 殖 後 期 に 一 過 性 の 細 胞 消滅 が 発 生 す る こ とを記 述 した 。
本 章 本 節 で は 、 そ の 原 因 の 一 つ と して ROSを 疑 い 、 これ を 検 証 した 。
59
2 材 料 お よび 方 法
(1)使 用 株
実 験 1:出 芽 酵 母 は 、 BY4741と
、 BY4741に 対 し活 性 酸 素 の 消 去 に か
か わ る SODlお よび SOD2遺 伝 子 を欠 損 した sο ごゴ∠ (細 胞 質 局 在 型 )
お よび sα ″ Z(ミ トコ ン ドリア 局 在 型 )を 用 い た 。βο′ゴZお よび sα″
∠の
GenOtypeお よび 遺 伝 子 の 機 能 を表 7お よび 表 8に 示 した 。
実験
2:BY4741、
sο ″′Z、
実験
3:BY4741、
βο′ゴ∠ を用 い た 。
実験
4:S288C、 BY4741,θ Oご ゴZ、 sα´ ∠ を用 い た 。
sα ″∠を 用 い た 。
(2)使 用 培 地
SC合 成 培 地 を用 い た
〔
組 成 は第 二 章
3(2)を
参 照 〕。
(3)培 養 条 件
100 mL用 の 三 角 フ ラ ス コ に 10 mLの SC合 成 培 地 を加 え 、 30℃ の 培 養
器 内 に て 振 盪 培 養 した 。 播 種 酵 母 数 は 、 前 々 培 養 (約 24時 間 )お よび 前
培 養 (約 24時 間 )し た酵 母 を 8× 104/mL(終 濃 度 )に 調 整 し培 養 液 に加
えた 。
(4)サ ンプ リ ン グ
実 験 1:細 胞 の 増 殖 状 況 を確 認 す るた め に 、 濁 度 (OD600)測 定 お よび
細 胞 数 算 定 を行 つ た 。 濁 度 測 定 お よび 細 胞 数 算 定 の た め の サ ンプ リ ン
グ は 、培 養 開 始 か ら 3時 間 お き に 36時 間後 ま で 行 つ た 。 ま た 、 これ
に
ゴZ、
sο ご
sα″ ∠で は
42,48時 間値 を加 えた 。
実 験 2:実 験 1と 同様 に 、 濁 度 測 定 お よび 細 胞 数 算 定 の た め の サ ンプ リ
ン グ を 、培 養 開始 か ら 3時 間 お き に 36時 間 後 ま で 行 つ た 。
3:同 上
実 験 4:死 細 胞 染 色 の 予 備 検 討 は S288Cを 用 い て行 つ た 。 S288Cで の
実験
サ ン プ リ ン グ は 、培 養
30時 間後 お よび 42時 間後 に行 つ た 。 BY4741,
よび sα ″∠ を用 い た 本 試 験 で は 、培 養 開始 後 、約 1日 後 (対
数 増 殖 後 期 )、 3日 後 、 5日 後 、 7日 後 にサ ンプ リ ン グ を 行 い 、 死 細 胞
sο ′ゴ∠お
の 染 色 を行 つ た 。 さ らに染 色 標 本 を素 に 、約
細 胞 (ア ポ トー シ ス 陽性 細 胞 )を 算 定 した 。
60
500細 胞 中 に発 生 す る死
(5)死 細 胞 の 染 色
死 細 胞 の 染 色 は 、予備 検 討 と して 、Acridine Orange、 DAPI、 PhloxinB、
Propidium iodide(PI)、 TUNEL、 Annexin‐ V+PIに て 行 い 、 本 試 験 は
Annexin‐ V+PIに て 行 つ た 。 い ず れ の 染 色 法 にお い て も、 これ ま で に報 告
の な い 出芽 痕 を染 め る Calcofluor White(CW)染 色 を併 用 す る方 法 に て
行 つ た 。 そ れ ぞ れ の 染 色 原 理 、 お よび 染 色 方 法 を以 下 に示 す 。
Acridine Orangeの 染 色 原 理
Acridine Orangeは 、 ア ン トラ セ ンの 一 つ の 炭 素 が 窒 素 に 置 換 した 構 造
を持 つ 環 状 有 機 窒 素 化 合 物 の 誘 導 体 で あ り、 正 電 荷 を持 つ 蛍 光 色 素 で あ
る。 核 酸 に イ ン タ ー カ レー トす る性 質 を持 ち、結 合 部 位 の 構 造 が 変 化 す
るた め に 、励 起 波 長 を あ て る こ とで 蛍 光 を発 す る。 染 色 にお い て は この
特 徴 を生 か し、核 酸 の 視 覚 化 を行 う。 Acridine Orangeは 、 生 細 胞 に も
浸 透 す るが 、選 択 的 に細 胞 外 へ 排 出 され る の で 染 色 され な い 。 死 細 胞 で
は排 出 が 行 わ れ な い た め 、核 酸 が 染 色 され る。 この 性 質 を利 用 して 死 細
胞 の 同 定 を行 う。
Acridine Orange+Calco■ uor White(CW)の 染 色 方 法 と標 本 作 製 観 察
i)培 養 懸 濁 液 の 一 部
離 (卓 上 遠 心 機
(懸 濁 液 の 濃 度 に よ り調 整 す る)を 取 り、遠 心 分
:VORTEX 7秒
間 、以 下 同 じ)し 上 澄 み を 除 去 す る。
1)蒸 留 水 500 μLに て 2回 洗 浄 す る。
血 )CW液 (l mg/mL)を 上 記 の 沈 澄 に
100 pL加 え 、 3分 間染 色 す る 。
市)蒸 留 水 500 pLに て 2回 洗 浄 す る。
v)Acridine Orange(0.05 mgノ
mL)液 を上 記 の 沈 澄 に 100
pL加 え 、 1
分 間 染 色 す る。
宙 )蒸 留 水
500 pLに て 2回 洗 浄 す る。
前 )氷 冷 下 に て 超 音 波 処 理 (20秒 間 、約 65」 )す る。
価 )遠 心 分 離 後 の 沈 澄 に 蒸 留 水 を加 え 適 当量 (1視 野 100細 胞 程 度 )の
懸 濁 液 とす る。
破 )こ の 懸 濁 液 を ス ライ ドグ ラ ス に 1.7 pL滴 下 し、これ に カ バ ー グ ラ ス
を 載 せ 、 さ らに透 明 な マ ニ キ ュ ア に て カ バ ー グ ラ ス の 辺 縁 を 覆 い 、
乾 燥 を 防 止 す る。
x)蛍 光 顕 微 鏡 は励 起 波 長
488nm、 検 出波 長
518nmに て 観 察 す る。
DAPIの 染 色 原 理
DAPIは 、二 重 鎖 DNAを 優 先 的 に 染 色 す る 正 電 荷 を持 つ 蛍 光 色 素 で あ る。
61
特 に 、 ア デ ニ ン とチ ミ ン (A‐ T)に 特 異 的 に 作 用 す る性 質 を持 ち 、 核 酸
にイ ン タ ー カ レー トす る 。 結 合 部 分 に 紫 外 線 を 当 て る と強 い 青 色 の 蛍 光
を発 す る。 DAPIは 細 胞 膜 透 過 性 を 有 す る。 この た め 、 生 細 胞 も 死 細 胞
も と も に処 理 され るが 、 死 細 胞 は形 態 で 判 断す る。
DAPI+CWの 染 色 方 法 と標 本 作 製 観 察
染 色 液 お よび 励 起 波 長 以 外 は Acridine Orangeと 同様 とす る。
DAPIの 濃 度 は l μLノ mLと し、 沈 湾 に 100 pL加 え 、 1分 間染 色 す る。
蛍 光 顕 微 鏡 で の 観 察 は励 起 波 長
345nmと
す る。
PhloxinBの 染 色 原 理
Ph10xinBは 、 キ サ ン チ ン 系 酸 性 染 料 (赤 色 104号 )で あ り、核 を赤 く
染 め る。PhloxinBは 細 胞 膜 透 過 性 が な く、死 細 胞 の 核 の み を染 色 す る。
そ の た め 、 染 色 され た細 胞 は死 細 胞 とな る。
PhloxinBの 染 色 方 法 と標 本 作 製 観 察
染 色 液 お よび 励 起 波 長 以 外 は Acridine Orangeと 同様 とす る。
PhloxinBの 濃 度 は 5 mg/mLと し、 沈 澄 に 100 pL加 え 、 1分 間染 色 す
る。 蛍 光 顕 微 鏡 は励 起 波 長 488nm、 検 出波 長
518nmに て 観 察 す る。
PrOpidium iodideの 染 色 原 理
Propidium iodideは 正 電 荷 を持 つ 蛍 光 色 素 で あ り、 DNAの イ ン タ ー カ
レー タ ー と して知 られ る。 二 本 鎖 DNAを 選 択 的 に染 め る。 細 胞 膜 に 対
す る透 過 性 が な い た め 、生 細 胞 の 核 DNAを 染 色 す る こ とは で き な い が 、
死 細 胞 で は細 胞 膜 の 構 造 が 崩 壊 す るた め に 、核
DNAを 染 め る こ とが で
き る。
Propidium iodide(PI)+CWの 染 色 方 法 と標 本 作 製 観 察
染 色 液 お よび 励 起 波 長 以 外 は Acridine Orangeと 同様 とす る。
Propidium iodideの 濃 度 は 0.25 pg/mLと し、 沈 査 に 100 μL加 え 、 1
分 間染 色 す る。蛍 光 顕 微 鏡 は励 起 波 長 488nm、 検 出波 長
518nmと
す る。
TUNELの 染 色 原 理
ア ポ トー シ ス 細 胞 死 に 伴 い 発 生 す る DNA切 断 に よ る DNA断 片 の 3'‐ OH
末 端 に 、酵 素 反 応 に て 修 飾 した 核 酸 を標 識 す る こ とに よ つ て 同 定 す る 。
タ ー ミナ ル トラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ は DNA断 片 核 酸 の 重 合 を触 媒 し、 フル
オ レセ イ ン を取 り込 ませ る こ とに よ り蛍 光 顕 微 鏡 に て 検 出 可 能 とな る
., 1992)。
(Gavrieli θ ′
`′
つ乙
ｒＯ
TUNEL+CWの
i)10mL用
染 色 方 法 と標 本 作 製 観 察
フ ァル コ ン チ ュー ブ に 8
さ らに 、 lM
室温で
KP04を
l mL、
30分 間 振 盪 処 理 す る
mLの 細 胞
107/mL)を 入 れ る。
37%ホ ル ム アル デ ヒ ドを l mL加 え 、
(2×
(箱 に入 れ 振 盪 器 で処 理 す る)。
1)振 盪 が 終 了 した ら、 上 記 液 を エ ッペ ン ドル フ チ ュー ブ に入 れ 替 え 、
PBSに て 3回 洗 浄 す る 。 遠 心 は 、 2,500 rpm 3分
間 とす る。 上
清 の 除 去 は 、 細 胞 の ロス を少 な くす るた め に 、数 回 に 分 け て 行 う。
1×
ア ス ピ レー タ ー の 使 用 は不 可 とす る。2回 日以 降 の 洗 浄 は 300∼ 500
μLに て 行 う。
五 )上 清 を捨 て た ら、 450 pLの
PBSに て 懸 濁 す る。
さ らに 、 10× Zymolyase 50 μLを 入 れ ピペ ッテ ィ ン グす る。
市)37℃ 300 rpmで 35分 間 (厳 密 に )振 盪 す る。 処 理 時 間 が 長 い と細
胞 は壊 れ る。 処 理 時 間 が 短 い と抗 体 が細 胞 内 に 取 り込 まれ る。
v)3,000 rpmで 1分 間遠 心 し、そ の 沈 澄 を 1× PBS 500 μLで 3回 洗 浄
す る。 最 後 は 100 μLの 1× PBSに て懸 濁 す る。
宙 )3,000 rpmで 1分 間遠 心 した 沈 湾 に 30 FLの TUNEL反 応 液 を加 え
37℃ で 30分 間染 色 す る。
前 )1× PBS 500 μLで 3回 洗 浄 す る。洗 浄 後 3,000 rpmで 1分 間遠 心 し
た 沈 澄 を 得 る。
価 )沈 澄 に CW液 (l mg/mL)を 100 pL加 え 3分 間染 色 し、1× PBS 500
μLで 3回 洗 浄 す る。 洗 浄 後 3,000 rpmで 1分 間遠 心 した 沈 湾 を得
る。
破 )沈 澄 に 1×
PBS 500 pLを 加 え 、 氷 冷 下 に て 超 音 波 処 理 (20秒 間 、
約 65」 )す る。
x)上 記 の 液 を 3,000rpmに て 1分 間遠 心 し、 沈 澄 に適 当量 の 1× PBS
を加 え 、この 1 7pLを ス ライ ドグ ラ ス に 載 せ カ バ ー グ ラ ス を か け た
後 、 カ バ ー グ ラ ス の 4隅 に マ ニ キ ュ ア を塗 り、 ス ライ ドグ ラ ス に の
せ 、 蛍 光 顕 微 鏡 に て 観 察 す る。 励 起 波 長 450∼ 500 nm、 検 出波 長
515∼ 565 nm(緑 )を 使 用 す る。
Annexin‐ V+PIの 染 色 原 理
ア ポ トー シ ス の 初 期 段 階 に は 、細 胞 膜 の 内側 に あ るホ ス フ ァ チ ジル セ リ
ン (PS)が 細 胞 膜 の 外 411に 表 出す る。この PSに 親 和 性 の 高 い Annexin‐ V
(35∼ 36kDaの Ca++依 存 性 に リ ン脂 質 と結 合 す る タ ンパ ク )が 結 合 可
能 とな る。従 つ て 、Annexin‐ Vと の 結 合 を 検 出す る こ とで ア ポ トー シ ス
００
′Ｕ
の 初 期 段 階 に あ る細 胞 を 同定 す る こ とが 可 能 とな る (Andree θι2■
1990、 K00pman θ ス,1994、 Vermes θ ■,1995)。 さ らに 、PI染 色
,
`′
`′
を加 え る こ とで 、 ネ ク ロー シ ス (細 胞 膜 の 重 合 度 の 消 失 に 伴 い 、 PSを
露 出す る )と の 分 別 を可 能 とす る。 ア ポ トー シ ス とネ ク ロー シ ス との 分
別 は 、Annexin‐ V(+)PI(― )は 初 期 段 階 の ア ポ トー シ ス 、Annexin‐ V
(+)PI(+)は 進 行 型 の ア ポ トー シ ス 、 Annexin‐ V(― )(+)PI(+)
はネ ク ロー シ ス と評 価 す る。
Annexin‐ V+PI+CWの 染 色 方 法 と標 本 作 製 観 察
i)10mL用 フ ァル コ ン チ ュー ブ に 8 mLの 細 胞 (2× 107/mL)を 入 れ る。
1)2,500 rpm 3分 間遠 心 分 離 す る。 沈 澄 に 1× PBSを 加 え エ ッペ ン ドル
フ チ ュー ブ に入 れ 替 え る。
rpm 3分 間遠 心 分 離 す る。 上 清 を捨 て た ら、 450 pLの PBS
にて 懸 濁 す る。 さ らに 、10× Zymolyase 50 pLを 入 れ ピペ ッテ ィ ン
血 )2,500
グ す る。
市)37℃
300 rpmで 35分 間
(厳 密 に )振 盪 す る。処 理 時 間 が 長 い と細
胞 は 壊 れ る 。 処 理 時 間 が 短 い と抗 体 が 細 胞 内 に 取 り込 まれ る。
v)3,000 rpmで 1分 間遠 心 し、そ の 沈 澄 を 1× PBS 500 μLで 3回 洗 浄
す る。 最 後 は 100 μLの 1× PBSに て 懸 濁 す る。
宙 )3,000
rpmで 1分 間遠 心 した 沈 澄 に 100 pLの Annexin‐ V+PI混 合 液
を加 え 15∼ 25℃ で 15分 間染 色 す る。
前 )1×
PBS 500 pLで 3回 洗 浄 す る。洗 浄 後 3,000 rpmで 1分 間遠 心 し
た 沈 湾 を得 る。
CW液 (l mg/mL)を
100 pL加 え 3分 間染 色 し、1× PBS 500
pLで 3回 洗 浄 す る。 洗 浄 後 3,000 rpmで 1分 間遠 心 した 沈 査 を得
価 )沈 澄 に
る。
PBS 500 pLを 加 え 、 氷 冷 下 に て 超 音 波 処 理 (20秒 間 、
65」 )す る。
破 )沈 澄 に 1×
約
x)上 記 の 液 を 3,000rpmに て 1分 間遠 心 し、 沈 澄 に適 当量 の
1×
PBS
を加 え 、この 1 7μ Lを ス ライ ドグ ラ ス に 載 せ カ バ ー グ ラ ス をか け た
後 、 カ バ ー グ ラ ス の 4隅 に マ ニ キ ュ ア を塗 り、 ス ライ ドグ ラ ス に の
せ 、 蛍 光 顕 微 鏡 に て 観 察 す る。 励 起 波 長 450∼ 500 nm、 検 出波 長
515∼ 565
出波 長
nm(緑 )を 使 用 す る。 PI染 色 は 、励 起 波 長 488nm、
518nm(赤 )を 使 用 す る。
64
検
上 記 の 染 色 法 は予 備 検 討 に て用 い た 。 予備 検 討 の 結 果 、Annexin‐ V+PI+
CWを 採 択 した 。 そ の 後 、 Annexin‐ V+PI+CW染 色 の 改 良 を加 え 、 上 記 の
染 色 法 と同 等 で あ る こ とを確 認 しな が ら簡 易 な方 法 へ の 改 変 を行 つ た 。 結
果 と して 以 下 の 方 法 を確 立 し、本 試 験 で は これ を用 い た 。
Annexin‐ V+PI+CWの 染 色 方 法 (改 良型 )
1)培 養 懸 濁 液 の 一 部 (懸 濁 液 の 濃 度 に よ り調 整 す る )を 取 り、 遠 心 分
離 (卓 上 遠 心 機 :VORTEX 7秒 間 、以 下 同 じ)し 、 上 澄 み を除 去 す
る。
1)蒸 留 水 500 μLに て 2回 洗 浄 す る。
血 )CW液 (l mg/mL)を 上 記 の 沈 湾 に 100 μL加 え 、 3分 間染 色 す る。
市)蒸 留 水 500 μLに て 2回 洗 浄 す る。
v)Annexin‐ V+PI液 (Annexin‐ V― FLUOS Staining Kitで の 指 定 濃 度
)
を上 記 の 沈 澄 に 100 μL加 え 、 15分 間染 色 す る。
宙 )蒸 留 水 500 μLに て 2回 洗 浄 す る。
前 )氷 冷 下 に て 超 音 波 処 理 (20秒 間 、 約 65」 )す る。
価 )遠 心 分 離 後 の 沈 湾 に 蒸 留 水 を加 え適 当量 (1視 野 100細 胞 程 度 )の
懸 濁 液 とす る 。
破 )こ の 懸 濁 液 を ス ライ ドグ ラ ス に 1.7 μL滴 下 し、これ に カ バ ー グ ラ ス
を 載 せ 、 さ らに 透 明 な マ ニ キ ュ ア に て カ バ ー グ ラ ス の 辺 縁 を 覆 い 、
乾 燥 を 防 止 す る。
x)蛍 光 顕 微 鏡 に て 観 察 す る。 Annexin‐ Vの 励 起 波 長 は 450∼ 500 nm、
検 出波 長 は 515∼ 565 nm(緑 )を 使 用 す る。 PI染 色 は 、励 起 波 長
488 nm、 検 出波 長 518 nm(赤 )を 使 用 す る。 CW染 色 は励 起 波 長
345 nmを 使 用 す る。
65
3
結果
(1)実
1(細
験
胞 の増 殖 ステ ー ジ にお け る
細胞 の増殖 ステー ジにお け る
株
sθ ご′
∠、 sθ 沈グ
と野 生 型
期 に な る と 、 sθ ごゴ∠ と
ROSの 影 響
)
ROSの 影 響 を 検 証 す る た め に 、 SOD欠 損
(BY4741)を 用 い て 増 殖 を 比 較
sθ 洗グ
した 。 対 数 増 殖
は 明 ら か に 野 生 株 に 対 して 増 殖 不 全 を 示 した
ROSの 発 生 が 顕 著 と な り 、そ れ
Sodl、 Sod2と も に そ の ROSス ト レ
(図 34)。 こ の こ と は 、対 数 増 殖 期 以 後 に
が 細 胞 増 殖 を 阻 害 す る こ と、 お よび
ス を 低 下 させ る こ と で 細 胞 増 殖 阻 害 を 防 い で い る こ と を 示 して い る 。
一 方 、対 数 増 殖 初 期 で は
2の 増 殖 不 全 は 観 察 され な か つ た 。
ROSの 発 生 が 極 め て 少 な く 、 ROSに よ る
∠ と sθ 溌
sθ グゴ
この こ とは 、 対 数 増 殖 初 期 で は
細 胞 増 殖 阻 害 が 殆 どな い こ と を示 す 。 逆 に 、 対 数 増 殖 初 期 で は
sθ 沈グ は 野 生 株 と比 べ て 僅 か な が ら 増 殖 が 良 好 で あ っ た 。
sθ グゴ
∠
と
６ ４ ２
§８ ︶拠頌
︵
―●― BY4741
-sο
d■△
Sο ″
一
￨
1__
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
42
48
培 養 時 間 (hr)
34
活 性 酸 素 消 去 機 構 の 変 異 に よ る増 殖 へ の 影 響
培 養 21時 間 以 降 、変 異 ス ポ ッ トに対 す る野 生 株 (BY4741)と 変 異 株
図
(sθ グゴ∠,s∝″ ∠)と
で 増 殖 性 に 明確 な 差 が 認 め られ た 。培 養
以 降 に活 性 酸 素 が 増 加 した こ とが推 測 され る 。 増 殖 抑 制 は
18時 間
sθ ごゴ∠が
s∝ ″ ∠ よ り強 い も の で あ っ た 。
(2)実
実験
験
2(ア
ス コル ビ ン酸 添 加 は
sθ グゴ∠の
生 育 不 全 を 回 復 させ る )
ROSの 細 胞 増 殖 阻 害 が 示 され た た
した 。 そ の 結 果 、 細 胞 質 型 SOD欠 損 株 sθ ごI∠ に お
1に て 、 対 数 増 殖 後 期 に お け る
め 、 さ らに そ れ を検 証
い て 、 酸 化 防 止 剤 で あ る ア ス コ ル ビ ン 酸 の 添 加 に よ り、 対 数 増 殖 後 期 で の
増 殖 の 回 復 が 認 め られ た (図 35)。
一 方 、 野 生 型 で は 回 復 傾 向 は 見 られ な
か っ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 ROSが 対 数 増 殖 後 期 の 細 胞 に 対 して 、増 殖 阻 害
効 果 を も た ら して い る と い う考 え を 支 持 す る も の で あ る 。
66
８
BY4741
７
６
J BY4741 GSH O.lmⅣ I
A BY4741 GSH O.3mヽ [
５
゛
ー
BY4741 GSH lmM
日 BY4741 GSH 3mⅣ I
―囀い‐BY4741 GSH 10mM
４
３
§８ ︶撻興
︵
一
゛
２
一
１
一
BY4742 A lmM
BY4741 A 3mM
BY4741 A 10mⅣ l
０
24
丁＋ 上 ︱ 十 二 ︱ 市 ＋ ︱
８
７
―
SOdlΔ
６
り sodl△
GSH O.lmM
A sodl△ GSH O.3mM
５
４
３
２
１
GSH lmM
GSH 3mM
-0-sodlΔ GSH 10mM
゛ sodl△ A lmM
―倒‐ sodl△ A3mM
-0-sodlΔ A 10mM
, sodl△
日
sodl△
０
24
27
８
sod2△
７
一
６
５
ジ sod2△
GSH O.lmLI
A sod2△
GSH O.3mM
GSH lmM
４
シ sod2△
LJ sOd2△ GSH 3m1/1
３
-く )― sod2△
GSH 10mM
゛ sod2△ A lm1/1
２
-sod2△
A3mⅣI
１
-0-sod2△ A10mM
０
3
6
9
12
15
18
21
24
０乙
o hr
培 養 時 間 (hr)
GSH:還 元 型 グ ル タ チ オ
A:ア ス コ ル ビ ン 酸
ン
35
活 性 酸 素 消 去 機 構 に 変 異 を 持 つ 株 に お け る還 元 型 グ ル タ チ オ
イ お よ び ア ス コ ル ビ ン 酸 に 対 す る応 答 .還 元 型 グ ル タ チ オ ン お よ び
図
ア ス コル ビ ン 酸 添 加 に よ る増 殖 性 の 回 復 は
sθ ごゴ∠で 強
く、 s∝″ ∠で
は 変 化 が な か っ た 。 ま た 、 sθ ごゴ∠ア ス コ ル ビ ン 酸 添 加 で 効 果 が 強 く、
変 異 ス ポ ッ トに 対 す る 野 生 株
(BY4741)に 近 似
67
した 。
そ れ に 対 して 、 ミ トコ ン ドリア 型
SOD欠 損 株
sο 凛夕
で は βοグZ∠ で 観 察
され た よ うな 増 殖 回 復 は認 め られ な か つ た 。 この こ とは 、外 か ら添カロした
ア ス コル ビン 酸 は 、 ミ トコ ン ドリア 内 で の ROSに よ る酸 化 的 障 害 に影 響
を与 え て い な い こ とを示 唆 す る。
一 方 、 同 じ く酸 化 防 止 剤 で あ る還 元 型 グル タチ オ ン の 添加 は 、 βο′f∠ に
対 して 、 ア ス コル ビ ン酸 添 加 の よ うな 増 殖 回復 は 観 察 され ず 、 10mMで は
却 っ て 増 殖 に 阻 害 的 に働 い た 。 この 高濃 度 の グル タチ オ ン の 増 殖 抑 制 は他
の 2株 にお い て も観 察 され た 。
(3)実 験 3(ROSと
細 胞 壁 ス トレス の 関連 の 検 証 )
ROSは 様 々 な 細 胞 内物 質 に ダ メ ー ジ を与 え るた め 、そ の 総 体 と して 細 胞
の 増 殖 阻 害 が 起 こ る と考 え られ る。 しか し、増 殖 細 胞 の どの よ うな機 能 が
最 も ROSに 対 して 感 受 性 が 高 い の か は不 明 で あ る。 前 述 の よ うに 、 対 数
増 殖 後 期 に は細 胞 壁 が 破 壊 され た細 胞 が 見 出 され た 。 この こ とは 、 細 胞 壁
が 脆 弱 に な つ て い る細 胞 が この 時 期 に 出現 す る可 能 性 を示 唆 す る。 さ らに 、
後 述 す る よ うに細 胞 壁 構 築 に 支 障 を も ち低 浸透 圧 ス トレス に弱 い ″ρ″ ∠
は対 数 増 殖 期 で 顕 著 な生 育 不 全 を示 した 。 この こ とは 、細 胞 壁 ス トレス が
細 胞 増 殖 に大 き な影 響 を与 え て い る こ とを示 唆 す る。
対 数 増 殖 後 期 に ROSが 細 胞 壁 ス トレス を 引 き起 こ しこれ が 細 胞 増 殖 阻
害 を も た ら して い る の で は な い か と の 仮 説 を 立 て て 、 これ を検 証 す るた め
に 、 浸 透 圧 保 持 剤 で あ る lMソ ル ビ トー ル の 細 胞 増 殖 へ の 影 響 を調 べ た 。
sο ′
′∠に ア ス コル ビ ン 酸 を添加 す る と野 生 株 レベ ル に ま で 増 殖 が 回復 した
しか し、 ソル ビ トー ル 添加 で は そ の よ うな増 殖 回 復 は認 め られ
ず 、却 つ て 増 殖 が 悪 化 した 。 さ らに、 ソル ビ トー ル を ア ス コル ビン 酸 と併
(図 36)。
用 させ る と、 ア ス コル ビン 酸 単 独 で の 生 育 不 全 回 復 を逆 に悪 化 させ た 。 ソ
ル ビ トー ル の 悪 影 響 は 、 βοごfZで の生 育 阻 害 が 認 め られ な か つ た 対 数 増 殖
初 期 で も起 こっ て い る こ とか ら、今 回 の 実 験 条 件 で は ソル ビ トー ル が 浸 透
圧 保 持 剤 と して の 効 果 で は な く、ア ス コル ビン酸 と の 相 互 作 用 、ま た ROS
を消 去 させ る物 質 と ソル ビ トー ル が 作 用 した た め の 結 果 と解 釈 した 。 そ の
た め 、本 実 験 か らは 浸 透 圧 の 変 化 と ROSの 重 複 作 用 を 疑 う仮 説 を 裏 付 け
る結 果 とは な らず 、 ソル ビ トー ル が 抗 酸 化 剤 と作 用 す る こ とで 毒 性 が 強 ま
こ とを確 認 した 結 果 とな つ た 。
なお 、 ソル ビ トー ル は ソル ビ トー ル グル コ ー ス を還 元 し、 アル デ ヒ ド基
を ヒ ドロ キ シル 基 に変 換 して 得 られ る糖 アル コ ー ル の 一 種 で あ り、 そ の 代
謝 は ブ ドウ糖 か ら得 られ 果 糖 に 分 解 して い く。
68
８
７
-{F
8Y4741
６
+sod1a
５
§８ ︶Щ唄
︵
<-sod1a_A_ 10mM
\ sodln_S_ lM
- sodla_s_ lM+A10mM
４
３
２
１
０
o hr
3
6
9
12
15
A:ア ス コ ル ビ ン 酸
S:ソ ル ビ トー ル
18
21
24
27
30
33
36
培 養 時 間 (hr)
36
活 性 酸 素 消 去 機 構 に 変 異 を持 つ 株 に お け るア ス コル ビン 酸 お
よび ソル ビ トー ル 添 加 に よ る 影 響 。 ア ス コ ル ビン 酸 10mMの 添 加 に
よ り野 生 型 とほ ぼ 近 似 した 増 殖 状 況 とな つ た 。ア ス コ ル ビ ン 酸 に ソル
図
ビ トー ル を添 加 す る と増 殖 の 回 復 は 抑 え られ 、ソル ビ トー ル が ア ス コ
ル ビ ン 酸 と反 応 し効 果 を弱 め た と推 察 され る 。
4(死 細 胞 の 染 色 と 増 殖 過 程 に お け る ROSの 影 響
第 二 章 に て 、 (1)娘 細 胞 の 数 と 等 し い は ず の 出 芽 痕 総 数 が 対 数 増 殖 後
期 に は 減 少 す る こ と (保 存 則 の 破 綻
(2)こ の 時 期 、 ス テ ー ジ の 進 ん だ
(出 芽 痕 を 多 く 有 し て い る )母 細 胞 の 死 が 増 加 す る こ と 、 (3)ス テ ー ジ
(4)実
験
)
)、
の 進 ん だ 母 細 胞 が 選 択 的 に 消 滅 す る と 仮 定 した 場 合 に は 、 出 芽 痕 の 総 数 と
娘 細 胞 数 の 実 測 値 に 理 論 値 が よ く相 似 す る こ と を 示 した 。 しか し 、 観 察 さ
れ た 細 胞 死 が 、 ア ポ トー シ ス (能 動 死 )、
ネ ク ロ ー シ ス (受 動 死 )の ど ち
ら に よ つ て も た ら さ れ た も の か は 不 明 で あ る 。 本 節 の 実 験 1と
ROSが
2よ
り、
対 数 増 殖 期 で 増 殖 しそ れ が ス ト レ ス に な っ て い る こ と が 示 唆 され
た 。酵 母 に お い て
ROSは
ア ポ トー シ ス の 原 因 と な る (Madeo θ′″ 。
,2002、
Agulilaniu θ′″ .,2003、 Herker θ′″ .,2004)。
こ の こ とは 、 上 記 で 認 め
られ た 細 胞 死 が ア ポ トー シ ス に よ る も の で あ る 可 能 性 を 示 唆 す る 。
本 実 験 で は 、細 胞 死 を判 別 す る特 異 的 蛍 光 色 素 を用 い る こ とに よ りこの
可 能 性 を 検 証 した 。 さ ら に は 、 細 胞 の ス テ ー ジ (出 芽 回 数 )と 細 胞 死 の 関
連 を検 証 す る た め に 、 ま だ報 告 例 の な い 死 細 胞 と出 芽 痕 の 多 重 染 色 法 を試
み た 。 ま ず 初 め に 、 CWと 多 重 染 色 し や す い 細 胞 死 検 出 色 素 の 選 定 を 行 つ
た。 こ こで用 い た もの は以 下 の
4つ
で あ る 。 acridine
orenge(細 胞 膜 を 浸
透 す る が 、 生 細 胞 で は 選 択 的 に 細 胞 外 へ 排 出 され る の で 染 色 され な い 。 死
69
細 胞 で は 排 出 が 行 わ れ な い た め 核 酸 が 染 色 され る )、
phloxin B(acridine
orengeと 同 様 に 細 胞 膜 を 浸 透 す る が 、生 細 胞 で は 選 択 的 に 細 胞 外 へ 排 出 さ
れ る の で 染 色 され な い 。 死 細 胞 で は 排 出 が 行 わ れ な い た め 染 色 さ れ る )、
4ち
6-diamidino-2-phenylindole(DAPI、 細 胞 膜 透 過 能 は 高 く な く 生 細 胞 は
染 色 され に く い が 、 死 細 胞 は 細 胞 膜 に 支 障 を 持 つ た め 透 過 し
す る )、
DNAを
染色
prOpidium iodide(PI、 DAPIと 同 様 に 生 細 胞 の 膜 は 透 過 せ ず 、
死細胞 の細胞 膜 は通過 し
DNAを
Acridine Orenge+CWで
染 色 す る )。
は 死 細 胞 と正 細 胞 と の 分 染 は 良 好 に な され た も
の の 、 出 芽 痕 に つ い て は 明 確 に 判 別 で き な か つ た (図 37)。
DAPI+CWで
は 出 芽 痕 の 観 察 は 良 好 で あ っ た が 、 死 細 胞 と生 細 胞 と の 分 別 は 困 難 で あ っ
た 。 Phloxin
B+CW,PI+CWで
は 、 死 細 胞 と生 細 胞 の 分 別 、 出 芽 痕 の 観 察
と も に 良 好 で あ り 、 細 胞 の 委 縮 化 、 膨 張 化 な ど形 態 学 的 に 判 別 を 困 難 と す
る よ うな こ と も な く観 察 し 易 い も の で あ っ た 。 そ の た め 、 CWと の 共 染 色
では
Phloxinも し く は PIを 選 ぶ こ と と した 。
Acridine orange*CW
DAPIttCW
Phloxi nB+CW
Propidium iodide+CW
り
0
く
け
凡_●
図
37
各 種 染 色 法 の染 色 動 態
(S288C)
死 細 胞 の 染 色 動 態 を 示 す 。染 色 の 良 否 判 定 は 明 確 な 死 細 胞 の 染 色 と 出 芽 痕 の 染 色
性 に て 行 っ た 。 PhloxinB+CWと
prOpidium iodide+CWが 良 好 で あ る 。
70
さ ら に 、 酵 母 の ア ポ トー シ ス を 特 異 的 に 判 別 す る た め に TUNEL
(TdT‐ mediated dUTP nick end labeling)法 と Annexin‐ V法 を試 み た 。
は ア ポ トー シ ス に よ り生 じる ク ロマ チ ン 断 片 の DNAの 31‐ OH
末 端 を タ ー ミナ ル トラ ンス フ ェ ラ ー セ (TdT)に よ リ フル オ ロセ イ ン標 識
TUNEL法
dUTPで 染 色 す る
(Gavrieli θι′■,1992)。
一 方 、 ア ポ トー シ ス の 初 期 段 階 で は、細 胞 膜 の 完 全 性 は保 た れ て い るが 、
膜 の リ ン 脂 質 の 非 対 称 性 が 失 わ れ る 。 そ れ に 伴 い 、生 細 胞 で は 細 胞 膜 の 内
側 に 局 在 す る 陰性 荷 電 リ ン脂 質 の フ ォ ス フ ァ チ ジル セ リ ン (PS)が 細 胞 外
表 面 に 露 出す る 。 Ca2+依 存 性 の リ ン 脂 質 結 合 タ ン パ ク で あ る Annexin‐ V
が この
PSに 選 択 的 に結 合 す る性 質 を利 用 して 、 FITC標 識
Annexin‐ Vを
用 い て ア ポ トー シ ス 細 胞 を 特 異 的 に 検 出 す る (Andree θι′■,1990、
Koopman θ ■,1994、 Vermes θι′′.,1995)。 Annexin― Vは し,ず しば PI
と組 み 合 わせ て ア ポ トー シ ス 検 出 に用 い られ る こ とに加 え て 、 TUNEL法
で 必 要 な細 胞 固定 も不 要 で あ る。
`′
PSに 結 合 した Annexin
の 蛍 光 は 観 察 され るが 、 細 胞 膜 の 構 造 自体 は 保 た れ て い るた め PIに は 染
ア ポ トー シ ス の 初 期 段 階 の 細 胞 で は 、 露 出 した
色 され な い (後 述 す る判 定 参 照 )。 ア ポ トー シ ス の 進 行 が 進 み 、細 胞 膜 の
構 造 が 崩 壊 す る と、 Annexinと PIの 両 方 の 蛍 光 が 観 察 され る。 一 方 、 ネ
ク ロー シ ス で は
PIで の み 染 色 され る。
TUNEL+CWで
は ア ポ トー シ ス 細 胞 が 良好 に 染 色 され た も の の 、 CWに
よ る 出芽 痕 染 色 の 効 率 は 低 下 した (図
38)。
この 原 因 は 、TUNEL法 で は 、
TdTを 細 胞 内 に 透 過 させ る た め に 、細 胞 固 定 後 にザ イ モ リア ー ゼ 処 理 を行
うた め細 胞 壁 を部 分 消 化 す る こ とに よ る。 出芽 痕 を構 成 して い る キ チ ン が
ザ イ モ リア ー ゼ 中 の キ チ ナ ー ゼ に よ り分 解 され て しま う こ とに よ り出 芽
痕 が 消 失 (減 少 )し て しま うた め で あ る。 ザ イ モ リア ー ゼ 処 理 時 間 を短 く
す る等 の 条 件 を振 つ て み た が 、 TUNEL法 との コ ン ビネ ー シ ョンで 効 率 よ
く出 芽 痕 を CWで 検 出す る条 件 は見 出 せ な か つ た (デ ー タ示 さず )。
それ に対 して 、Annexin‐ V+PI+CWで は ア ポ トー シ ス 細 胞 が 良好 に染 色
され 、 さ らに CWに よ る染 色 も良好 で あ っ た (図 39)。 以 上 の 結 果 か ら、
本 試 験 に は Annexin― V+PI+CWを 採 択 した 。
Annexin― V+PI+CWに よ る二 重 染 色 で は 、 そ れ ぞ れ の 染 色 像 を画 像 解 析
処 理 す る こ とに よ り、初 期 型 ア ポ ト‐ シ ス 、遅 延 型 ア ポ トー シ ス 、 ネ ク ロ
ー シ ス 、出芽 痕 と の 関係 を容 易 とす る (図 40)。 この 点 も、Annexin― V+PI
+CWの 利 点 と考 え る。
71
TUNEL
CW
ア ポ トー シ ス 細 胞 の 染 色
性 は 良好 で あ つ た。
●"
図
38
S288C
TUNEL+CWの
(S288C)
染色動態
の 培 養 3日 後 の 像 を 示 す 。
Annexin-V
CW
PI
―
ヮ
●
´●
“
図
39 Annexin‐ V+PI+CWの 染 色 動 態
S288Cの
培 養 3日 後 の 像 を 示 す 。 ア ポ トー シ ス と ネ ク ロ ー シ ス の 分 染
が な され 、 出 芽 痕 も 明 瞭 に 確 認 で き る 。
染 色 像 を重 ね る こ とで そ れ ぞ れ の 細 胞
に お け る分 布 の 把 握 が 可 能 とな る。 緑
色 が 強 い 細 胞 は 初 期 ア ポ トー シ ス 、 橙
● ハ
色 は 終 期 ア ポ トー シ ス 、 赤 色 は ネ ク ロ
ー シ ス 、 青 色 に て 出芽 痕 の観 察 が 可 能
と な る。
図
40 Annexin‐ V+PI+CWの
S288Cの
合成像
培 養 3日 後 の 像 を 示 す 。 全 て の 染 色 を 重 ね た 画 像 を 得 る こ と
も可 能 で 、 全 体 の 様 子 を確 認 す る 際 に 有 効 とな る。
72
Annexin‐ V+PI+CWで の 判 定 は 以 下 の よ う に した (CastrO θιノ 2011)。
終 期 ア ポ トー シ ス
q
1/√
細 胞 死 の タイ プ
戸r/√
初 期 ア ポ トー シ ス
￨
Annexin-V I
初 期 ア ポ トー シ ス
Propidium iodide
十
終 期 ア ポ トー シ ス
ネ ク ロー シ ス
十
な お こ こ で 得 られ た い く つ か の 興 味 深 い 結 果 を 述 べ る 。
第 二 章 で 示 し た 細 胞 壁 に 亀 裂 が 生 じて い る 細 胞 が こ こ で も観 察 され た
(図 42)。
対 数 増 殖 後 期 の 細 胞 (S288C、
生 じた 亀 裂 か ら
Aと
B)。
PIに
21時 間 後 )で
は 、 この細 胞 壁 に
て 赤 色 に 染 色 され る 染 色 体 が 漏 れ 出 て い た (図 41、
そ れ に 対 し、 同 様 に
PIで 染 色
は 観 察 され な い も の も 存 在 した 。 (図 41、
され た 別 の 細 胞 で も
Cと
DNAの
漏出
D)。 後 者 タ イ プ の 死 細 胞 が
時 を 経 て 、 前 者 タ イ プ の 細 胞 壁 に 亀 裂 を 生 じた も の か 、 も し く は 細 胞 死 に
は 物 理 的 に 壊 れ て い く も の と そ うで な い も の と存 在 す る の か は 不 明 で あ
る。
図
41
壊 れ か け て い る 細 胞 と死 細 胞 の 染 色 動 態
S288Cの
く像 を 示
21時 間 後 の 像 を 示 す 。 A,Bに 細 胞 が 物 理 的 に 壊 れ て い
し 、 C,Dに 細 胞 全 体 が 染 色 され た 像 を 示 す 。
培養
73
A
ヽ
図
42
壊 れ か け て い る細 胞 と死 細 胞 の
図
/
43
B
出 芽 中 に 見 られ た 死 細 胞 の
染色動態
染色動態
S288Cの
培 養 42時 間 後 の 像 を 示 す 。
図 41と 同 様 に 亀 裂 か ら染 色 体 が 漏 れ
こ れ が 染 色 され た 像 と 、 細 胞 全 体 が 染
ま つ て い る細 胞 が 観 察 され た 。
上 の 細 胞 は 娘 細 胞 の み 、下 の 細 胞 は 娘
細 胞 と母 細 胞 と も に 染 色 され て い る 。
セ プ チ ン カ ラ ー の 機 能 を確 認 す る方
法 と して も有 用 と判 断 す る 。
さ ら に 、 定 常 期 以 降 で は ス テ ー ジ の 進 ん だ (多 産 化 した )細 胞 が 選 択 的
に
PIに
よ り染 色 され る わ け で は な く 、 む し ろ 小 型 の 娘 細 胞 が 染 色 され る
傾 向 が 認 め られ た 。 ま た 、出 芽 中 の 娘 細 胞 が
43)。
PIで
し ば し ば 染 色 され た (図
こ の こ と は 、 細 胞 成 長 中 の 娘 細 胞 が 死 に や す い こ と を 示 して い る 。
A(図
43、
白矢 印 )の 細 胞 で は 娘 細 胞 の み
PI染 色
され て お り 、 母 細 胞
は 染 色 され て い な い 。 PIは 、異 常 な 細 胞 膜 よ り細 胞 に 進 入 し 細 胞 を 染 色 す
る が 、 娘 細 胞 と母 細 胞 は 細 胞 質 で つ な が っ て い る に も か か わ ら ず 、 母 細 胞
が 染 色 され て い な い の は 、 細 胞 壁 は つ な が っ て い る も の の 細 胞 質 分 離 が 起
こ つ て い る細 胞 で あ る か 、娘 細 胞 の影 響 が 母 細 胞 に伝 わ る逆 流 現 象 を起 こ
さ な い 機 構 が 備 わ っ て い る こ と の い ず れ か が 考 え られ る 。 そ れ に 対 し
Bの
PI染 色 され て い る 。 こ の 原 因 と して は 、
よ り流 出 した PIが 娘 細 胞 に 流 入 し た も の と 考 え ら
細胞 では、娘・母 両細胞 ともに
死 ん だ母 細 胞 の細 胞 膜
れ る。
ま た 、図
44(第 二 章 に て 提 示
る 多 産 化 した 細 胞 の 中 に は
し た も の と 同 じ )に 示 す よ う に 、壊 れ て い
PI染 色 陰 性 の も の が 認 め られ る 。こ の こ と は 、
死 に 近 い 過 程 を 経 た 後 に 細 胞 が 壊 れ る の で は な く 、 あ る と こ ろ (ル ー ズ 化
した セ プ チ ン カ ラ ー 部 位 を 想 定 して い る )を 起 点 と して 、 一 気 に 壊 れ て い
く も の と 推 察 され る 。 い わ ゆ る 物 理 的 な 影 響 で 壊 れ て い く と 推 察 され る 。
ま た 、 興 味 深 い こ と と して 、 小 型 の 娘 細 胞 も染 ま っ て い る。 こ の こ とは 、
娘 を 死 に 至 ら せ る 原 因 物 質 が 細 胞 内 に あ る こ と を 予 感 させ る 。
74
図
44
壊 れ か け て い る細 胞 と
死 細 胞 の染 色 動 態
S288Cの 培 養 30時 間 後 の 像 を 示
す 。 壊 れ た 細 胞 は PI染 色 に 陰 性
とな っ て い る 。 細 胞 内 の 染 色 体
が 既 に 流 出 して しま っ て い る の
か も しれ な い 。
上 記 の 結 果 を 基 に 、 ROSの 細 胞 死 へ の 影 響 を Annexin― V+PI+CW染 色
法 に よ り評 価 した 。そ の 結 果 、培 養 3日 後 の sθ ごゴ∠ で は 、野 生 株 (BY4741)
に 比 べ て 、 よ り 多 く の ア ポ トー シ ス 細 胞 が 認 め られ た (図 45)。 しか し な
が ら 、本 条 件 下 で は s∝″ ∠で の ア ポ トー シ ス は 顕 著 に 増 加 し な か っ た 。 ま
た 、 sθ ごゴ∠ に お い て 、 ス テ ー ジ の 進 ん だ 細 胞 と 出 芽 中 の 娘 細 胞 に ア ポ トー
シ ス が 認 め られ た 。 こ の こ と は 、 老 化 細 胞 と 出 芽 中 の 娘 細 胞 が 、 ROSに よ
つ て よ リダ メ ー ジ を 受 け る こ と で 、 ア ポ トー シ ス を 起 こ し 易 く な っ て い る
こ と が 示 唆 され る 。
図
A
BY 47
4L 3 days
45
出 芽 中 に 見 られ た 死 細 胞 の 染 色 動 態
sodl
3 days
sod2
A
3 days
上 の 細 胞 は 娘 細 胞 の み 、 下 の 細 胞 は 娘 細 胞 と母 細 胞 と も に 染 色 され て
い る。
さ ら に 、BY4741,sθ グゴ∠ ,sα´ ∠ の 培 養 開 始 約 1日 後 (対 数 増 殖 後 期
)、
3日 後 、 5日 後 、 7日 後 に 死 細 胞 の 発 生 頻 度 (図 で は 生 存 率 )を 算 定 し た 結
果 、 図 46に 牙きナ よ う に BY4741に 文lし sθ グゴ∠ ,sθ グ′∠ と も に 培 養 3日 目
以 降 有 意 に 死 細 胞 の 発 生 が 認 め られ た 。細 胞 質 局 在 型 の
sθ グゴ∠
と ミ トコ ン
ド リ ア 局 在 型 の sα ´ ∠ の 比 較 で は 、 3日 後 に お い て sθ ごゴ∠が 強 く 、 7日 後
に お い て sα″ ∠が 強 い 結 果 と な っ た 。 ミ ト コ ン ド リア 局 在 型 で は 影 響 が 遅
延 す る傾 向 が 認 め られ た 。
75
Ｓ 掛性川
一
20
BY4741
“モ 富sod′ 4
10
sod2△
…
1 day
3 days
5 days
7 days
培 養 日数
図
46
約
500細 胞 あ た りに 発 生 す る ア ポ トー シ ス 細 胞 に よ り算 定 した 生 存 率
活 性 酸 素 消 去機 構 の 変 異 に よ る生 細 胞 率 へ の影 響
を 示 す 。培 養 3日 後 以 降 、sθ グゴ∠,s∝″ ∠ と も に 生 存 率 の 低 下 が 認 め ら
れ た。最 初 に細 胞 質 局 在 型 の
sθ ごゴ∠が 反 応
し、以 後 ミ トコ ン ド リ ア 局
在 型 が 細 胞 質 局 在 型 を 上 回 り強 さ で 反 応 した 。
76
4
考察
対 数 増 殖 後 期 に 発 生 す る 一 過 性 の 細 胞 消 滅 に 対 し、 そ の 原 因 の 一 つ と し
て ROSを 疑 い 、 本 章 本 節 で は SOD欠 損 株 を 用 い た ROSの 増 殖 へ の 影 響
お よ び 細 胞 死 へ の 関 わ りに つ い て 検 討 を 加 え た 。 そ の 結 果 、 対 数 増 殖 期 以
降の
sχ ″ ∠で 細 胞 増 殖 が 抑 制 され 、 さ ら に そ の sθ ごゴ∠の 増 殖 阻
害 が ア ス コ ル ビ ン 酸 添 加 に よ り 野 生 株 と 同 程 度 ま で 回 復 した 。 こ れ ら の こ
sθ ごゴ∠ と
ROSが 細 胞 に ス ト レ ス を 与 え て い る こ と
47は ROSの 代 謝 マ ッ プ で あ る が 、H202を H20
とは 、 対 数 増 殖 期 以 降 に お い て
を 示 唆 す る も の で あ る 。図
に す る 際 に 機 能 す る グ ル タ チ オ ン ーア ス コ ル ビ ン 酸 回 路 に 作 用 し た も の
と 半U断 され る 。
+t>7>
ヒポキサ ンチ ン
Fe3+,cu2+
H202
02・
e―
｀
・ OH―…
…
==L…
…→H20
02
Gtu Cys
Asp
LOH+H20
グル タチオ ンーアス コル ビン酸 回路
2H20
Arginosuc:ア ルギ ノコハ ク酸、Cit:シ トル リン、CPS iカ ルバ ミル リン酸合成酵素、
CySH:シ ステ ィン、Fum:フ マール酸、Y‐ Gtu Cys:Y‐ グル タミルシステ ィン、
CSH:還 元型 グルタチオ ン、GSSG:酸 化型グルタチオ ン
GR:グ ル タチオ ンリダクターゼ、APX:ア スコル ビン酸 ペルオキ シダーゼ
図
47
活性酸素
(ROS)の 代 謝 マ ッ プ
活 性 酸 素 種 の 挙 動 と係 わ りを も つ 物 質 の 関 係 を 図 式 化 した 。
sθ ごゴ∠の 増 殖 性 回 復 に グ ル タ チ オ ン ーア ス コ ル ビ ン 酸 回 路 が
影 響 し、 ア ス コル ビ ン 酸 添 加 に よ る
で あ った。
77
ROSの 影 響 軽 減 が 顕 著
細 胞 質 局 在 型 SOD欠 損 株 βοごゴZで は ア ス コル ビン 酸 が 強 く作 用 し、
GSHは 低 い 濃 度 で 僅 か な効 果 の み で あ つ た 。これ に 対 し ミ トコ ン ドリア局
在 型 で あ る ,α ´∠は 両剤 と も に 作 用 しな か つ た 。 グル タ チ オ ン が 細 胞 内 、
ア ス コル ビ ン酸 が 細 胞 表 層 の ラ ジ カ ル 消 去 に 作 用 す る 。 恐 ら く、 こ の グル
タチ オ ン とア ス コル ビ ン 酸 の 働 き の 違 い が 、効 果 の 差 を生 じて い る可 能 性
が あ る と推 察 され る。
当初 の 目的 と予 想 で は 、SOD欠 損 株 で 一 過 性 の 細 胞 消滅 が 増 加 す る こ と
を期 待 した が 、細 胞 死 とい う よ りは この よ うに 細 胞 増 殖 の 阻 害 とい う こ と
が 顕 著 に 現 れ た た め 、 細 胞 死 へ の 影 響 は予 測 され る も の の 、 一 過 性 に 作 用
す る原 因 と して 特 定 す る に は 至 らな か つ た 。
78
第 二節
1
密 度 効 果 /そ の 他 に よ る影 響
は じめ に
出芽 酵 母 は 、母 細 胞 か ら娘 細 胞 を 出芽 す る こ とで 子 孫 を増 や す 非 対 称 分
裂 を行 うた め 、 細 胞 分 化 や 細 胞 系 譜 の 研 究 モ デ ル と して 汎 用 され て い る
(Thorpe θ ′,2008、 Neumiller θ ′.,2009)。 形 態 的 な 非 対 称 性 だ け
`′
`′
で は な く、細 胞 成 分 も非 対 称 に 分 配 され る。 母 細 胞 は 分 裂 の 度 に細 胞 へ の
酸 化 ダ メ ー ジ な どを 受 け た 老 化 成 分 を 引 き受 け る こ とに な り老 化 が進 む
一 方 、娘 細 胞 に は 老 廃 物 は 引継 が れ な い 。 そ の 結 果 、 老 化 した 母 細 胞 か ら
で も若 い 娘 細 胞 が 生 じ る こ とが 可 能 で あ り、 い わ ゆ る娘 細 胞 の 若 返 り
(rejuvenation)が 走ユこ る。
第 二 章 で述 べ た よ うに 、 出芽 酵 母 細 胞 に は 分 裂 寿 命 (RLS)と 経 時 的 寿
命 (CLS)が あ り、 そ れ ぞれ は 哺 乳 類 細 胞 の 分 裂 回数 と分 裂 停 止 後 の 細 胞
の 寿 命 に 相 当す る 。 さ らに 、酵 母 と ヒ ト細 胞 の 老 化 ・ 寿 命 の 分 子 機 構 も非
常 に似 て い る。 こ れ らの こ とか ら、 酵 母 にお け る老 化 研 究 は 、 ヒ ト細 胞 の
.,2003、
老 化 研 究 にお け る よい モ デ ル とな つ て い る (Bitterman θオ′′
Fabrizio θ ′
.,2008、 Steinkraus θ ノ
.,2008、 Barea θ′′′,2009)。
`′
`′
生 物 に は 最 適 な 条 件 下 で 実 現 す る生 理 的 寿 命 (PLS)と 、 そ の 生 物 が 生
活 して い る 場 で 見 られ る現 実 的 な生 態 的 寿 命 (ELS)と が あ る。 これ は 単
細 胞 生 物 に と つ て も同様 で あ る と考 え られ る。 出芽 酵 母 は ス テ ー ジ の 異 な
る細 胞 が 混 在 す る ヘ テ ロ な細 胞 集 団 で あ り、 そ の 細 胞 集 団 に お い て 個 々 の
細 胞 が 同 じ RLSと
CLSを 示 す か ど うか は 不 明 で あ る。 しか し、 自然 界 で
(ス テ ー ジ の 進 ん だ )動 物 が 飢 餓 や ス トレス で 死 にや す
年 を取 つ た 老 い た
い の と同 様 に 、 出芽 酵 母 にお い て も環 境 が 悪 化 す る定 常 期 にお い て 、 ス テ
ー ジ の 進 ん だ 母 細 胞 が 死 にや す い こ とは 十 分 に あ り得 る。
RLSは 、 単 離 され た 一 つ の 細 胞 の PLSと して 測 定 され る も
の で あ る (Xiao‐ Fen et al.,2009)。 一 方 、CLSは 細 胞 集 団 の 平 均 寿 命 と し
て 測 定 され る も の で あ る (Fabrizio θι′′,2007)。 そ の た め 、RLSと CLS
出芽 酵 母 の
の どち らにお い て も、 ス テ ー ジ の 異 な るヘ テ ロ な細 胞 集 団 内 にお け る 、
個 々 の 細 胞 の ELSは 全 く不 明 で あ る。 多 細 胞 生 物 にお い て も 同様 で あ り、
分 裂 回 数 が 異 な る ヘ テ ロ な細 胞 集 団 内 で の 個 々 の 細 胞 の そ の 後 の 分 裂 回
数 、 分 裂 後 の 寿 命 が 同 じで あ る の か 、違 うの か 、 ま た 違 う とす る とそ れ が
ど の よ うに制 御 され て い る の か は全 くの 不 明 で あ る。
上 述 の 研 究 を通 して 筆 者 は 、出芽 酵 母 が 細 胞 の ELS研 究 に 対 して 非 常 に
有 用 な モ デ ル 生 物 で あ る こ とに気 付 い た 。 ヒ ト細 胞 で は 、 あ る時 点 で そ の
79
細 胞 を観 察 して もそ の 細 胞 の 履 歴 と して の ス テ ー ジ (過 去 の 分 裂 回数 )は
判 断 で き な い 。 しか し、 出芽 酵 母 の 場 合 に は 、過 去 の 分 裂 回 数 は 出芽 痕 と
して 刻 印 され て い るた め 、 あ る時 点 で の 細 胞 の ス テ ー ジ が 判 断 で き、
Annexin‐ V+PI+CW染 色 法 と組 み 合 わせ る こ とで 、個 々 の 細 胞 の ス テ ー ジ
と CLSを 検 証 す る こ とが で き る は ず で あ る。
定 常 期 長 期 培 養 中 の 酵 母 の 死 は ア ポ トー シ ス で あ る (Herker θι2■
,
ア ポ トー シ ス が 能 動 的 な 死 で あ る こ とを 踏 ま え る と、 そ こ に は 何
らか の 生 物 学 的 意 義 が あ る は ず で あ る。 提 唱 され て い る生 物 学 意 義 と して
2004)。
は 、極 度 の 栄 養 源 飢 餓 環 境 にお い て は 、集 団 中 の 一 定 の 割 合 の 細 胞 に積 極
的 に死 を もた らす こ とに よ り、残 り少 な い 栄 養 を生 き残 り細 胞 に よ り多 く
分 配 す る こ とが で き る こ とに加 えて 、 死 細 胞 が 持 つ て い た 細 胞 成 分 が 培 地
中 に 放 出 され 、 そ れ が 栄 養 源 と して 生 き残 り細 胞 に供 給 され る、 とい うも
の で あ る。厳 しい ス トレス 環 境 下 の生 物 に と つ て は 、自分 の 遺 伝 子 (子 孫 )
を殖 や す よ り、遺 伝 子 を 絶 や さな い こ とが 重 要 で あ る。 近 接 した 空 間 に 存
在 す る酵 母 集 団 は通 常 、 遺 伝 子 を共 有 す る ク ロー ン 個 体 で あ る こ とか ら、
細 胞 集 団 の 戦 略 と して は 、 全 て の 細 胞 を 中途 半 端 に生 き延 び させ る戦 略 を
とる よ りは 、少 数 の 個 体 を よ り長 く生 き延 び させ る 戦 略 が 結 果 的 に適 応 的
で あ る とい う理 屈 で あ る。
この 酵 母 の 定 常期 長 期 培 養 中 の 適 応 的 ア ポ トー シ ス 理 論 か らは 、 老 い 先
短 い (あ ま り分 裂 で き な い )ス テ ー ジ が進 ん だ細 胞 が 選 択 的 に ア ポ トー シ
ス を起 こす こ とが 予 見 され る。 しか し、これ ま で そ れ は 確 認 され て い な い 。
本 節 で は それ を 検 証 した 。 カロえて 、 予 期 して い な か つ た 、 最 も若 い ス テ ー
ジ 0の 娘 細 胞 が ア ポ トー シ ス を起 こ しや す い こ とを 見 出 した 。 さ らに 、
Annexin‐ V+PI+CW染 色 に よ り、定 常 期 長 期 培 養 中 の ア ポ トー シ ス にお け
る ROS、 細 胞 壁 ス トレス 等 に お い て も検 証 した 。
加 え て 、密 度 効 果 に よ る増 殖 へ の 影 響 を確 認 す るた め に 、 これ ま で の 液
体 培 地 中 で の 検 討 (二 次 元 環 境 )か ら、寒 天 培 地 中 で の 検 討 (二 次 元 環 境 )
を行 つ た 。 そ の 結 果 、揮 発 性 ガ ス が 増 殖 抑 制 に 作 用 して い る こ とが 明 らか
とな つ た 。
80
2
材 料 お よび 方 法
(1)使 用 株
″ρ力Z
実 験 1:出 芽 酵 母 は 、 あυ′∂∠ (セ プ チ ン カ ラ ー に 異 常 を 持 つ 株
Z(細 胞 壁 の 安 定 性 に 関 与 す る MPKl遺 伝 子 を 欠 損 し た 株 ん あfZ
(rDNA領 域 の 組 み 換 え が 抑 え られ た 株 sir2∠ (長 寿 遺 伝 子 SIR2
)、
)、
)、
を 欠 損 した 株
)、
/η ゴ∠
(ア ポ トー シ ス に 関 連 す る 遺 伝 子 を 欠 損 し た
株 )を 用 い た 。 そ れ ぞ れ の 株 の
お よび 表
8に 示
Genotypeお
よび 遺 伝 子 の機 能 を表 7
した 。
2 :出 芽 酵 母 は 、 S288C,BY4741,%″ σ∠ ,sο 力θ∠ ,β ο′ゴ∠ ,sο ど2
″メ fZ,ら υグθZ,力 らゴ∠ ,′
,sir2∠ を 用 い た 。
"∠
実験
実験
3:S288Cを
(2)使 用 培 地
実 験 1:SC合
実験
2:同
実験
3:YPD寒
zl,
用 い た。
組 成 は第 二 章
成 培 地 を用 い た 〔
3(2)を
参 照 〕。
上
天 培 地 を 用 い た 。 YPD寒 天 培 地 の 組 成 は 以 下 の 通 り と
した 。
BactO yeast extract(1%)
10g
Bacto peptone(2%)
20g
Glucose(2%)
BactO ager(2%)
20g
20g
上 記 の組 成 を蒸 留 水 に て溶 解 し
しシ ャー レに
(3)培
25 mL加
1000 mLと
した も の を 高 圧 蒸 気 滅 菌
え た。
養条件
10 mLの SC合 成 培 地 を 加 え 、30℃
の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。播 種 酵 母 数 は 、前 々 培 養 (約 24時 間
お よ び 前 培 養 (約 24時 間 )し た 酵 母 を 8× 104/mL(終 濃 度 )に 調 整
実験
1:100 mL用
の三角 フ ラス コに
)
し培 養 液 に 加 え た 。
実験
2:200 mL用
の三 角 フ ラス コに
30 mLの SC合 成 培 地 を 加 え 、30℃
の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 した 。 以 下 は 実 験 1と 同 様 と した 。
実験
2:10 mL用
器 内 にて
l mLの SC合 成 培 地 を カロえ 、 30℃ の 培 養
し た 。 細 胞 は 前 培 養 (約 24時 間 )し た 酵 母
の試 験 管 に
12時 間 振 盪 培 養
81
を濁 度
(OD600)0.1に 調 整 し加 えた 。培 養 終 了後 、希 釈 し必 要 個 数 と
した 酵 母 を シ ャ ー レ に加 え 30℃ のふ 卵 器 内 に て 7日 間培 養 した 。
(4)方 法
実 験 1:細 胞 の 増 殖 状 態 を確 認 す るた め に 、濁 度 (OD600)測
定 お よび
細 胞 数 算 定 を行 つ た 。 濁 度 測 定 お よび 細 胞 数 算 定 の た め の サ ンプ リ ン
グ は 、培 養 開 始 か ら 3時 間 お き に
行 つ た。
36時 間後 ま で と、 42,48時 間 後 に
2:死 細 胞 染 色 の た め の サ ンプ リン グ は 培 養 約
1日 後 (対 数 増 殖 後
期 とな る 、S288Cは 24時 間後 、 ァカ″ ∠は 33時 間後 、そ の 他 は 30時
間後 )、 3日 後 、 5日 後 、 7日 後 と した 。 死 細 胞 の 染 色 は 、本 章 第 二 節
実験
の Annexin‐ V+PI+CW(改 良 型 )を 用 い た 。 生 存 細 胞 率 は 、約 500細
胞 算 定 す る 内 に観 察 され るア ポ トー シ ス の 出現 比 率 を素 に 算 定 した 。
実験
3:シ ャ ー レ に加 え る細 胞 数 は 10,100,1000と
した 。 シ ャ ー レの
中央 に 薄 い プ ラ ス テ ィ ッ ク板 を入 れ 、栄 養 供 給 にお け る相 互 作 用 を遮
断 した 。 空 気 層 に つ い て は シ ャ ー レの 蓋 に よ る外 部 との 遮 断 以 外 行 わ
ず 解 放 系 と した 。 これ に 、 10細 胞 ず つ 入 れ る も の 、 10細 胞 と 100細
胞 を入 れ る も の 、10細 胞 と 1000細 胞 を入 れ る も の を 調 整 した 。ま た 、
シ ャ ー レ全 体 に 10細 胞 入 れ る も の と 100細 胞 入 れ る も の を調 整 した 。
シ ャ ー レ に入 れ て か ら 1日 後 か ら 7日 ま で 1日 お き に 観 察 した 。 コ ロ
ニ ー の 大 き さは画 像 解 析 ソフ トを用 い 、最 長 と最 短 を 勘 案 した 平 均 値
と して 求 め た 。重 な っ た コ ロ ニ ー は計 数 対 象 か ら外 した 。1000細 胞 で
の 計 数 は行 わ な か つ た 。
つ４
００
3
結果
(1)実 験 1(老 化 。寿 命 等 に 関連 す る遺 伝 子 に 変 異 を持 つ 株 の 増 殖 状 況
)
ROSの 細 胞 増 殖 に 対 す る影 響 を 調 べ る 際 に用 い た 、 SOD欠 損 株 で あ る
βο″ ∠′θο崚グ は 、対 数 増 殖 後 期 にお け る 増 殖 阻 害 と と も に 、定 常期 長 期 培
養 に お い て 、 ア ポ トー シ ス が 促 進 され CLSも 短 くな つ た (本 章 第 二 節 )。
この よ うに 、 共 通 の ROSス トレス に よ り、 細 胞 増 殖 阻 害 と定 常 期 に お け
るア ポ トー シ ス 促 進 が 観 察 され た 。 この こ とは 、 細 胞 にお い て 、細 胞 増 殖
と分 裂 後 の 寿 命 に相 関 が あ る こ とを示 唆 す る。 これ を 検 証 す る 目的 で 、 老
化 あ る い は寿 命 に 関連 す る変 異 株 (ら ′ご闊 ,ん らゴ∠,sir2△,′ ηゴ∠)を 用 い て 、
細 胞 増 殖 と定 常 期 にお け る生 存 率 に 相 関 が あ るか を調 べ た 。
出芽 部 位 にお け る母 細 胞 か ら娘 細 胞 へ の 細 胞 成 分 の 移 行 は 、能 動 的 且 つ
選 択 的 に行 わ れ る。 しか し ろυご図 で は この 選 択 性 が 損 な われ るた め 、娘 細
RLSが 短 くな り、 母 細 胞 の RLSが 長 くな る (Kaeberlein,2008)。
ゲ ノ ム の 不 安 定 性 も酵 母 の RLSに 大 き く影 響 す る。真 核 生 物 で は 多 数 の
rDNAが 1∼ 数 力 所 に集 中 して 存 在 し、酵 母 で は 12番 染 色 体 の 1カ 所 に 約
150コ ピー 存 在 す る (」 ohnston ο ′.,1997)。 Ettf遺 伝 子 は 、この rDNA
`′
の 転 写・ 複 製 に 関 与 し、 この 遺 伝 子 欠 損 株 んみゴ∠で は rDNA領 域 内 の 相 同
組 換 え が 起 こ らな い こ と、 rDNAの コ ピー 数 の 増 幅 ・ 縮 小 が 起 こ らな い こ
と、 そ して そ の 結 果 と して 、 RLSが 延 び る こ とが 報 告 され て い る。 rDNA
の 相 同組 換 え の 結 果 生 じる rDNAか ら切 り出 され た 環 状 の extra rDNA
胞の
circle(ERC)は 母 細 胞 中 に徐 々 に 蓄 積 す るが 、 この 蓄積 が進 む と細 胞 は
そ れ 以 上 分 裂 で き な くな る。 つ ま り、 ERC生 成 が RLSを 規 定 して い る。
ん″ ∠で は rDNA組 換 えが 抑 制 され 、 ERC生 成 が 抑 制 され 、 そ の 結 果 と し
RLSが 延 長 す る (Kaeberlein
θ
,2005)。 ヒス トン脱 ア セ チ ル 化 酵
`2■
素 で あ る Sirtuinの 遺 伝 子 漁 2を 欠 損 した 株 sir2△ で は 、 逆 に rDNA組
て
換 え と ERC生 成 が 促 進 され て RLSが 短 縮 す る (Sinclair&Guarente.,
らfzl,siF2△の CLS力 ｀どの よ う￨こ な る か は よ く分
1997)。 た だ し、 わ′ど
か ってい ない。
",ル
野 生 株 (BY4741)に 比 べ て 、 い ず れ の 株 も対 数 増 殖 後 期 以 降 に 増 殖 阻
害 が 認 め られ た (図 48)。 一 方 sir2△ とア ポ トー シ ス 実 行 に 関係 す る
caspase遺 伝 子 を欠 損 した 株 yι ′ゴ∠ に 関 して は 、 そ の 差 は少 な い も の で あ
っ た。
対 数 増 殖 後 期 に細 胞 壁 が 破 壊 され た細 胞 を観 察 した こ とか ら、細 胞 壁 維
持 に必 要 な 圏 K■ 遺 伝 子 を欠 損 した 株 ″ρ″ ∠ も用 い た 。 酵 母 で は細 胞 壁
合 成 に 異 常 が 生 ず る と細 胞 周 期 を停 止 す る細 胞 壁 チ ェ ッ ク ポ イ ン ト (the
83
cell wall integrity checkpoint)が 提 唱 され て い る (Levin 2011、 Negishi
&Ohya 2010)。 細 胞 壁 の セ ン サ ー の 一 つ と して は Mid2遺 伝 子 が 報 告 され
て い る (Ketela θ′″ 。
,1999)。 さ ら に 、 細 胞 壁 多 糖 類 の 一 つ で あ る ペ ク チ
ン は カ ル シ ウ ム イ オ ン と複 合 体 を 形 成 す る 。 増 殖 が 進 む と培 地 の
下す るが 、環境 中の
pHは 低
pHが 低 下 す る と 複 合 体 か ら カ ル シ ウ ム イ オ ン が 溶 け
出 て し ま い 細 胞 に 強 い ダ メ ー ジ を 生 ず る と の 報 告 が な され て い る
(Koyama
θ′′ノ
。
,2001)。 対 数 増 殖 後 期 に お い て ″′女ゴ∠ は 強 い 増 殖 阻 害 を
こ れ は 上 記 の よ うな 、 細 胞 壁 の 維 持 が 対 数 増 殖 後 期 の 細
示 した (図 48)。
胞 増 殖 に非 常 に重 要 で あ る こ とを示 す 。
８
７
<-8Y4741
６
+mpk1a
５
§８ ︶拠興
︵
fobl A
４
*-*-* ycal A
３
.
２
*
-
Sir2A
bud6a
１
０
33
36
42
86
42
10.0000
３ミ ∞
〓 ×︶ 輛 里 尋
1.0000
0.1000
0.0100
0.0010
0.0001
0
3
6
9
12
15
18
21
培養 時間
図
48
24
27
30
33
48
(hr)
変 異 ス ポ ッ トが 及 ぼ す 増 殖 へ の 影 響
細 胞 壁 の 安 定 性 遺 伝 子 欠 損 株 ″ρ女ゴ∠に お い て 顕 著 な 増 殖 抑 制 が 認 め ら
れ た。 野 生株
(BY4741)と
比 較 した 場 合 、 い ず れ の 株 も対 数 増 殖 後 期
以 降 に 増 殖 抑 制 が 認 め られ た 。BY4741の デ ー タ は 第 二 章 の 値 を加 え た 。
84
(2)実
2(定
験
常 期 長 期 培 養 に お け る ア ポ トー シ ス と生 存 率 低 下 )
酵 母 の 定 常 期 長 期 培 養 中 の ア ポ トー シ ス と そ の 原 因 を 明 ら か に す る 目
的 で 、 こ れ ま で 用 い て き た 様 々 な 株 に お け る Annexin‐ V‐ PI― CW染 色 を 行
い 、 ア ポ トー シ ス の 発 生 状 況 を 確 認 した 。 さ ら に 、 出 芽 痕 の 観 察 に 第 一 章
2で 記 述 した 細 胞 ス ラ イ ス 法 を 併 用 した 。
図 49は 、S288Cの 培 養 1日 後 、3日 後 、7日
後 に 採 材 した 細 胞 懸 濁 液 よ
り得 た 染 色 像 で あ る (5日 後 の 染 色 像 は 割 愛 した )。 Annexin― Vに よ リア ポ
トー シ ス 細 胞 が 、PIに よ り死 細 胞 が 、CWに よ り出 芽 痕 が 染 色 され て い る 。
桃 色 丸 で 示 した も の が 初 期 タ イ プ の ア ポ トー シ ス と な る 。
S288C l day
3 days
7 days
０
．
ロ
〕
r
、
,O
CW
l-
.<D
o
｀
ヽ
図
49
1**O
り 、
a
t
も0
a
定 常 期 長 期 培 養 に よ る死 細 胞 の 発 生 状 況
染 色 は Annexin‐ V(AV)+PI+CWの 二 重 染 色 を 施 し た 。 写 真 は 、 S288C
500細 胞 算 定
し 3日 後 で 約 5倍 、 7
の 培 養 1日 後 、 3日 後 、 7日 後 の 標 本 よ り得 た も の 。 約
中 に 発 生 し た ア ポ トー シ ス は 、 培 養 1日 後 に 対
日後 で 約
35倍 で あ つ た 。
85
定 常 期 長 期 培 養 に お け る 死 細 胞 の 発 生 状 況 を 観 察 した 。 観 察 は 、 培 養 約
(S288Cは 培 養 24時 間 後 、 ″力″ ∠ は 33時 間 後 、 そ の 他 は 30時 間
後 )、 3日 後 、 5日 後 、 7日 後 と し 、 約 500細 胞 中 に 出 現 す る ア ポ トー シ ス
陽 性 細 胞 の 出 現 頻 度 に よ る 生 存 率 に て 判 定 した 。 結 果 を 図 50に 示 し た 。
1日 後
100
０
７
０
６
{-8Y4741
whiSA
０
５
Ｓ 冊緯川
<-S288C
'{-
sch9A
０
４
sodl A
０
３
-esE& sod2A
+mpk1A
０
２
*'+** buddA
I fobl A
０
１
. - ycalA
０
sir2A
3 days
l day
5 days
7 days
培 養 日数
図
50
定 常 期 長 期 培 養 に よ る生 細 胞 率 の変 化
糸句 500 細 胞 中 に 出 現 す る ア ポ トー シ ス 陽 性 細 胞 の 出 現 頻 度 に よ る 生 細
胞 率 と して 表 示 した 。
ア ポ トー シ ス を 起 こ した 細 胞 を 死 細 胞 と し 、 定 常 期 長 期 培 養 に お け る 細
胞 の 生 存 率 を 求 め た 。培 養
48)わ ログびZは 、 3日
48時 間 ま で 大 き な 増 殖 抑 制 を 示
さ な か っ た (図
後 、 5日 後 、 7日 後 と 著 し く細 胞 の 生 存 率 が 低 下 し 続
ρ女ゴ∠ も顕 著 な 生 存 率 低 下 を 示 した 。 RLSに 関 し て は 長 寿
“
命 と な る ん bI∠ で も 野 生 型 BY4741よ り短 命 と な っ た 。 同 様 に ア ポ トー シ
けた。 同様 に
ス が 抑 制 され る /θ ′ゴ∠ も 野 生 株 よ り長 寿 命 を 想 定 し た が 、結 果 は 短 命 で あ
つ た 。こ れ に 関 し て は 、同 様 な こ と が 報 告 され て い る (Herker θ′ノ .,2004)。
一 方 、 観 察 中 に 興 味 深 い 像 を 得 た (図 51)。 栄 養 源 飢 餓 時 に は
Gl期 細
胞 が 増 加 す る が 、 わログ例 で は 出 芽 中 の 細 胞 が 多 く 観 察 され 、 さ ら に そ れ ら
出 芽 中 の 細 胞 に お い て ア ポ トー シ ス が 観 察 され た 。 こ の よ うな 傾 向 は 他 の
株 で は 認 め られ な か っ た 。
86
bυ
d64 30 hrs
図
51
mpkl
A
whi1A
30 hrs
5 days
定 常 期 長 期 培 養 に よ る死 細 胞 の 発 生 状 況
染 色 は Annexin… V+PI+CWの 二 重 染 色 を施 した 。 わログθ∠ (30 hrs)に
て 出芽 中 の ア ポ トー シ ス が 多 数 観 察 され た 。
J22′
女ゴ∠ は 早 期 (30 hrs)
に 多 数 の ア ポ トー シ ス を 誘 発 す る。 ″カゴ∠ (5 days)は 娘 細 胞 の ア ポ ト
ー シ ス が 顕 著 で あ っ た。
(3)実
験 3
これ ま で は 細 胞 の 密 度 効 果 に よ る増 殖 へ の 影 響 を 液 体 培 地 中 で の 二 次
元 環 境 で 検 証 して き た が 、 こ れ と比 較 す る 目的 で 寒 天 培 地 中 で の 二 次 元 環
境 で の 検 討 を 行 っ た 。 寒 天 培 地 上 に 細 胞 が 多 く存 在 す る と 、 そ れ ぞ れ の コ
ロ ニ ー が 育 ち 難 い こ と は 経 験 的 に 知 られ て い る 。 そ の 要 因 が 、 養 分 の 取 り
合 い に あ る の か 、 揮 発 性 物 質 を 介 した 細 胞 同 士 の コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン に あ
る の か は 結 論 が 出 て い な い 。 そ れ を 検 証 す る た め に 、 シ ャ ー レー つ に 10
細 胞 、 100細 胞 を そ れ ぞ れ 播 種 し 、 そ の 後 の コ ロ ニ ー の 生 育 を 観 察 した 。
そ の 結 果 、 100細 胞 の も の で は 10細 胞 の も の に 比 べ て 明 ら か に コ ロ ニ ー
の 成 長 阻 害 が 認 め られ た (図 52)。
ま た 、 栄 養 源 補 給 の差 が成 長 に影 響 を
も た ら して い る も の か 検 証 す る 目的 で 、 シ ャ ー レ を 薄 い プ レー トに て 完 全
に 半 分 に 分 断 し 、 栄 養 源 の 干 渉 が な い 環 境 を 整 え (空 気 層 に お い て は 遮 断
され て い な い )、
片側 に
10細 胞 を 播 種
播 種 した 。 そ の 結 果 、 細 胞 数 が 多 い 程
し、 そ の 隣 に
10,100,1000細 胞 を
10細 胞 の コ ロ ニ ー の 生 育 が 阻 害
さ
れ た 。 こ の こ と は 、 酵 母 が 増 殖 し て い く過 程 で 発 生 す る 揮 発 性 物 質 が 、 他
87
の 酵 母 細 胞 の 増 殖 に 悪 い 影 響 を 与 え て い る こ と が 示 唆 され 、 コ ロ ニ ー 数 の
変 化 に よ る コ ロ ニ ー サ イ ズ ヘ の 影 響 は 、 栄 養 源 補 給 よ り揮 発 性 物 質 の 影 響
が 強 い こ と が 考 え られ る 。同 様 な こ と は 、二 次 元 環 境 に お い て も想 定 され 、
密 度 効 果 に よ り も た ら され る 増 殖 へ の 影 響 の 元 凶 の 一 つ か も し れ な い 。
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
100
0
1234567
12
12
10-10(L)
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
10‐
10
￨
]-t-
10(R)
s288c
10-
looo
R
*'re
ＥＥ Ｕ 回
10-10
-10-10
L
L
10- 1000
-
￨
￨
￨
::互
100
≡
:I≡≡
≡
≡
萱
菫
厖
璽
====
0
3
4
3
5
52
5
平均値の比較
培 養 日数
図
4
寒 天 培 地 中の コ ロニ ー に及 ぼす ガ ス の影 響
コ ロ ニ ー の 大 き さ は 画 像 解 析 ソ フ トを 用 い て 行 つ た 。 重 な つ た コ ロ
ニ ー は 計 数 対 象 か ら外 した 。
88
一 方 、 出芽 酵 母 にお い て 、 窒 素 源 の 制 限 に よ り誘 導 され る酵 母 形 態 か ら
繊 維 状 形 態 へ の 変 換 に ア ンモ ニ ウ ム トラ ン ス ポ ー タ ー が 関 与 して い る
(Lorenz θι′■,1998、 Smith θι′■,2003、 Biswas θι′ヱ,2005)。 この ア
ンモ ニ ウ ム トラ ンス ポ ー タ ー は 1994年 に 出芽 酵 母 と シ ロイ ヌ ナ ズ ナ か ら
遺 伝 子 が 初 め て ク ロー ニ ン グ され た 。 ま た 、 ア ンモ ニ ウ ム トラ ンス ポ ー タ
ー の 通 路 は 、疎 水 性 で あ り NH4+は 通 さず NH3を 選 択 的 に透 過 させ る と推
測 され 、 ア ンモ ニ ウ ム トラ ン ス ポ ー タ ー は ガ ス チ ャネ ル で あ る と提 唱 され
た (Khademi θι′■,2004、 Zheng θι′■,2004)。 さ らに 、 ア ンモ ニ ア が
コ ロニ ー 間 の シ グナ ル 分 子 と して 働 く こ とが提 唱 され て い る (Palkova et
al.,2003)。 出芽 酵 母 にお い て ア ンモ ニ ウ ム が K+チ ャネ ル を介 して細 胞 内
。
に入 る こ とを示 唆 す る報 告 が な され て い る (Hess θι′′
,2006)。 さ らに分
裂 酵 母 で の 報 告 で は あ るが 、3つ の ア ンモ ニ ウ ム トラ ンス ポ ー タ ー (22ι 」
Z,′ ″′ ∠,′ ″′
θ∠)を ノ ッ ク ア ウ トした株 で は 、 低 ア ンモ ニ ウ ム 培 地 に
お け る生 育 が 野 生 株 よ り非 常 に遅 い こ とが 報 告 され て い る (Mitsuzawa,
2006)
89
4
考察
増 殖 に 伴 い 栄 養 源 が 減 少 し、増 殖 活 動 で 生 じた 排 泄 物 が 増 加 す る 対 数 増
殖 後 期 以 降 で は 、す で に細 胞 に とつ て 強 い ス トレス が 始 ま っ て い る と考 え
られ る。 さ らに 、 そ の ス トレス に どれ ほ ど耐性 が あ る か は 、 定 常 期 の 細 胞
濁 度 、 お よび そ の 後 の 長 期 培 養 中 の 細 胞 生 存 率 に も反 映 され る と考 え られ
る。 対 数 増 殖 期 で の 増 殖 速 度 、定 常 期 の 細 胞 濁 度 、 定 常期 7日 後 に お け る
生 存 率 の 三 者 に 相 関 が あ る の か 検 証 す るた め に 、本 章 と第 二 章 で 用 い た 株
の デ ー タ を該 当す る グ ラ フ に ま とめ て 表 示 した (図 53)。
この 内 、 A群
(S288C,BY4741,7カ ″ И)で は 増 殖 状 況 、 生 存 状 況 とも
に 良好 で あ つ た 。 細 胞 が 小 型 で 増 殖 が 遅 れ る ″力″ ∠にお い て も同様 な 傾
r2/1)で は
向 を示 した 。 ま た 、 B群 (sο 力θZl,ろ υどθИ,ん ″ Z,yο ′IИ ,θ ゴ
遅 延 的 に生 存 率 の 低 下 が 認 め られ た 。み″ごθ∠にお い て は 出芽 中 の 細 胞 死 が
多 数 認 め られ 、 他 の株 と比 較 し早 期 に生 存 率 の 低 下 が 認 め られ た 。 C群
′ゴ∠,sα ´ ∠,″′■′∠)で は細 胞 の 消 滅 が 他 の 群 と比 較 して 早 期 に 現
(θ ο
れ 、増 殖 状 況 にお い て も常 に悪 い も の で あ つ た 。 これ らの 違 い は 、 生 息 環
境 に よ る適 応 能 力 の 差 と考 えた 。 と りわ け影 響 を 受 け た株 は ROSに 高感
受 性 の も の で あ り、別 な 見 方 をす れ ば 、ROSが 及 ぼ す 細 胞 へ の ス トレス が
特 に強 い こ とを示 して い る と も い え る。 なお 参 考 の た め 、本 研 究 に用 い た
変 異 株 の ROSと 今 回用 い た 変 異 株 の 変 異 遺 伝 子 との 関係 を 図 54に 示 した 。
90
B
S288C
一
BY4741
一
§８ ︶Ц興
︵
。 wわ ′
54
-SC力
9乙
口 sOdイ 4
- sod24
ツ
o mρ 々′4
日 bυ d“
′ fob′ 4
o ycaイ 4
・ S′r24
21
24
27
培 養 時 間 (hr)
100
A
B
90
80
C
０ ０ ０
６ ５ ４
Ｓ 掛母畑
S288C
一
― E― BY4741
-● ― w力 ′
54
● scわ 94
-Sο
σ′4
mpkl
A
-E― sOσ 24
-mpた
30
′4
０ ０ ０
２ １
■ わυd64
゛ fobイ ム
l day
▲
ycaf4
日
siρ△
3 days
培養 日数
5 days
7 days
53
本 研 究 に 用 い た 出 芽 酵 母 の 増 殖 状 況 と生 存 率 の 変 化
上 段 に 第 二 章 、 第 二 章 に て 用 い た 出 芽 酵 母 の 増 殖 状 況 を 示 す (US356
は 割 愛 )。 大 き く分 け て 3つ の パ タ ー ン と な っ た (矢 印 )。 下 段 に こ の
図
パ タ ー ン に よ る 色 分 け を加 え た 生 存 率 で の 比 較 を 示 す 。A群 で は 増 殖 状
況 、生 存 状 況 と も に 良 好 で あ つ た 。B群 で は 遅 延 的 に 生 存 率 の 低 下 が 認
め られ た 。 C群 で は 早 期 に 生 存 率 の 低 下 が 認 め られ た 。
91
←
M b卜
呻
上
︱国
ｌ ψ
―嘔
″
イ
“
“
胤l需 :電
aged
Bud6-septin barier
DNA, protein and lipid
54
︲
ａ︰
上一
︲
Ｃ
Ｙ
図
本 研 究 に用 い た株 の 作 用 点
″″ ゴ∠ ,Sθ ごゴ∠ ,sθ ご2∠ ,yθ ′ゴ∠ ,sir2∠ ,わ υごδ∠ の
作 用 点 を示 す 。
92
第 四節
1
出 芽 抑 制 お よ び細 胞 死 を誘 発 す る物 質 の 特 定
は じめ に
第 一 節 に て 栄 養 源 飢 餓 に よ る影 響 、 第 二 節 にて 活 性 酸 素 に よ る影 響 、第
二 節 に て 密 度 効 果 /そ の 他 に よ る影 響 に つ い て 記 述 した 。 第 一 節 で は グル
コ ー ス に起 因 した 阻 害 物 質 が 存 在 して い る こ とを示 した 。 第 二 節 で は活 性
酸 素 が 増 殖 抑 制 に 強 く影 響 し、細 胞 死 も誘 発 す る こ とを示 した 。 第 二 節 で
は老 化 、寿 命 関連 遺 伝 子 を欠 損 した 変 異 株 で は短 命 で あ る こ と、 細 胞 構 築
に 関与 す る 鬱
K■ 遺 伝 子 を欠 損 した 変 異 株 にお い て 、早 期 に ア ポ トー シ ス
が 誘 発 され る こ とを示 した 。
本 節 で は 、 こ れ ま で の 検 討 に て 得 られ た 現 象 、す な わ ち対 数 増 殖 中期 か
ら定 常 期 にお け る娘 細 胞 の 連 続 的 な 増 加 、 一 過 性 の 老 齢 細 胞 の 死 、 長 期 定
常 期 培 養 にお け る娘 細 胞 と老 齢 細 胞 の ア ポ トー シ ス 、 これ らを誘 発 す る原
因物 質 の 特 定 を 目的 に 検 証 を加 えた 。検 証 は 、培 養 1日 目お よび 6日 目の
細 胞 懸 濁 液 を用 い 、 そ の上 澄 み 液 (酵 母 培 養 上 清 )お よび 酵 母 細 胞 を抽 出
/分 画 した 画 分 か ら、 出芽 抑 制 を促 す 物 質 お よび 細 胞 死 を 誘 発 す る物 質 の
特 定 を試 み た 。評 価 は 、抽 出液 を添 加 した 場 合 で の 増 殖 性 (濁 度・ 細 胞 数 )
へ の 影 響 、娘 細 胞 出現 頻 度 (出 芽 抑 制 の 確 認 )、 ア ポ トー シ ス 発 生 頻 度 (細
胞 死 誘 発 の 確 認 )に て 行 つ た 。 そ の 結 果 、特 定 の 分 画 中 に 出芽 抑 制 お よび
細 胞 死 を 誘 発 す る活 性 を も つ も の が 存 在 し、活 性 物 質 の 同 定 が 可 能 で あ る
こ とを 見 出 した 。
93
2 材 料 お よび 方 法
(1)使 用 株
出芽 酵 母 は
を表
S288Cを 用 い た 。 S288Cの Genotypeお
よび 遺 伝 子 の 機 能
7お よび 表 8に 示 した 。。
(2)使 用 培 地
SC合 成 培 地 を用 い た
〔
組 成 は 第 二 章 3(2)を 参 照 〕。
(3)培 養 条 件
抽 出 /分 画 の た め の 培 養
成培地 に
:2,000 mL(三
角 フ ラ ス コ に小 分 け )の
S288Cを 加 え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て
SC合
1日 お よび 6日 間 振 盪
培 養 した 。抽 出 /分 画 の た め に用 い た 培 養 液 量 は 、1日 培 養 が 870 mL、
6日 培 養 が 950 mLと した 。
実 験 1:原 因物 質 を特 定 す る初 期 ス ク リー ニ ン グ と して 実 施 した 。20 mL
用 の 試 験 管 に 2 mLの SC合 成 培 地 を加 え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て振 盪
培 養 した 。播 種 酵 母 数 は 、前 培 養 (約
22時 間 )し た 酵 母 を濁 度 (OD600)
01に 調 整 し加 えた 。
実験
2:原 因 物 質 を 詳 細 に セ レ ク トす るた め に 実 施 した 。 20 mL用 の 試
2 mLの SC合 成 培 地 を加 え 、 30℃ の 培 養 器 内 に て 振 盪 培 養 し
た 。 播 種 酵 母 数 は 、 前 培 養 (約 22時 間 )し た 酵 母 を 1× 106/mLに 調
験管 に
整 し加 えた 。
(4)抽 出 /分 画 液 の 採 取
(図 55)
。1日 お よび 6日 間 振 盪 培 養 した 細 胞 懸 濁 液 を遠 心 分 離 し、上 澄 み 液 (酵
母 培 養 上 清 )と 酵 母 細 胞 に 分 離 した 。
〔酵 母 培 養 上 清 か ら の 抽 出 /分 画 〕
・ 酵 母 培 養 上 清 を等 量 分 配 (各 435 mL)し 、 そ の 一 方 を 、 分 液 漏 斗 を
用 い て ヘ キ サ ンで 液 ―液 分 配 した 後 、 酢 酸 エ チ ル で 液 ―液 分 配 した 。
得 られ た ヘ キサ ン 可溶 部 、 酢 酸 エ チ ル 可溶 部 を エ バ ポ レー タ ー に よ つ
て 減 圧 乾 固す る こ とで 、 ヘ キ サ ン層 、酢 酸 エ チ ル 層 を得 た 。 水 可 溶 部
は 凍 結 乾 燥 に供 しt濃 縮 し水 層 を 得 た 。
・ も う一 方 は 、 凍 結 乾 燥 後 、 Spectra/por 3 Dialysis Membrane MWCO:
3500の 透 析 膜 を用 い て 一 晩 透 析 (二 回 )し た 。 この 透 析 膜 に よ つ て 分
子 量 3500以 上 の 化 合 物 と以 下 の 化 合 物 を 分 離 した 。
94
〔
酵 母 細 胞 か ら の 抽 出 /分 画 〕
・ 酵 母 細 胞 を等 量 分 配 し、 そ の 一 方 を、 固 ―液 分 配 で ヘ キ サ ン層 、 酢 酸
エ チ ル 層 に 分 取 した 。 ま た 、両 層 に 含 まれ な い も の を残 湾 Aと して 分
取 した 。
・ も う一 方 は 、 凍 結 乾 燥 後 、 酵 母 培 養 上 清 と同 じ透 析 膜 を用 い て 透 析 を
3500以 上 と以 下 の 物 質 を 分 離 した 。 た だ し、 3500以 上
の 画 分 の 一 部 に不 溶 物 が 認 め られ た た め 、遠 心 分 離 しこれ を残 澄 Bと
行 い 、分 子 量
した 。
(5)抽 出 /分 画 液 の 処 理
実 験 1:抽 出 /分 画 液 の 処 理 濃 度 は 、 終 濃 度 2%と
した 。 濃 度 設 定 は 溶
媒 と して 用 い た dimethylsulfoxide(DMSO)の 毒 性 を 勘 案 し設 定 した 。
実 験 1は 初 期 ス ク リー ニ ン グ と して 実 施 し、22の 全 て の 画 分 に つ い て
行 つ た 。 各 画 分 お よび 用 い た溶 媒 は 以 下 と した 。 抽 出 /分 画 液 は 培 養
開始 時 に処 理 した 。
酵母 細胞
酵母培養 上清
1‐
1‐
1‐
1‐
1‐
2‐
2‐
2‐
2‐
2‐
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
水層
3‐
(H20)
M.W.3500以
M.W.3500以
ヘ キ サ ン層
3‐
上
下
(H20)
(H20)
3‐
3‐
(DMSO)
酢 酸 エ チ ル 層 (DMSO)
ヘ キ サ ン層
水層
1
(DMSO)
3-2 酢 酸 エ チ ル 層 (DMSO)
3 残 澄 A (H20)
4 M.W13500以 上 (H20)
5 M.W.3500以 下 (H20)
6 残 澄 B(H20)
4-1 ヘ キ サ ン 層 (DMSO)
4-2 酢 酸 エ チ ル 層 (DMSO)
4-3 残 澄 A(H20)
4 MW.3500以 上 (H20)
(DMSO)
酢 酸 エ チ ル 層 (DMSO)
ヘ キ サ ン層
3‐
(H20)
MoW.3500以 上 (H20)
M.W.3500以 下 (H20)
4‐
4-5 M.W.3500以 下 (H20)
4-6 残 澄 B(H20)
実験
2‐
2:実 験 1に て 増 殖 阻 害 効 果 が 認 め られ た
1‐
1,1‐
2,1-3,1-5,2‐
2,
3,2-5に つ い て さ らに詳 細 な 解 析 を した 。 培 養 開始 時 に各 画 分 を 終
濃度
2%で 添 カロした 。 た だ し、 細 胞 毒 性
(増 殖 阻 害 )が 強 く認 め られ
た 画 分 2-3,2-5に つ い て は 、1.0,0.5,0.1%濃 度 を追 加 した 。そ の 結 果 、
2‐
3に お い て は 01%、
2‐
5に お い て は 1.0%が 至 適 な 濃 度 と判 断 され
95
た た め 、 こ の 濃 度 に お け る確 認 を 行 つ た 。
(6)濁
度 、 細 胞 数 、 出 芽 抑 制 な らび に 細 胞 死 誘 発 の 確 認
濁 度 (OD600)、 細 胞 数 の 確 認 は 、培 養 後
4時 間 毎 に 行 っ た 。出 芽 抑 制 は 、
500細 胞 中 に 含 ま れ る 娘 細 胞 の 出 現 比 率 に よ り算 出 した 。細 胞 死 の 誘 発 は 、
500細 胞 中 に 含 ま れ る ア ポ トー シ ス 細 胞 の 出 現 比 率 に よ り算 出 した 。 出 芽
痕 の 染 色 お よ び ア ポ トー シ ス の 染 色 は 、 本 章 第 二 節 の Annexin‐ V+PI+CW
の二重 染 色 改 良法 にて行 つた。
培養 1日 目酵母培養 上 清
1′
2′
酵母培養上清 (950 mL)
酵母培養上 清 (870 mL)
435 mL
435 rnL
(2
培養 6日 目酵母培養 上 清
475 rnL
475 rnL
)東 結乾 燥
i
i
500 mL)X2
凍結乾燥
運
l
:
冒
_」L」 illttl×
M.W.
M.W.
「
3500以 上 3500以
凍 結 乾 燥 EtOAC層
-2)
￨ (38.l mg′ ■
水層
(1‐ 3)
鷺
っ眈
り
2
の化合物
{46.2 mg)
14
に9656J
下
の化合 物
a3m6η
」
相 「
(2.2322g)
酵早細胞
遠心分離
(10000g′ 10 min)
EtOAC層
残漕B M.W.
{421.l mg)3500以 上
の化合物
3‐ 6
親
」
_」 illLttL×
「
遠心 分離
M. W.
3500以 下
M・ W・
3500以 下
の化合物
(273.l mg)
(142.7 mg)
3‐
男が査A
5
EtOAC層
(1.1454g)(7.4 mg)
4‐ 3
4‐ 2
残澄B
M.W.
4‐
5
{946.8 mg)3500以 上
4‐
6
の化合物
{45.6 mg)
34
55
2
の化 合物
{71.O mg)
図
培養 6日 目酵母細胞
2.2541g
:
3‐ 2
5
:
:
3‐ 3
2‐
凍結乾燥
1.6120g
残 澄A
24
酵早細胞
凍結乾 燥
{0.7156g){25.3 mg)
M. W.
3500以 下
)
{3.2829g)
4′
上
離銚)8.多群
￨{を
1‐ 5
培養 1日 目酵母細胞
3′
3500以
凍結乾燥 EtOAC層
44
抽 出 /分 画 の 流 れ 図
1日 お よ び 6日 間 培 養 した 細 胞 懸 濁 液 を 、酵 母 培 養 上 清 と 酵 母 細 胞 に 遠 心 分 離 し 、
酵 母 培 養 上 清 か ら ヘ キ サ ン 層 、酢 酸 エ チ ル 層 、水 層 、分 子 量 3,500以 上 と 以 下 の
化 合 物 を 得 た 。 ま た 、 酵 母 細 胞 か らヘ キ サ ン 層 、 酢 酸 エ チ ル 層 、 分 子 量 3,500
以 上 と 以 下 の 化 合 物 な らび に 残 澄 を 得 た 。 合 計
96
22の 画 分 を 得 た 。
3 結果
(1)実 験 1(濁 度 へ の 影 響
)
酵 母 培 養 液 を 、遠 心 分 離 に よ り酵 母 細 胞 お よび 培 養 液 上 清 に 分 け た 。 そ
の 後 、そ れ ぞ れ を 抽 出 /分 画 し 22の 画 分 を得 た (図
水 も し くは
55)。
そ れ らの 画 分 は
DMSOに 再 懸 濁 した 。 そ の そ れ ぞれ を 、 前 培 養 した 細 胞 に加
え 〔
終 濃 度 2%(v/v)〕 、そ の 後 の 増 殖 過 程 (濁 度 )を 調 べ た 。作 業 仮 説 と し
て 、 出芽 抑 制 お よび 細 胞 死 を もた らす 活 性 物 質 が そ の 画 分 に あれ ば 増 殖 が
阻 害 され る は ず で あ る と考 え た 。 そ の 結 果 、溶 媒 対 照 と比 較 して 増 殖 抑 制
が 認 め られ た も の は 、 酵 母 培 養 上 清 の 培 養 1日 目の ヘ キ サ ン層 (1‐ 1)、 酢
酸 エ チ ル 層 (1‐ 2)、 水 層 (1-3)、
酸 エ チル 層 (2-2)、 水 層 (2‐ 3)、
MoW.3500以
下 (1-5)と 培 養 6日 目の 酢
MoW3500以 下 (2-5)で
あ り、 全 て 酵 母
培 養 上 清 に あ つ た 。 中 で も、 1-1,2-3,2‐ 5は 強 い も の で あ っ た (図 56)。
一 方 、酵 母 細 胞 (ア ポ トー シ ス に て 死 滅 した 細 胞 も含 まれ る )か らの 画 分
中 に は 、増 殖 阻 害 を起 こす 活 性 は認 め られ な か つ た 。
(2)実 験 2(出 芽 抑 制 お よび 細 胞 死 の 誘 発
実 験 1で 絞 り込 ん だ 画 分
1‐
)
1,1‐ 2,1-3,1-5,2-2,2‐
3,2-5に つ い て 、 さ
らに詳 細 な 検 討 を加 え た 。 1‐ 1,1‐ 2,1‐ 3,1‐ 5,2‐ 2に つ い て は 、 実 験 1と 同
2%に 設 定 して 行 つ た 。2-3お
5に 関 して は 、実 験 1で
強 い 毒 性 が 認 め られ た た め 、 2‐ 3に つ い て は 0.1%、 2-5に つ い て は 1.0%
様 に終 濃 度 を
よび
2‐
で 確 認 した 。 そ の 結 果 、 実 験 1と 同様 に全 て の 画 分 に お い て 濁 度 の 低 下 が
認 め られ た 。 ま た 、細 胞 数 の 減 少 も認 め られ た (図 57)。 培 養
12時 間後 に
Annexin― V+PI+CW染 色 し、娘 細 胞 出現 率 に よ る 出芽 抑 制 の 確 認 、 ア ポ ト
ー シ ス 細 胞 の 出現 率 に よ る細 胞 死 誘 発 の 確 認 を行 っ た 。 そ の 結 果 、 ア ポ ト
ー シ ス 出現 率 に つ い て は 図 59Aに 示 す よ うに 、画 分 1‐ 3お よび 2‐ 3に 強 い
58に 示 した )。 娘 細
胞 出 現 率 にお い て は 図 59Bに 示 す よ うに 、 1‐ 2,1-3,1‐ 5が 特 に強 く、 2-3,
誘 発 作 用 が 認 め られ た (代 表 的 な細 胞 死 誘 発 画 像 を図
2-5も 弱 い な が ら影 響 され て い た 。細 胞 周 期 へ の 影 響 にお い て は 図
示 す よ うに 、 1‐ 1,2‐ 3で
S期 細 胞 の 割 合 が 増 加 した 。
97
59Cに
§８ ︶撻興
︵
-0-1‐ lD
引蟄峰 1-2D
― 酵母培養 上 清 (1日 後 )
-1-3H
+1-4H
゛ 1-5H
DMSO
一
―o― H20
0
10
-2-lD
一哺
憂… 2-2D
-2-3H
.-2-4H
8
6
― 酵母培養 上 清 (6日 後 )
―七作
◇
2-5H
DMSO
一
―o― H20
4
2
0
0
4
10
丁甘■Ｌ
8
6
4
2
0
8
12
16
20
-0-3… lD
3-2D
-3‐ 3H
+3-4H
‐
―
・
ン ー3-5H
ム 3-6H
DMSO
一
H20
―
L」
一 酵母細胞 (1日 後 )
04812162
10
8
6
4
-4-lD
―
B-4‐ 2D
3H
-4‐
―E-4‐ 4H
―くトー4‐ 5H
▲ 4‐ 6H
DMSO
一
―●― H20
― 酵母細胞 (6日 後 )
2
0
8
12
培 養 時 間 (hr)
図
56
各 画 分 の 増 殖 濁 度 へ の 影 響 。 酵 母 培 養 上 清 か ら得 た
細 胞 か ら得 た
10画 分 お よ び 酵 母
12画 分 の 増 殖 濁 度 へ の 影 響 を示 す 。 溶 媒 と比 較 し濁 度 の 低 下 が あ
る 場 合 、 出 芽 抑 制 あ る い は 細 胞 死 が あ る も の と推 察 す る 。
98
日 1-52.00/。
３ ２ １
§８ ︶撻唄
︵
-0-1-12.0%D
1-22.0%D
・1-32.0%H
…
―
H
-2-22.0%D
-2-3
0.10/OH
―▲.2-51.0%H
DMSO
―
H20
―
0
︵
崚日
黙ｍ
幸
コＥ＼∞
〇一× ︶ 一
1.000
2.0%D
2.0%D
2.0%H
日 1-5 2.0%H
2.0%D
-2-2
A 2‐ 51.0%H
‐●DDMSO
H20
―
-1-1
-1‐
-1-3
0.100
2
0.010
4
培 養 時 間 (hr)
図
57
各 画 分 の 増 殖 濁 度 お よび 細 胞 数 へ の影 響
.
酵 母 培 養 上 清 か ら得 た
7画
分 の 増 殖 濁 度 へ の 影 響 お よ び 細 胞 数 へ の 影 響 を 示 す 。溶 媒 と比 較 し 、い ず れ の 画
分 も濁 度 ・ 細 胞 数 と も に 低 下 が 認 め られ た 。
﹁ 引
／
０
２ ご Ｈ
1… 3
′
図
58
代 表 的 な細 胞 死誘 発 画像
.
緑 色 が 強 い 細 胞 は 初 期 ア ポ トー シ ス 、 橙 色
は 終 期 ア ポ トー シ ス 、赤 色 は ネ ク ロ ー シ ス 、青 色 は 出 芽 痕 を 形 成 す る キ チ ン 質 が
染 ま っ て い る 。 左 の 溶 媒 に 対 し、 右 の 1-3(培 養 1日 目 の 水 層 )で は 約 8 倍 の ア
ポ トー シ ス が 誘 導 され て い る 。
99
A
Apoptosis
%"
■8.0
■6.0
■4.0
■2.0
■0.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
B
2-5
DMSO Water
2-5
DMSO Water
〔娘 /全 細 胞 〕%
85.0
80.0
75.0
70.0
65.0
60.0
55.0
50.0
2-2
．
∞
５．
９
。．
９
G
５．
８
。．
８
５．
７
。．
７
５．
６
。．
６
５．
５
。．
５
2-5
図
度
59
各 画 分 の 出 芽 抑 制 お よび 細 胞 死 誘 発 へ の 影 響 .
(A)に
2‐
Water
ア ポ トー シ ス の 出 現 頻
よ り細 胞 死 の 誘 発 を 、 全 細 胞 数 に 占 め る娘 細 胞 の 比 率
芽 抑 制 を 、各 細 胞 周 期 細 胞 の 比 率
お よび
DMSO
(C)か
(B)に
よ り出
ら細 胞 周 期 へ の 影 響 を 調 べ た 。画 分 1-3
3に 強 い ア ポ トー シ ス 誘 発 作 用 が 認 め られ た 。娘 細 胞 出 現 率 に お い て は 、
1-2,1‐ 3,1‐ 5が 特 に 強 く、 2‐ 3,2… 5も 弱 い な が ら影 響 され て い た 。 細 胞 周 期 へ の
影 響 で は 、 1-1,2‐ 3で
S期 細 胞 が 増 加
した 。
100
4
考察
第 二 章 で 認 め られ た 、少 子 化 パ ラ ドック ス 、 セ パ レー シ ョン 、選 択 的 細
胞 死 を 誘 導 す る物 質 の 特 定 に 向 け て 、培 養 後 の 細 胞 懸 濁 液 の 画 分 を用 い て
出芽 抑 制 お よび 細 胞 死 を 誘 発 す る活 性 を 測 定 した 。 最 終 的 な物 質 の 特 定 に
は 至 っ て い な い が 、 そ の 候 補 とな る画 分 を い くつ か 見 出 した 。 中 で も、 酵
母 培 養 上 清 を ヘ キ サ ン と酢 酸 エ チ ル に て 抽 出 /分 画 した 後 に 得 られ る水
層 にそ の 原 因 物 質 が 含 ま れ て い る可 能 性 が 強 く示 唆 され た 。 ま た 、分 子 量
3500以 下 の 物 質 の 中 も疑 われ た 。 ア ポ トー シ ス に つ い て は 培 養 6日 目の
酵母培養 上清
養上清
(1‐
(2‐
3)で 最 も強 い 作 用 を示 し、 次 い で 培 養
1日 目の 酵 母 培
3)が 強 い も の で あ つ た 。 これ は 同様 な物 質 が 作 用 し、そ の 強 弱
は 、 定 常 期 培 養 の 進 行 に 伴 う蓄 積 量 の 差 に よ る の か も しれ な い 。 一 方 、分
子 量 3500以 下 の 画 分 (1‐ 5,2‐ 5)で は 娘 細 胞 出現 率 が 高 い も の で あ つ た 。
特 に 、 培 養 1日 目の 画 分 にお い て そ の傾 向 が 強 い も の で あ っ た 。
これ ら の こ とか ら、 出芽 抑 制 を示 す 原 因物 質 は 分 子 量
3500以 下 の 画 分
に 、 ま た 細 胞 死 を 誘 発 す る物 質 は水 層 に あ る も の と推 察 す る。 さ らに 、分
画 中 にそ の 活 性 が 失 われ な か つ た こ とか ら比 較 的 安 定 性 の 高 い 物 質 で あ
る こ と、水 溶 性 の 物 質 で あ る こ と、分 画 後 の 溶 媒 除 去 過 程 に も失 わ れ な か
った こ とか ら揮 発 性 物 質 で あ る可 能 性 が 低 い こ と、 な どが 示 唆 され た 。
一 方 、 多 細 胞 生 物 にお け るア ポ トー シ ス は 、組 織 /個 体 の た め の 計 画 的
な細 胞 死 とな る。 これ に対 し、 単 細 胞 生 物 で は 、個 の 集 団 を組 織 と して捉
え るか 、 そ れ と も単 な る集 ま り と考 え る か で 、 そ の 解 釈 が 大 き く異 な る 。
単 な る集 ま り と考 え た 場 合 、計 画 的 な細 胞 死 は 存 在 しな い こ と とな る 。 し
か しな が ら、 ア ポ トー シ ス の 発 現 /進 行 機 序 は 多 細 胞 生 物 と同様 で あ り、
組 織 的 な 反 応 と解 釈 す る こ とが で き る。 ま た 、 同 じ く単 細 胞 生 物 で あ る粘
菌 の 行 動 パ タ ー ン を見 る と、驚 くほ どの 統 制 的 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョン が な さ
.,2006)。 さ
れ て い る こ とが 分 か る (Smirnov et al.,2005、 Schaap θι′′
らに 、 出芽 酵 母 にお い て も、 ア ンモ ニ ア が コ ロ ニ ー 間 の シ グナ ル 分 子 と し
て 働 き 、寒 天 培 地 上 にお け る細 胞 増 殖 抑 制 に 関与 して い る こ とが 報 告 され
て い る (Palkova θ′′ム,2003)。
これ らの 事 か ら、 出芽 酵 母 に お い て も組
織 的 な 対 応 が な され て い る も の と考 え 、 ア ポ トー シ ス に 関 して も、 これ ま
で に 報 告 は な され て い な い も の の 、 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョン を担 う物 質 が 存 在
す る の で は な い か と考 え る。
本 実 験 にお い て 、 ア ポ トー シ ス を誘 導 す る活 性 を持 つ 物 質 は 、培 養 液 上
101
清 に 存 在 し、細 胞 画 分 に は 存 在 しな い こ とが 明 らか とな つ た 。 ア ポ トー シ
ス が盛 ん に進 行 して い る培 養 6日 後 にお い て も同様 で あ っ た 。 ア ポ トー シ
ス を起 こ した 細 胞 の 細 胞 内容 物 は 培 地 中 に 放 出 され る (そ れ が 残 りの 生 細
胞 の 栄 養 に積 極 的 に使 われ る と考 え られ て い る )。 培 地 中 の ア ポ トー シ ス
誘 導 活 性 物 質 の 濃 度 と 、そ れ に よ り誘 導 され る死 細 胞 の 数 に は 相 関 関係 が
あ る と期 待 で き る。 加 えて 、最 終 的 に は 、 あ る一 定 の 割 合 の 細 胞 は 生 き残
らな くて は な らず 、 ど こか で ア ポ トー シ ス が 終 燎 す る よ うな機 構 を有 して
い る と期 待 で き る。 ア ポ トー シ ス 誘 導 活 性 物 質 が 、 生 細 胞 か ら培 地 中 に 分
泌 され た も の か 、 ア ポ トー シ ス で 死 ん だ細 胞 の 内容 物 由来 の も の で あ る の
か は 現 在 の と こ ろ 明 らか で は な い 。 前者 の 場 合 、 生 細 胞 か らそ の 物 質 の 産
生 ・ 分 泌 が 徐 々 に進 行 し、 培 地 中 に 蓄 積 し続 け る こ とで濃 度 が 上 昇 し、 細
胞 死 が 誘 導 され る こ とが 想 定 され る 。 この 場 合 、 定 常 期 が 長 期 化 す れ ばす
る ほ ど生 細 胞 の 数 が 減 少 し、 ア ポ トー シ ス 誘 導 物 質 の 濃 度 の 下 が り、結 果
と して 細 胞 死 の 誘 導 も抑 制 され 、 あ る 一 定 割 合 の 細 胞 が 生 き延 び る こ とが
期 待 され る。 一 方 、後 者 の 場 合 、 死 細 胞 が 増 えれ ば 増 え る程 、集 団 中 の 細
胞 の ア ポ トー シ ス が加 速 度 的 に促 進 され 、 生 細 胞 が残 れ な い こ とが 予 想 さ
れ る。 これ らを考 え 合 わせ る と、 生 細 胞 か ら分 泌 され た物 質 で あ る可 能 性
が 高 い も の と考 え られ る。
い ず れ の 場 合 に して も、分 裂 年 齢 ご とに そ れ に対 す る感 受 性 が 異 な るた
め 、分 裂 年 齢 ご と の 細 胞 の ア ポ トー シ ス に 関す る振 舞 い 方 が 異 な っ て い る
と考 え られ る。 今 後 の 研 究 に よ り物 質 が 同 定 され れ ば 、 そ の 現 象 とそ の 機
構 の 解 明 が 大 き く進 展 し、 研 究 上 の イ ン パ ク トは 非 常 に 高 くな る。 現 在 、
活 性 の あ つ た 画 分 を さ らに細 か く分 画 して い る と こ ろ で あ るが 、 い ず れ は
原 因 とな る物 質 の 同定 を した い と考 えて い る。
０々
ｎυ
章
終
総括
103
1
結論
20世 紀 が 物 理 学 や 化 学 の 時 代 だ つ た とす れ ば 、 21世 紀 は正 に生 物 学 の
時代 だ とい え る。 特 に 、 ゲ ノ ム の 解 析 が な され て か らは 爆 発 的 な進 展 が な
され 、 と りわ け生 命 科 学 へ の 期 待 が 大 き い 。 ま た 、 生 物 学 へ の ア プ ロー チ
の 方 法 に つ い て も、 これ ま で の 実 験 科 学 的 手 法 の み で は な く、数 理 解 析 に
よ る シ ミ ュ レー シ ョン 分 析 も盛 ん に行 われ る よ うに な っ て きた。 中 で も生
態 学 は 、数 理 的研 究 が 最 も進 ん だ 分 野 とい え 、 Lotka― Volterra方 程 式 に代
表 され る よ うな 数 理 モ デ ル の 理 論 が 定 式 化 され 、 フ ィ ー ル ド研 究 の 推 進 に
指 針 を与 え て き た 。 さ らに 、1970年 代 に入 つ て か らは 、行 動 生 態 学 に お け
る最 適 化 理 論 、 ゲ ー ム 理 論 な どが研 究 され 、実 験 科 学 的 手 法 で は 答 え を得
る こ とが 困難 な事 象 に つ い て も成 果 を あ げ て き た 。
本 研 究 で は 、 出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 動 確 認 を生 態 学 の一 部
と して 捉 え 、 そ の 挙 動 を実 験 と理 論 とで 比 較 した 場 合 で の 、数 理 解 析 の 可
能 性 を確 認 す る こ とを主 の 目的 と して 行 つ た 。 実 験 に よ る解 析 にお い て は 、
これ ま で の 実 験 手 技 を大 幅 に 改 良 し、算 定 漏 れ が ほ とん どな く、 か つ 評 価
した 像 の 保 存 性 を 確 保 す る方 法 を確 立 した 。 ま た 、 この 手 法 を用 い る こ と
で 精 度 の 高 い 解 析 が 可 能 とな つ た 。
第 二 章 に示 した よ うに 、 泰 中 らが 報 告 した 格 子 気 体 モ デ ル に Three‐
stageモ デ ル を拡 張 した 方 法 は 、 実 験 結 果 の 再 現 シ ミ ュ レー シ ョン に 有 効
に機 能 した 。 ま た 、 実 験 結 果 と数 理 予 測 とに ズ レが 生 じた が 、 こ の ズ レの
原 因 を細 胞 消 滅 と仮 定 し、 モ デ ル に細 胞 消 滅 条 件 を加 え た と こ ろ 、 実 験 値
と理 論 値 とに近 似 を 得 る こ とが で き た 。 そ の 結 果 と して 、0.8%未 満 とい う
実 験 で は確 認 す る こ とが 困難 な低 い レベ ル で の 細 胞 消 滅 の 出現 を捕 え る
こ とが で き た 。 ま た 、 この 結 果 を加 味 して 詳 細 な 実 験 を行 つ た と こ ろ 、 同
様 な細 胞 消 滅 が 確 認 で きた。 さ らに 、増 殖 に 伴 うア ポ トー シ ス の 発 生 状 況
を確 認 した とこ ろ 、第 二 章 に示 した よ うに 、活 性 酸 素
(ROS)が
大 き な影
響 を示 して い る こ と、 ま た そ の 影 響 を さ らに強 め る要 素 と して 、 MAPキ
ナ ー ゼ 1に 起 因 した 細 胞 膜 の 不 均 衡 な状 態 が 存 在 して い る こ とが 強 く示 唆
され た 。 さ らに 、そ の
MAPキ ナ ー ゼ
1に 対 す る影 響 も ROSが 関 与 して い
る こ とが 予 測 され た も
ま た 、 これ ま で に行 われ て き た 酵 母 の 寿 命 確 認 方 法 に つ い て は 、 分 裂 寿
命
(RLS)で 個 の ポテ ン シ ャ ル と して の 寿 命 を 、 経 時 的 寿 命 (CLS)で 集
団 と して の 寿 命 が 確 認 され て きた。 しか しな が ら、集 団 内 で の 個 の 寿 命 に
104
つ い て は不 明 の ま ま で あ っ た 。 本 研 究 で は 、集 団 内 で の 世 代 構 成 を緻 密 に
分 析 す る こ とで 、 ス テ ー ジ 毎 の 影 響 確 認 を よ り詳 細 に 観 察 す る こ とを可 能
と した 。 さ らに 、 細 胞 死 を形 態 学 的 に確 認 す る方 法 と して 、 これ ま で 行 わ
れ て き た ア ポ トー シ ス 染 色 に よ る 分 染 と形 態 学 的 特 徴 に よ る 分 類 に加 え 、
出芽 痕 を染 め る染 色 法 を重 ね る こ とで 、 ス テ ー ジ 毎 の ア ポ トー シ ス・ ネ ク
ロー シ ス の 特 定 も可能 とな つ た 。 こ の こ とか ら、本 研 究 に よ つ て モ デ ル 生
物 と して の 出芽 酵 母 の 役 割 が さ らに深 ま っ た も の と考 え る。
一 方 、 い ま 一 つ の 研 究 目的 と した 、密 度 効 果 を示 す 物 質 の 特 定 に つ い て
は 、炭 素 源 で あ る グ ル コー ス 由来 の 代 謝 産 物 を想 定 して い た が 、 現 時 点 に
お い て そ の 証 拠 を 得 る に は 至 っ て い な い 。 実 験 に さ らな る 工 夫 を加 え る こ
と と、 窒 素源 を 涸 渇 す る こ とで 一 過 性 の 出芽 が 現 れ 、 そ の 後 停 止 状 態 に な
る との 報 告 が あ る こ とか ら、 窒 素 源 に よ る影 響 も重 ね て 検 討 す る必 要性 を
感 じた 。 ま た 、 二 次 元 環 境 (寒 天 培 地 上 )に よ る検 討 に お い て ガ ス 状 物 質
(具 体 的 に は ア ンモ ニ ア を想 定 )が 明 らか に 増 殖 阻 害 を示 す こ とを 観 察 ・
確 認 した 。 二 次 元 環 境 (培 養 液 中 )に お い て も 同様 な代 謝 産 物 が 影 響 して
い る こ と も考 え られ る。 さ らに 、 物 質 を特 定 す る 目的 で 培 養 1日 日、 6日
日の 細 胞 懸 濁 液 を 素 に 、 上 澄 み 液 (酵 母 培 養 上 清 )と 酵 母 細 胞 で の 抽 出 /
分 画 を行 つ た 結 果 、 出芽 を 抑 制 す る物 質 、 ア ポ トー シ ス を誘 発 す る物 質 と
も に 酵 母 培 養 上 清 に あ り、 酵 母 細 胞 で は 細 胞 増 殖 に 影 響 を 与 え な か つ た 。
酵 母 培 養 上 清 で は 、 ヘ キ サ ン と酢 酸 エ チ ル にて 抽 出 した 残 りの 水 層 に 存 在
す る物 質 が 出 芽 抑 制 に 、 ま た 凍 結 乾 燥 後 に透 析 に て 得 られ た 分 子 量 3500
以 下 の 物 質 が ア ポ トー シ ス の 誘 発 に 関 与 して い る と考 え られ た 。 原 因物 質
の 特 定 に つ い て は 、研 究 進 行 中 で あ る。
加 え て 、 実 験 に よ る世 代 構 成 確 認 手 法 を用 い て 解 析 した 結 果 、 増 殖 に伴
い 娘 細 胞 の 比 率 が 増 カロす る こ と (少 子 化 パ ラ ドック ス 、 Tainaka θι′′
,
2006)お よび 娘 細 胞 の 出 芽 が 抑 制 され 母 細 胞 の 出 芽 が 抑 制 され な い こ とか
ら起 こ る 二 極 化 現 象 (セ パ レー シ ョン 、新 た な知 見 )を 認 め た 。 これ ら の
現 象 が 起 こ る機 序 と して 、娘 細 胞 と母 細 胞 の 生 息 環 境 に 対 す る適 応 能 力 の
差 が 関 与 して い る こ とが 想 像 され る。 長 期 定 常 期 培 養 中 にお け る ア ポ トー
シ ス が どの よ うに 誘 導 され るか は ま だ十 分 に 解 明 が進 ん で い な い が 、ROS
が 一 因 で あ る こ とは
,ο グ
f∠
お よび sα ″∠で ア ポ トー シ ス が 増 加 す る こ と
か ら示 唆 され る。 そ れ を踏 ま えて 考 え る と、 セ プ チ ン カ ラ ー に 異 常 を も ち
娘 細 胞 へ の 物 質 移 行 が 正 常 に な され ず 老 廃 物 の 選 別 が で き な い ら″ごθ∠ に
105
お い て 、 出芽 中細 胞 の ア ポ トー シ ス が 顕 著 で あ っ た こ とは 、娘 細 胞 に 渡 さ
れ る 傷 付 い た タ ン パ ク 質 等 が ROSの 発 生 源 とな つ て い るか 、 も し くは
ROSの 効 率 的 な消 去 の 妨 げ に な つ て い る こ とが 想 定 され る。加 え て 、細 胞
壁 強 靭 チ ェ ック ポ イ ン トが 損 な わ れ て い る ″p″
Zで ア ポ トー シ ス が 増 カロ
した こ とよ り ROSの タ ー ゲ ッ トが細 胞 壁 で あ る こ とが 想 定 され る。 さ ら
7カ ″ ∠で 娘 細 胞 の ア ポ トー シ
に 、 G1/S進 行 が 時 期 尚早 に起 こ っ て しま う 予
ス が 強 く認 め られ た こ とか ら、ROSに よ る ア ポ トー シ ス 誘 導 が 娘 細 胞 に よ
り強 く作 用 す る こ とが示 唆 され た 。
あ る 一 定 数 の 細 胞 の ア ポ トー シ ス は 単 細 胞 生 物 の 生 き残 り戦 略 と捉 え
る こ とが で き る。 ア ポ トー シ ス 実 行 に 関 与 す る caspaseを 欠 損 した ′勉ゴ
∠は 、長 期 定 常期 培 養 の 短 期 的 に は ア ポ トー シ ス が 抑 制 され るが 、長 期 的
に は 逆 に ア ポ トー シ ス が 促 進 され て しま う。 これ は 、 あ る時 期 に 一 定 の 割
合 の 細 胞 で ア ポ トー シ ス が 起 こ る こ とが残 りの 細 胞 の 生 存 に は重 要 で あ
る こ とを強 く示 唆 す る。 酵 母 は 細 胞 の 生 理 学 的 寿 命 の 現 象 と機 構 の 解 明 に
とて も有 用 な 生 物 で あ る。
106
2
今 後 の課 題
生 物 は 非 常 に 複 雑 で あ りな が ら、 巧 妙 な 挙 動 シ ス テ ム を保 有 して い る 。
これ を 、数 学 的 に 解 析 し理 解 す る こ とは 容 易 な こ とで は な い 。 しか しな が
ら一 方 にお い て 、複 雑 で あ る が ゆ え に 、 そ れ ぞ れ の 事 象 を細 分 化 しシ ン プ
ル な 系 と して 解 析 す る こ とに 意 義 が 生 ず る。 ま た 、 そ の よ うな こ とで 実 験
科 学 で は 得 られ な い 情 報 を 、解 析 に よ り入 手 す る こ とが 可 能 とな る。21世
紀 に 入 り、 ゲ ノ ム 解 析 に よ る結 果 を は じめ 、 これ ま で とは比 較 に な らな い
〃οοす な わ ち シ リ コ ン 内 (コ ン ピ
程 の 情 報 を 得 る よ うに な っ て か ら、 力 βゴ
ュー タ 内 )で 結 果 を 解 析 す る手 法 が 増 加 して き た 。21世 紀 の 生 物 学 に と つ
て 数 学 的解 析 は途 方 もな い 可 能 性 を 秘 め た も の と考 え る。
本 研 究 は 、 この よ うな背 景 の 中、 出芽 酵 母 を用 い て 実 施 した 実 験 で の 結
果 を数 学 的 に解 析 し、 さ らにそ の 結 果 を実 験 に 反 映 させ る試 み の 一 つ と し
て 実 施 した も の で あ る。 実 験 と数 理 との 比 較 に お い て 、対 数 増 殖 期 ま で は
両 間 に 良 い 相 似 が 得 られ た が 、対 数 増 殖 後 期 以 降 、保 存 則 の 保 存 状 況 にお
い て 、実 験 値 が 予 測 値 よ り低 い 値 を示 した (出 芽 痕 数 が 細 胞 数 を 下 回 つ た )。
そ の 原 因 を細 胞 消 滅 と仮 定 し数 式 に補 正 条 件 を加 えた 結 果 、 両 間 に近 似 を
得 た 。 この よ うに 、不 確 定 な 要 素 を どの よ うに 数 理 に 反 映 させ る か が 、数
理 解 析 にお け る鍵 とな る。本 研 究 に用 い た Tree― stageモ デ ル は 当初 細 胞 消
滅 を想 定 して い な い モ デ ル で あ つ た が 、不 確 定 要 素 と して 細 胞 死 が 重 要 な
要 因 と して加 わ っ た 。 さ らに 定 常 期 以 後 の 挙 動 に お い て は 、 細 胞 内 あ る い
は細 胞 外 の 環 境 が 大 き く変 わ る こ とか ら、 さ らに 予 測 が 難 し くな る 。 本 研
究 の 実 験 条 件 にお い て 、増 殖 パ タ ー ンが 大 き く 3つ に 分 類 され た が 、 そ の
要 因 に は そ れ ぞれ の 株 が も つ ス トレス の 受 け方 が 大 き く影 響 して い る。 今
後 の 課 題 と して は 、 Tree‐ stageモ デ ル に 細 胞 死 に 関 す る 要 因 をカロえ た
Four―
stageモ デ ル の 構 築 が 求 め られ る。ま た これ に 関連 して ス トレス 応 答
に 関 す る 挙 動 を パ タ ー ン 化 し未 知 な る変 化 の シ ミ ュ レー シ ョ ン が で きれ
ば 、 よ り有 用 な 解 析 手 法 に な る も の と考 え る。 そ れ に は 、 細 胞 周 期 の どの
チ ェ ック ポ イ ン トに 作 用 し、そ れ が 結 果 と して どの よ うに 作 用 す る の か を
知 る必 要 が あ る。 一 見 、 この よ うな 予 測 は不 可 能 な よ うに感 じる が 、 定 量
的 な評 価 は 難 し く も、 定 性 的 な パ タ ー ン 分 析 は 可 能 な も の と考 え る。 先 行
研 究 に お い て 、 Kathcrineら は 出芽 酵 母 の 細 胞 周 期 モ デ ル を提 唱 し、 細 胞
周 期 の 振 る舞 い を コ ン ピ ュ ー タ シ ミ ュ レー シ ョ ン に よ つ て 解 析 し よ う と
試 み た (Kathcrine θ
`′
′
.,2000)。
このモ デ ル の 特 徴 は 、 細 胞 周 期 に重 要
107
な 役 割 を示 す サ イ ク リ ン を反 応 速 度 式 に 当 て は め 、数 理 に て 解 析 す る こ と
で あ る。 さ らに この モ デ ル に ヒ ン トを得 て 、 マ イ ク ロ ア レイ に よ る実 験 デ
ー タ を加 えた
E―
Cell Systemに よ る検 討 が 慶 応 義 塾 大 学 にて な され て い る
(http:〃 www.ttck keio.ac.jp/1AB/computer‐ scienceノ )。 マ イ ク ロ ア レイ を
用 い て 細 胞 周 期 に 同調 して 発 現 が 見 られ る遺 伝 子 の 研 究 も盛 ん に行 わ れ
(Cho θι′′.,1998、 Spellman θ″′′.,1998)、 そ の 数 は 800と も言 わ れ て
い る。 E‐ Cell Systemで は 実 験 に て 得 られ た デ ー タ を仮 想 デ ー タ と して シ
ス テ ム に加 え る こ とで発 現 検 証 が 可 能 と の こ とで あ る。さ らに 、Cln2,Clb2,
Clb5の 3つ の サ イ ク リ ンの 振 る舞 い を
E‐
Cell Systemを 用 い て シ ミ ュ レ
ー シ ョン した 結 果 、現 実 に近 い 値 を得 た と報 告 して い る。 ち な み に 、本 シ
ス テ ム を用 い た シ ミ ュ レー シ ョン にお い て 、苦 慮 す る点 は 、 出芽 酵 母 が 非
対 称 な 分 裂 をす る こ とで 予 測 を複 雑 に して い る こ と の よ うで あ る。 本 研 究
に て 得 られ た 知 見 は 、今 後 の シ ミ ュ レー シ ョン に 有 効 に活 用 可能 と考 え る。
一 方 、密 度 効 果 に 関す る原 因物 質 の 特 定 に つ い て は 、今 回 検 討 を加 え た
炭 素 源 に 、 窒 素 源 あ る い は硫 黄 源 の 影 響 に つ い て も確 認 す る必 要 が あ る。
特 に 、 二 次 元 環 境 に て 得 られ た ガ ス 状 代 謝 産 物 (具 体 的 に は ア ンモ ニ ア )
の 影 響 を参 考 に 、 二 次 元 環 境 にお け る代 謝 産 物 で の 確 認 をす る こ とが必 要
と考 え る。 さ らに 、培 養 後 の 細 胞 懸 濁 液 か ら得 られ る画 分 を注 意 深 く分 析
す る こ とで 、 出芽 を 抑 制 す る物 質 、 ア ポ トー シ ス を誘 発 す る物 質 の 特 定 が
期 待 で き る。 そ の 際 に 、本 研 究 に て 確 立 した 実 験 手 法 は 有 効 に機 能 す る も
の と考 え る。
最 後 に 、前 述 した よ うに 、21世 紀 の 生 物 学 に と つ て 、数 学 的解 析 は途 方
もな い 可 能 性 を 秘 め て い る。 そ れ を 現 実 の も の とす るた め に は 、 生 物 学 者
と数 理 学 者 が 共 同 で 研 究 を進 め て い く こ とが 何 よ り大 切 な こ と と考 え る。
108
参考 文献
Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M. and Nystrdm, T. (2003)
Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during
cytokinesis. Science 99(5613): l75l'1753.
Andree, H.A., Reutelingsperger, C.P., Hauptmann, R., Hemker, H.C.,
Hermens, W.T. and WiIIems, G.M. (1990) Binding of vascular
anticoagulant atpha (VaC atpna) to planar phospholipid bilayers.
The Journal of Biological Chemistry 265(€)t 4923'4928.
Austen, R.D.Ganley., Ide, S., Sako, K. and Kobayashi, T. (2009)
The effect of replication intiation on gene amplification in the rDNA
and its relation ship to aging. Molecular CeII 35: 683-693.
Wyllie, A.H. (1992) Apoptosis and the regulation of cell numbers in
normal and neoplastic tissue: an overview. Cancer Metastasis
Revelation 11: 95-103
Bacon, J.S., Davidson, E.D., Jones, D. and Taylor, LF. (1966)
The location of chitin in the veast cell wall. Biochemical Journal LOL:
36c-38c.
Barea, F. and Bonatto, D. (2009) Aging defined by a chronologicreplicative protein network in Saccharomyces cerevisiaei an
interactome analysis. Mech Ageing Developman, 130(7): 444-460.
Biswas, K. and Morschhauser, J. (2005) The Mep2p ammonium
permease controls nitrogen starvation -induced filamentous growth in
Candida albicans. Molecular Microbiology 66: 649'669.
Bitterman, K.J., Medvedik, O. and Sinclair, D.A. (2003) Longevity
regulation in Saccharomyces cerevisiae: Iinking metabolism, genome
stability, and heterochromatin. Microbiol Molecular Biological
Revelation 67(3): s76-399.
Bjedov, I., Toivonen, J.M., Kery, F., Slack, C., Jacobson, J., Foley, A. and
Partridge, L. (2010) Mechanisms of life span extension by rapamycin in
the fruit fly Drcsophila melanogaster. Cell Metablism 11: 35-46.
Boveris, A., Oshino, N. and Chance, B. 0972) The cellular production of
hydrogen peroxide. Biochemical Journal 128: 617-630.
Boveris, A. and Chance, B. (1973) Mitochondrial generation of
hydrogen-peroxide -General properties and effect of hyperbaric -oxygen.
109
Biochemical Journal L34t
707 -716.
Brachmann, C.B., Davies, A., Cost, G.J., Caputo, E., Li, J., Hieter, P.
and Boeke, J.D. (1998) Designer deletion strains derived from
Saccharomyces cerevisiae 5288C: a useful set of strains and plasmids
for PCR'mediated gene disruption and other applications. Yeast14:
115 - 132.
Carmona-Gutierrez, D., Ruckenstuhl, C., Bauer, M.A., Eisenberg, T.,
Buttner, S. and Madeo, F. (2010) CeII death in yeast: growing
applications of a dying buddy. Cell Death Differ L7G)t 733-734.
Carter, B.L.A. and Jagadish, M.N. (1978) The relationship between cell
size and cell division in the yeast S. cerevisiae Exp. CeIl. Besearch tl2:
t5-24.
Casamayor, A., Torrance, P.D., Kobayashi, T., Thorner, T. and Alessi,
D.R. (1999) Functional counterparts of mammalian protein kinases
PDK1 and SGK in budding yeast. Curuent Biology 9:186-S4.
Cho, R.J., Campbell, Mj., Winzeler, E.A., Steinmetz, L., Conway, A.,
Wodicka, L., Wolfsberg, T.G., Gabrielian, A.E., Landsman, D., Lockhart,
D.J. and Davis, R.W (1998) A genomewide transcriptional analysis of
mitotic cycle. Molecular CeII 2O)t 65-73.
Costanzo, M., Nishikawa, J.L., Tang, X., Millman, J.S., Schub, O.,
Breitkreuz, K., Dewar, D., Rupes, I., Andrews, B. and Tyers, M. QO04)
CDK activity antagonizes Whi5, an inhibitor of G1/S transcription in
yeast. CeIl 117: 899-913.
Debbas, M. and White, E. (1993) Wild-type p53 mediates apoptosis by
E1A, which is inhibited by E1B. Genes and Development 7t 546-554.
de Bruin, R.A., McDonald, W.H., Kalashnikova, T.I., Yates, J. and 3rd,
Wittenberg, C. (2004) ClnB activates G1-specific transcription via
phosphorylation of the SBF bound repressor Whi5. Cell LL7:887-898.
Dirick, L., Bohm, T. and Nasmyth, K. (1995) Roles and regulation of
Cln-Cdc28 kinases at the start of the cell cycle of Saccharomyces
cerevisiae. EMBO Journal 14: 4803-4813.
Dirick, L., Moll, T., Auer, H. and Nasmyth, K. (1992) A central role for
SWI6 in modulating cell cycle Start-specific transcription in yeast.
Nature 857: 508-513.
Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J. and Nystrom, T. e007)
110
Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2
mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregationremodeling factor Hsp10 4p. Genes and Development 2L(19): 2410-2421.
Elledge, S.J. (1996) CeII cycle checkpoints: Preventing an ldentity
crisis. Science 274: 1664-1672.
Eva, Herker., HeImut, Jungwirth., Katharina, A.Lehmann., Corinna,
Maldener., Kai'Uwe, Frdhlich., Silke, Wissing., Sabrina, Btittner.,
Markus, Fehr., Stephan, Sigrist. and Frank, Madeo. (2004) ChronoIogical aging leads to apoptosis in yeast. The Journal of Cell Biology
164(4):501-507.
Evans, D.S., Kapahi, P., Hsueh, W.C. and Kockel, L. (2010)
TOR signaling never gets old: Aging, longevity and TORCl activity.
Ageing Research Revelarion IOO): 225-237.
Fabrizio, P. and Longo, V.D (2007) The chronological life span of
Saccharomyces cerevisiae. Methods Molecular Biology 37: 89-93.
Fabrizio, P. and Longo, V.D. (2008) Chronological aging-induced
apoptosis in yeast. Biochimical Biophysiology Acta. L78B(7): fZSO-fZgS.
Fontana, L., Partridge, L. and Longo, V.D. (2010) Extending healthy
life span--from yeast to humans. Science 328(5976): 321-326.
Foster, D.A., YeIIen, P., Xu, L. and Saqcena, M. (2010) Regulation of G1
CeII Cycle Progression: Distinguishing the Restriction Point from a
Nutrient'Sensing Ceil Growth Checkpoint(s). Genes & cancer Li
ttz4-r73t.
Ganley, A.R., Ide, S., Saka, K. and Kobayashi, T. (2009) The effect of
replication initiation on gene amplification in the rDNA and its
relationship to aging. Moecu|arl CeII 35(tr,)t 683-693.
Gabriela, F. Ribeiro., Manuela, Corte'ReaI. and Bjcirn, Johansson.
(ZOO0) Characterization of DNA Damage in Yeast Apoptosis Induced by
Hydrogen Peroxide, Acetic Acid, and Hyperosmotic Shock. Molecular
Biology of the Cell L7t 4584-4591.
Gavrieli, Y., Sherman, Y. and Ben-Sasson, S.A. (1992) Identification of
programmed ceII death in situ via specific labeling of nuclear DNA
fragmentation. Journal CeII Biology 119:493-501.
Guarente, L. and Kenyon, C. (2000) Genetic pathways that regulate
ageing in model organisms. Nature 4O8t 255-262.
111
Haigis,M.C.andYankner,B.A (2010)The aging stress response.Л
θθ〃
盈ガ
40(2):333-344.
Harman,D.(1956)Aging:A theory based on free radical and radiation
chemistry. Jο ″r″ ′ノθθrο ″ ′οgJ/11:298‐ 300.
`ο
Hamada,T.,Iguchi,S,Nishimura,N.and Tainaka,K.(1985)Stage
dependent density effect on yeast population.
Biο ′
ο″ 113: 737-742
」ο″′″′′οF Thθ οrθ ″ο′′
Hamada,T.,Kanno,S.and Kano,E.(1982)Stationary stage structure
of yeast population with stage dependent generation time. 」0′ r″ ′′οF
ゴ
Thθ ο′θι
ο′′Biο ′οβ7 97: 393‐ 414
Hamada,T.and Nakamura,Y(1982)On the oscillatory transient stage
ゴ。′′BiO′ ο y99:
structure of yeast population. Jο ′F″ ′′οF r力 θο″θι
.・
797‐
805.
Hartwell,L.H.(1974)Saσ O力 ′Fο ″yθ θs
οθrθ ガsゴ ′θ cell cycle
F′ οιθガ οrοgゴ ο′′′θガθ″β38:164‐ 198.
Hartwell,L.H.,Culotti,」 .,Pringle,J.R.and Reid,BJ.(1974)Genetic
control of the cell division cycle in yeast;a model. Sciθ ″σθ 88:46‐ 51.
Hartwell,L H and Unger,MW.(1977)Unequal division in
yι θβOθ ′θフISゴ ′θ and its implications for the control of cell
Saο ο力′Fο 」口
division. rhθ J。 ″F″ ′′οF σθ′′Biο ′ο″ 75:422‐ 435
Hayashi,M.,Ohkuni,K.and Yamashita,I.(1998)Control of division
arrest and entry into meiosis by extracellular alkalization in
yOθ θOθ rθ ァIs2′ θ 】b′ sι 14(10):905‐ 913.
Saσ ο力′Fο 』口
Hengartner,M.0.and Horvitz,H.R.(1994)C elegans cell survival gene
ced‐ 9 encodes a functional homolog Of the man■ malian proto‐ oncogene
bcl‐ 2. Ce′′76:665.
Herker,E,」 ungwirth,H.,Lehmann,K.A.,ⅣIaldener,C,Frohlich,
KU.,Wissing,S.,Buttner,S.,Fehr,M,Sigrist,S.and Madeo,F(2004)
Chronological aging leads to apoptosis in yeast. rhθ 」ο″F″ a′ οF
Ce′ ′
Biο ′
οき
v164(4):501-507.
Hess,DC,Lu,W。 ,Rabinrwitz,」 .D and Botstein,D。 (2006)Ammonium
tOxicity and potassium limitatiOn in yeast P■ οθ Biο ′Эgy 4:2012‐ 2023.
Houstis,N。 ,Rosen,E.D.and Lander,E.S.(2006)Reactive oxygen
species have a causal role in multiple forms Of insulin resistance.
112
Nature.
44Ot 944-948
Imai, S., Armstrong, C.M., Kaeberlein, M. and Guarente, L. (2000)
Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an
NDA'dependent histone deacetylase. Nature 403: 795-800.
Imai, S. (zOOZ) Is
160-
1,5
sirtl
a miracle bullet for longevity? Aging CeLl 6G):
l.
Imai, S. and Guarente, L. (2010) Ten years of NAD-dependent SIR2
famiiy deacetylasesi implications for metabolic diseases. Trends in
Pharmacological Sciences }lt 212-220.
Itoh, N., Yonehara, S., Ishii, A., Yonehara, M., Mizushima, S.,
Sameshima, M., Hase, A., Seto, Y. and Nagata, S. (1991) The poiypeptid
encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate
apoptosis. CeII 66: 233-243.
Jin, C. and Reed, J.C. eOO2) Yease and apoptosis. Nature Reviews
Molecular Cell Biology 3(6): 453-459.
Johnston, G.C., Singer, R. A. and McFarlane, E. S.(1977) Growth and
cell division during nitrogen starvation of the yeast Saccharomyces
cerevisiae. Journal of. Bacteriology l32i 728-730.
Johnston, G.C., Pringle, J.R. and Hartwell, L.H. (1977) Coordination of
growth and cell division in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Exp.
Cell Research 106: 79-98.
Johnston, M., Hillier, L., Riles, L., Albermann, K., Andre, B., Ansorge,
W., Benes, V., Bruckner, M., Delius, H., Dubois, E., Dusterhoft, A.,
Entian, K.D., Floeth, M., Goffeau, A., Hebling, U., Heumann, K.,
Heuss-Neitzel, D., Hilbert, H., Hilger, F., Kleine, K., Kotter, P., Louis,
E.J., Messenguy, F., Mewes, H.W., Hoheisel, J.D., et al. (1997) The
nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisuae chromosome XII.
Nature 387: 87-90.
Jorgensen, P., Nishikawa, J.L., Breitkreutz, B.J. and Tyers, M. @OOZ)
Systematic identification of pathways that couple cell growth and
division in yeast. Science 297(5580): 395-400. Epub 2002 Ju.n 2027.
Jorgensen, P., Rupes, I., Sharom, J.R., Schneper, L., Broach, J.R. and
Tyers, M. e004) A dynamic transcriptional network communicates
growth potential to ribosome synthesis and critical cell size. Genes
Devlopment L8: 2491-2505. Epub 2OO4 Oct 2491.
113
Kaeberlein, M. (2008) CeII biology: A molecular age barrier. Nature
454(7205)t 709-710.
Kaeberlein, M., Powers, R.W.,3rd, Steffen, K.K., Westman, E.A., Hu, D.,
Dang, N., Kerr, E.O., Kirkland, K.T., Fields, S. and Kennedy, B.K.
(ZOOf) Regulation of yeast replicative life span by TOR and Schg in
response to nutrients. Science 810: 1193-1196.
Kaeberlein, M., Powers, R.W., 3rd, Steffen, K.K., Weatman, E.A., Hu, D,
Dang ,Kerr, E.O., Kirkland, K.T., Fiekds, S. and Kennedy, B.K. (2005)
Regulation of yeast replicative life span by TOR and sch9 in response to
nutrients. Science 310(5751): 1193-1196.
Kamada, Y., Sekito, T. and Ohsumi, Y. (2004) Autophagy in yeast:
A TOR-mediated response to nutrient starvation. Curz' Top Microbiol
fmmunol 2791 73-84.
Kamada, Y., Yoshino, K., Kondo, C., Kawamata, T., Oshiro, N.,
Yonezawa, K. and Ohsumi, Y. (2010) Tor directly controls the Atgl
kinase complex to regulate autophagy. Molecular and CeIIuIar Biology
30(4):1049-1058.
Kathcrine, C.C., Csikasz-Nagy, A., Gyorffy, B., VaI, J., Novak, B. and
Tyson, J.J. (2000) Kinetic analysis of a molecular model of the budding
yeast cell cycle. Molecular Bidogy of the Cell 11: 369-391.
Kerr, J.F.R, WyIIie, A.H. and Currie, A.R. (1972) Apoptosis: a basic
biological phenomenon with wide ranging implications in tissue
kinetics. British Journal of Cancer 26t 239-257.
Ketela, T., Green, R. and Bussey, H. (1999) Saccharomyces.cerevisiae
Mid2p is a potential ceII waII stress sensor and upstream activator of
the PKCl'MPK1 cell integrity pathway. Journal of Bacteriology LBL:
3330- 3340.
Khademi, S., O'Conne1l, J. III , Remis,J., Robles - Colmenares, Y.,
Miercke, L.J.W. and Stroud, R.M. (2004) Mechanism of ammonia
transport by Amt/MEP/Rh: Structure of AmtB at 1.35 A . Science 305:
1587-1594.
Kitagaki, H. (2009) Mitochondrial - morphology -targete d breeding of
industrial yeast strains for alcohol fermentation. Biotechnology and
applied biochemistry 53(3): 145-153.
KIar, A.J., Fogel, S. and Macleod, K. (1979) MAR1-a Regulator of the
HMa and HMalpha Loci in Saccharomyces cerevisiae. Genetics gB(L):
1t4
37-50.
Koopman, G., Reutelingsperger, C.P., Kuijten, G.A., Keehnen, R.M.,
PaIs, S.T. and van Oers, M.H. (t99+) Annexin V for flow cytometric
detection of pho sphati dyls erine expression on B ceIIs undergoing
apoptosis. Alood 84(il: l4l5'1420.
Koyama, H., Toda, T. and Hara, T. (ZOO1) Srief exposure to low-pH
stress causes irreversible damage to the growing root in Arabidopsis
thaliana: pectin'Ca interaction may play an important role in proton
rhizotoxicity. Journal of experimental botany 52(355): 361-368.
Kristan, K.S., Brian, K.K. and Matt, K. (2009) Measuing replicative life
span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments 25: 1209.
Lai, C.Y., Jaruga, E., Borghouts, C. and Jazwinski, S.M. (2002) A
mutation in the ATP2 gene abrogates the age asymmetry between
mother and daughter cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Genetics L62(J)t 73-87.
Levin, D.E. (2011) Regulation of CeII WaII Biogenesis in Saccharomyces
cerevisiae: The CeII WalI Integrity Signaling Pathway. Genetics l89i
1745-tt7 5.
Lew, D.J. and Reed, S.I. (1995) A ceII cyvle checkpoint monitors ceII
morphogenesis in budding yeast. Journal CeII Biology L29t 739'749.
Lin, S.J., Kaeberlein, M., Andalis, A.A., Sturtz, L.A., Defossez, P.4.,
Culotta, V.C., Fink, G.R. and Guarente, L. e002) Calorie restriction
extends Saccharomyces cerevisiae lifespan by increasing respiration.
Nature 418(6895):344-348.
Lorenz, M.C. and Heitman, J. (199S) The MEP2 ammonium permease
regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae.
EMBO Journal L7t 1236-t247.
Lotem, J. and Sachs, L. (1993) Regulation by bcl-2, c'myc, ans p53 of
susceptibility to indaction of apoptosis by heat shock and cancer
chemotherapy compounds in differentiation -competent and defective
myeloid Ieukemic cells. CeII Growth & Differ 4: 4l-47 .
MacNee, W. (2005) Pulmonary and systemic oxidant/antioxidant
imbalance in chronic obstructive pulmonary disease. Proceeding of the
Am erica n Thora cic Soci ety 2: 50-60.
MaFarlane, E.S. (1980) Ribonuclease activity during G1 arrest of the
115
yeast Saccharomyce s cerevisiae. Archives of Mi crobiology L24t 243- 247 .
Madeo, F., Herker, E., MaIdener, C., Wissing, S., Lachelt, S., Herlan, M.,
Fehr, M., Lauber, K., Sigrist, S.J., Wesselborg, S. and Frdhlich K.U.
(1997) A caspase-related protease regulates apoptosis in yeast.
Molecular Ceil 9G)i 911-917.
Madeo, F., Herker, E., Maldener, C., Wissing, S., Lachelt, S., Herlan, M.,
Fehr, M., Lauber, K., Sigrist, S.J., Wesselborg, S., and Frohlich, K.U.
O002) A caspaserelared protease regulates apoptosis in yeast.
Molecular CeII 9: 911-91 7.
Madeo, F., Carmona- Gutierre z, D., Ring, J., Buttner, S., Eisenberg, T.
and Kroemer, G. (ZOOg) C aspase - dependent and caspase -independent
cell death pathways in yeast. Biochemical and Biophysical Research
Communications. 882: 227 -231.
Matt, K., KKathryn, T.K., Stanley, F. and Brian, K.K. (2005) Genes
determining yeast replicative life span in a Iong lived genetic
background. Mechanisms of Ageing and Development 126: 497-504.
McCord, J.M. and Fridovich. I. (1969) Superoxide dismutase: An
enzymic function for erythrocnprein (Hemocuprein). The Journal of
Biological Chemistry 2441 6049-6055
McInerny, C.J., Partridge, J.F., Mikesell, G.E., Creemer, D.P. and
Breeden, L.L. (1997) A novel Mcml-dependent element in the SWI4,
CLN3, CDC6, and CDC47 promoters activates M/G1-specific
transcription. Genes Development LLi 1277-L288.
Meyaard, L.,Otto, S.A., Jonker,R.R., Mijnster, M.J. and Keet, R.P.M.
(t992) Programmed death of T cells in HIV infection. Science 257:
2t7 -279.
Michael, C., Joy, L.N. and Xiaojing, T. (2004) CDK activity antagonized
Whi5, an inhibitor of G1/S transcription in yeast. CelI Ll7:899-913.
Mitsuzawa, H. (2006) Ammonium transporter genes in tha fission yeast
Schizosaccharomyces pombe: role in ammouium uptake and a
morphological transition. Genes CeIIs 11: 1183-1195.
Mortimer, R.K. (1959) Life span of individual yeast cells. Nature
t7 5t-
77
L83:.
52.
Mortimer, R.K. and Johnston, J.R. (1gSG) Lifespan of individual yeast
cells. Nature L83t 175l-L752.
116
Mortimer, R.K. and Johnston, J.R. (1986) Genealogy of principal
strains of the yeast genetic stock center. Genetics 118: 35-43.
Miura, M., Zhtt, H.,Rotello, R., Hartwieg, E.A. and Yuan, J. (t995)
Induction of apoptosis in fibroblasts by IL'18-converting enzyme, a
mammalian homolog of the C. elegans ceII death gene ced-S. Ceil 75@)l
653-660.
Negishi, T. and Ohya, Y. (zofo) The cell waII integrity checkpoint:
coordination between cell waII synthesis and the ceII cycle. Yeast 27:
5
13- 519.
NeumtiIIer, R.A. and Knob1ich, J.A. (2009) Dividing cellular
asymmetry: asymmetric ceII division and its implications for stem ceIIs
and cancer. Genes & Development 23O3)t 267 5-2699.
Nishimura, N. (1983) On the stage structure in the asynchronized ceII
culture of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Master's Thesis of
Ibaraki University (in Japanese).
Palkova, Z. and Vachova, L. (2003) Ammonia signaling in yeast
formation. fnteruational review of cytology 225: 229-272.
Paola, Fabrizio. and Valter, D.Longo. (2008) Chronological aginginduced apoptosis in yeast. Biochimica et Biophysica Acta 1783:
12 80 - 12
85.
Patrick, Rockenfeller. and Frank, Madeo. (2008) Apoptotic death of
aging yeast. Experimental Gerontology 43: 876'881.
Ryk, D.V. and von Tigerstrom, R.G. (1985) Activity changes of three
nucleolytic enzmes during the Iife cycle of Saccharomyces cerevisiae.
Canadian Journal of Microbiology 3L. 7O95-L102.
Sachs, L. and Lotem, J. (1993) Control of programmed ceII death in
normal and leukemic cells: new implications for therapy. B|ood 82(l):
t5-21.
Sakai, K., Matsumoto, K., Nishikawa, T., Suefuji, M., Nakamaru, K.,
Hirashima, Y., Kawashima, J., Shirotani, T., Ichinose, K., Brownlee, M.
and Araki, E. (zooB) Mitochondrial reactive oxygen species reduce
insulin secretion by pancreatic beta-cells. Biochemical and Biophysical
Research Communicatiors 300: 2L6-222.
Schaap, P.,Wihckler, T., Nelson, M., Alvarez-Curto, E.,Elgie, B.,
Hagiwara, H., Cavender, J., Milan-Curto, A., Rozen, D.E., Dingermann,
rt7
T., Mutzel, R. and Baldauf, S.L. (2006) Molecular phylogeny and
evolution of morphology in the social amoeb as. Science 314(5799):
661-663.
Shcheprova, Z.,Baldi, S., Frei, S.B., Gonnet, G. and BarraI, Y. (200S) A
mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.
Nature 454Q 205)t 7 28-7 34.
Shimizu, S., Kanaseki, T., Mizushima, N, Mizuta, T, ArakawaKobayashi, S, Thompson, C.B. and Tsujimoto, Y. (2004) Role of Bcl-2
family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on
autophagy genes. Nature Cell Biology 6t l22l-1228.
Sinclair, D.A. and Guarente, L. (1997) Extrachromosomal rDNA circles
a cause of aging in yeast. CeIl 91-O):1033'1042.
Skotheim, J.M., Di Talia, S., Siggia, E.D. and Cross, F.R. (2008)
Positive feedback of G1 cyclins ensures coherent ceII cycle entry.
Nature 454: 297'296.
Slone, D., Taitz, Z.S. and Gilchrist, G. (1959) South African Medical
Journal 33: 1024.
Smirnov, A., Nassonova, E., Berney, C., Fahrni, J., Bolivar, I. and
Pawlowski, J. (2005) Molecular phylogeny and classification of the
Iobose amoebae. Protist 156(2): 729-t42.
Steinkraus, K.A., Kaeberlein, M. and Kennedy, B.K. (2008) Replicative
aging In yeast: the means to the end. Annual Review of CeIl and
Developmental Biology 24i 29-54.
Smith, D.G., Garcia-Pedrajas, M.D., GoId, S.E. and Perlin, M.H. (2003)
Isolation and characterization from pathogenic fungi of genes encoding
ammonium permeases and their roles in dimorphism. Molecular
Microbiology 6Oi 259-27 5.
Spellman, P.T., Sherlock, G., Zhang, M.Q., Iyer, V.R., Anders, k., Eisen,
M.B., Brown, P.O., Botstein, D., and Futcher, B. (1998) Domprehensive
identification of ceII cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces
crevisiae bye microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell 9:
3273-3297.
Suzuki, K. and Ohsumi, Y. (2007) Molecular machinery of autophagosome formation yeast, Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett 58L,.
2156-2t6t.
118
Swida, U., Schulz-Harder, B., Kucherer, C. and Kaufer, N. (1981) The
occurrence of two ribosomal ribonuclease depending on growth phase in
yeast: induction of ribonuclease in glucose-starved ceIIs. Biochirn
Biophys Acta 652i 1299-138.
Tainaka, K., Yoshimura, J. and Ushimaru, T. (2006) Stage-dependent
density effect in the ceII cycle of budding yeast. Journal of Theoretical
Biology 242: 7 36-7 42.
Taniyama, Y. and Griendling, K.K. (2003) Reactive oxygen species in
the vasculature: molecular and cellular mechanisms. Hypertension
46(6):1075-1081.
Thorpe, P.H., Bruno, J. and Rothstein, R. (2008) Modeling stem cell
asymmetry in yeast. CoId Spilng Harbor Symposia on Quantitative
Biology 73: 81-88.
Tolmasoff, J.M. Ono, T. and Cutler, R.G. (1980) Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 771 2777
.
Trauth, B.C., Klas, C., Petors, A.M., Matzku, S., MdIIer, P., FaIk, W.,
Debatin, K.M. and Krammer, P.H. (1989) Monoclonal antibodymediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 245
(491b): Bo1-Bos.
Tsuboi, M. and Yanagishima, N. (1975) Promotion of sporulation by
caffeine pretreatment in Saccharomyces cerevisiae. I . Metabolism on
nucleic acids and protein during sporulation. Az'chives of Microbiology
106:159-164.
Tsuboi, M. and Yanagishima, N. (1976) Promotion of sporulation
bycaffeine pretreatment in Saccharomyces cerevisiae. tr . Changes in
ribonuclease activity during sporulation. Archives of Microbiology tO8:
t49-152.
Tsuboi, M. (1976) Correlation amoug turnover of nucleic acids,
ribonuclease activity and sporulation ability of Saccharomyces
cerevisiae. Archives of Microbiology LLI: 13-19.
Tsuboi, M. (1978) Species of nibonuclease and changes of their
activities during sponulation of Saccharomyces cerevisiae. Spores 7:
344-349.
Uesono, Y. and Toh-e, A. (2002) Transient inhibition of translation
intiation by osmotic stress. The Journal of Biologicil Chemistry 277:
13
848- 138 5 5.
119
Vermas, I., Haanen, C., Steffens -Nakken, H. and Reutelingsperger, C.
(1995) A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of
phosphatidyls erine expression on early apoptotic ceIIs using
fluorescein labeIIed Annexin Y. Journal Immunol Methods 184(1):
39-51.
Verges, E., Colomina, N., Gari, E., Gallego, C. and Atdea, M. (2007)
Cyclin ClnB is retained at the ER and released by the J chaperone Ydj
in late G1 to trigger ceII cycle entry. Molecular Cell 26t 649-662.
1
Wheals, A.E. and Lord, P.G. (f980) Asymmerical division of
S.cerevisiae. Journal of Bacteriology. 142: 808-818.
Wytlie, A.H. (1992) Apoptosis and the regulation of cell numbers in
normal and neoplastic tissuos: an overview. Cancer and Metastasis
Reviews 11: 95-103.
Yamaki, M.,Umehara, T., Chimura, T. and horikoshi, M. (2001) CelI
death with predominant apoptotic features in Saccharomyces cerevisiae
mediated by deletion of the histone chaperone ASFl/CiA1. Genes Cells
6: 1043-1054.
Yonehara, S., Ishii, A. and Yonehara, M. (1989) A cell-killing
monoclonal antibody (anti-Fas) to a ceII surface antigen
co-downregulate d with the receptor of tumor necrosis factor.
The Journal of Experimental Medicine 169(5): 1747-1756.
Yu, Li., AIva, A., Su, H., Dutt, P., Freundt, E., Welsh, S., Baehrecke,
E.H. and Lenardo, M.J. (2004) Regulation of an ATGT- beclin I Program
ofAutophagic CelI Death by Caspase'8. Science 304: 1500-1502.
Z},ang, J., Schneider, C., Ottmers, L., Rodriguez, R., Day, A. and
Markwardt, J. Q002) Genomic scale mutant hunt identifies ceII size
homeostasis genes in S.cerevisiae. Current Biology Lzeilt rc92-2001
Zheng, L., Kostrewa, D., Berneche, S., Winkler, F.K. and Li, X.-D.
(2004) The mechanism of ammonia transport based on the crystal
structure of AmtB of Escherichia coli. Proceedings of the National
Academy of sciences USA tOTGg): 17090-17095.
120
謝
辞
本 研 究 は 、著 者 が 静 岡 大 学 大 学 院 自然 科 学 系 教 育 部 博 士 後 期 課 程 在 学 中
に 、 同大 学 院 吉村 仁 教 授 の ご指 導 の も とに 行 つ た も の で あ る。
本 研 究 を行 うに あ た り、 終 始 ご熱 心 な ご指 導 、 ご鞭 撻 を賜 り、 か つ 本 稿
の ご校 閲 を い た だ き ま した 、本 学 環 境 エ ネ ル ギ ー シ ス テ ム 専 攻 の 吉 村 仁 教
授 に 厚 くお 礼 申 し上 げ ます 。 ま た 、本 研 究 にお け る 、数 理 解 析 に 関す る ご
指 導 お よび適 切 な ア ドバ イ ス を い た だ き ま した 本 学 環 境 エ ネ ル ギ ー シ ス
テ ム 専 攻 の 泰 中啓 一 教 授 に 厚 くお 礼 申 し上 げ ます 。 そ して 、本 研 究 にお け
る、酵 母 実 験 の ご指 導 お よび 適 切 な ア ドバ イ ス と実 験 教 材 の ご提 供 を い た
だ き ま した 本 学 バ イ オ サ イ エ ン ス 専 攻 の 丑 丸敬 史 教 授 に厚 くお 礼 申 し上
げ ます 。
ま た 、本 研 究 を進 め る に あ た り、適 切 な ご指 導 、 ご助 言 を 戴 き ま した 本
学 バ イ オ サ イ エ ン ス 専 攻 の 瓜 谷 員裕 教 授 、 山本 歩 教 授 に厚 くお 礼 申 し上 げ
ま す 。 さ らに 、物 質 の 特 定 に お け る抽 出 /分 画 にお い て は本 学 バ イ オ サ イ
エ ンス 専 攻 の 河 岸 洋 和 教 授 、修 士 課 程 の 小 堀 一 さん に ご 協 力 を い た だ き厚
くお 礼 申 し上 げ ま す 。ま た 、数 理 解 析 にお い て は修 士 課 程 の 倉 知 宏 憲 さん 、
大 津 武 士 さん 、酵 母 実 験 に お い て は修 士 課 程 の 山 田 ち ひ ろ さん 、端 野裕 樹
さん に研 究 の ご協 力 を い た だ き深 く感 謝 い た しま す 。
加 え て 、長 年 に わ た り様 々 な 面 で お 世 話 に な つ た 吉 村 研 究 室 、泰 中研 究
室 、 丑 丸 研 究 室 の 皆 様 方 及 び 先 輩 方 に この 場 を 借 りま して 心 か ら感 謝 を 申
し上 げ ます 。
最 後 に 、博 士 課 程 在 籍 に あ た り暖 か く見 守 って 下 さ つ た 第 一 三 共 株 式 会
社 執 行 役 員 の 員鍋 淳 博 士 、 通 学 へ の ご配 慮 を い た だ き ま した 第 一 三 共 株 式
会 社 研 究 開発 本 部 安 全 性 研 究 所 長 の 三 分 一 所 厚 司 博 士 、第 一 三 共 株 式 会 社
薬 制 部 長 の 塩 谷 宏 明博 士 に 厚 く感 謝 申 し上 げ ま す 。
121
添付資料
０４
０乙
表
1
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う娘 細 胞 の 大 き さ の 変 化
Strain
S288C
BY4741
″■ゴ5Z
Culture
Time
Appearance ratio (%)
Less than
3
3
μm
or
pm
more
9 hr
381
619
12 hr
344
656
15 hr
394
606
18 hr
446
554
21 hr
28.2
718
36 hr
280
720
18 hr
624
376
21 hr
666
334
24 hr
667
333
27 hr
728
272
30 hr
73.0
27.0
36 hr
671
329
18 hr
776
224
21 hr
827
173
24 hr
841
159
27 hr
845
155
30 hr
882
118
36 hr
914
8.6
18 hr
755
245
21 hr
663
337
24 hr
70.4
296
27 hr
746
25.4
30 hr
693
307
36 hr
715
285
,ο 力θzl
123
表
2
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 化 (S288C)
耐①
。 ︲
ｅ
Ｎ Ｃ
ａ
ｈ
Ｐ
Ｍ ｅ
ｓ
ａ
２
．ｈ
Ｇ Ｐ
Ｓ
ｓ
︲ ａ
Ｇ ｈ
Ｐ
ｒ
ｄ
ａ
ｕ ｃ
Ｂ Ｓ
﹄ ｅ
ｍ
︲
ｕ Ｔ
Ｃ
Scars
562
0
No. Bud
No Bud
Scar/
No Cens
0
1
2
9 hr
3
2
4
0
0
0
5
6
7
8
1
0864
1
8
2
2
2
1
0
500
04
04
04
1000
432
0
0
4
4
14
10
0
5
6
8
0
0
2
3
12 hr
124
6
3
0
2
3
15 hr
1000
536
478
140
140
04
40
30
14
0
6
4
5
6
8
1
1
6
5
フ
0964
1
8
0
0
5
2
1000
0
239
10
0
1
13 hr
2
6
122
3
4
90
4
17
5
6
7
6
1
21 hr
1
0
54
40
30
フ
1000
7
42
4
5
6
8
5
0
2
3
1
323
8
8
2
0
102
64
0772
1
1
8
0
0
0
6
1
1000
0
325
1
2
3
4
36 hr
5
6
7
8
9
466
7
386
0
74
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
フ
14
8
4
3
0
08
06
00
2
04
0740
0
9
1000
124
370
表
3
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 化
耐①
ｌ
恥 ｅ
Ｃ
ｅ
ｓ
ａ
鰤
ｈ
Ｐ
ａ
ｈ
Ｐ
No. Bud
Scars
222
2
3
18 hr
Ｓ
ｓ
ａ
ｑ ｈ
Ｐ
ｒ
ｄ
ａ
ｕ ｃ
Ｂ Ｓ
ｅ
ｍ
ｍ
ｕ Ｔ
Ｃ
0
(BY4741)
No Bud
Scar/
No Ce‖ s
0
9
2
4
9
5
6
7
8
9
3
0
0860
4
0
0
0
0
0
2
3
4
1000
293
0
0
7
21 hr
2
3
4
7
3
4
5
6
0
0
7
5
5
2
0
0
0
8
5
2
16
40
1000
41
0
3
2
3
24 hr
31
4
4
142
5
71
7
3
3
5
6
7
8
0946
4
4
0
3
1000
473
0
146
9
27 hr
2
3
4
4
0
0
0
0
0
5
6
フ
8
3
2
フ
09フ 4
3
2
1000
0
6
2
3
4
5
0
3
30 hr
31
21
2
0
0
0900
6
7
2
8
9
2
5
2
0
0
0
10
8
2
500
0
450
674
7
4
2
0
0
3
36 hr
4
5
6
8
3
0780
0
3
8
0
0
500
13
125
390
に ヽ
′
2
3
4
5
6
8
No. Bud
Scars
No Bud
Scar/
No Ce‖ s
570
0
18 hr
”α
ａ
ｈ
Ｐ
︲
Ｍ ｏ
Ｏ
Ｓ
ｓ
ａ
ｈ
Ｐ
Time
︲
Ｇ
lture
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 化 (〃 力″ ∠)
ｒ
ｄ
ａ
ｕ ｃ
Ｂ Ｓ
Cu
4
Ｍ
嚇
２
．
Ｃ
表
2
4
4
2
0
0
7
2
0
0
0
0
0894
2
8
1000
174
0
242
2
3
21 hr
4
5
6
8
0
9
9
3
5
4
5
6
7
8
0
0
0
0
0
0
12
5
15
327
1000
8
8
5
9
6
5
2
9
3
0
0
0
102
0
0
0
0
1000
582
0
2
3
4
9
5
2
5
0
0
0
0
6
5
7
8
0932
7
6
4
2
385
27 hr
0930
9
4
227
2
3
24 hr
8
0
3
2
5
5
4
0
0
0
0
0966
5
7
8
1000
0
30 hr
272
2
3
4
7
2
5
5
0
0
0
6
7
8
0
6
5
2
0
0
0
0
0
0922
4
4
8
1000
670
3
5
2
3
36 hr
2
4
17
5
フ
6
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0758
7
4
3
126
14
表
5
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う世 代 構 成 の 変 化
θ∠)
(θ
“
”α
ｌ
い ｅ
Ｃ
ａ
ｈ
Ｐ
Scar/
Nd C6lls
3
0
4
4
5
0866
5
6
2
0
7
0
0
0
2
7
8
0
0
192
3
2
3
4
17
5
6
7
3
5
6
2
0920
0
0
3
7
500
0
257
2
3
6
1000
582
0
182
5
24 hr
No. Bud
0
2
3
8
21 hr
No. Bud
Scars
252
4
18 hr
Ｍ ｅ
ｓ
ａ
２
． ｈ
Ｇ Ｐ
Ｓ
ｓ
ａ
ｈ
Ｐ
0
︲
Ｇ
Time
ｒ
ｄ
ａ
ｕ ｃ
Ｂ Ｓ
Cu ture
3
17
7
4
5
6
7
9
4
0936
0
0
0
0
4
7
9
1000
296
0
2
3
27 hr
0
2
2
0954
4
5
6
7
9
8
3
0
0
0
9
8
3
1000
14
2
3
30 hr
2
4
5
6
7
14
5
3
8
0
0
0
0
0
0876
5
3
8
1000
7
36 hr
0
327
2
3
27
4
5
6
4
7
3
8
477
0
0
7
7
0
0
0
0
0
0
0
8
0
6
0726
7
4
3
8
7
1000
ワ‘
０４
表
6
出芽 酵 母 の 増 殖 に 伴 う細 胞 周 期 の 比 較
ｒ
ｕ 鵬
ｔ
︲
ｕ ﹁
Ｃ
BY4741
Bud Ecar
Gl
α)
Sα )
02-M(%)
Gl
α)
su)
G2-Mα )
010)
"あ
S6)
G2-M(%)
Gl(%)
SC)
G2-M(%)
157
51
15 hr
4
5
000
00
0
61
17 5
735
51
8Ю
6
0
0
1000
909
0
0
10011
0
7
OЮ
21 hr
17
OЮ
O ll
O ll
00
0
OЮ
O ll
OЮ
O ll
O ll
O ll
00
4
70
9
7 7
3
7
0
0
0
0
0
0
4
912
91 8
77
91
2
3
4
101
7
27 hr
OЮ
0
0
4
2
0
0
0
0
1
4
6
30 hr
1
7
1
2 3
1000
0
21
21
5
977
91
0
0
0
0
128
1
1
表
7
本 研 究 に用 い た 出芽 酵 母 株 の リス ト
Strain(Alias)
Genotype
W303
ゴゴ,ゴ 5′ ごθ2‐ ゴο′″ゴ‐
ゴθθ
βθ‐
』乙乙乃 υFaθ ‐
′′
θ″2‐ afゴ 2 trpゴ・′カゴ
US356(ろ ariZ)
W303わ ′rf rrカ ゴθθ
MArα ″ ′′ga′2
S2880
BY4741
SCU2505(″ カゴ5Z)
S288C i44Zレ
カゴ
s」 zl
ゴ5∠
i′ ο″2△θ″ θι
BY4741″ カゴ」==Ka″ 豚
SCU2144(sο 力θZ)
BY4741,0カ
SCU2817(b″ ′θ∠)
BY4741 b″ どθriKa″ i4κ
SCU271(″ ρttfZ)
BY4741″ β女′==Ka″ 豚
BY4741,0′ f==Ka″ ittY
SCU2906(sο ごゴ∠)
SCU2907(β Od2△)
θ==Ka″ 豚
BY4741 sOご2'=Ka″ 』乙ど
SCU25(ん らIZ)
BY4741カ
SCU806(sir2zl)
BY4741,ir2==Ka″
SCU2846(ノ 0′ ′∠)
BY4741 yO′
=US356,野 生 株
θ υFaθZθ
わZ==Ka″ 豚
″
ゴ==Ka″ 豚
(栄 養 要 求性 あ り);S288C, 野 生 株 ;BY4741,S288Cに
栄 養 要 求 性 が 付 加 され た株 。 出 芽 酵 母 は全 て Saο ο力 ′Fο
ηyOθ S σθFθ フISI′ θ.
“
129
表 8
本 研 究 に 用 い た欠 損 株 の 遺 伝 子 の 機 能
WH15
of G1 transcription that binds to SCB binding factor
(SBF) at SCB target promoters in early G1; phosphorylation of
Whi5p by the CDK, CInBp/Cdc28p relieves repression and promoter
binding by Whi5; periodically expressed in G 1
SCH9
Protein kinase involved in transcriptional activation of
osmostress-responsive genes; regulates G1 progression, cAPK
activity, nitrogen activation of the FGM pathwayi involved in life
Repressor
span reguiationi homologous to mammalian Akt/PKB
BUD6
Actin- and formin interacting proteini stimulates actin cable
nucleation by recruiting actin monomers to Bnilpi involved in
-
polarized cell growthi isolated as bipolar budding mutanti potential
Cdc28p substrate
MPKl
rine/threo nine MAP kinasei involved in regulating maintenance
of cell wall integrity, progression through the ceII cycle, and nuclear
Se
mRNA retention in heat shocki required for mitophagy and
pexophagyi affects recruitment of mitochondria to the phagophore
assembly site (PAS); regulated by the PKCl'mediated signaling
p
SODl
athw ay
Cytosolic copper-zinc superoxide dismutasei some mutations are
analogous to those that cause ALS (amyotrophic lateral sclerosis) in
hu m ans
SOD2
FOBl
Mitochondrial manganese superoxide dismutase, protects cells
against oxygen toxicityi phosphorylated
Nucleolar protein that binds the rDNA replication fork barrier
(RFB) site; required for replication fork blocking, recombinational
hotspot activity, condensin recruitment to RFB and rDNA repeat
segregationi related to retroviral integrases
SIR2
YCAl
Conserved NAD+ dependent histone deacetylase of the Sirtuin
famiiy involved in regulation of lifespani plays roles in silencing at
HML, HMR, telomeres, and the rDNA locusi negatively regulates
initiation of DNA replication
Putative cysteine protease similar to mammalian caspases; involved
in regulation of apoptosis upon H:Oz treatmenti contributes
to
clearance of insoluble protein aggregates during normal growthi
may be involved in ceII cycle progression
*Saccharomyces Genome Database (http:77***.reastgenome.
130
o
ryl)
t
D

水溶性テトラゾリウム塩を用いた微生物増殖アッセイ - 福岡県工業技術

酵母Two-hybrid法を用いたエストロゲン様活性測定 - 保健環境センター

Document

プロトプラスト融合による正暦寺酵母の改良 - 奈良県

【目的】 ウシ胚盤胞期までの培養系はこれまで詳細に検討 されてきたが

細胞のパワーを助ける 「Cell Power」 ブランド誕生

OC-2(IAM 4274) 培地(Polypeptone 0.75% ， Yeast ext - 山梨大学

WBCの3峰性粒度分布でのデータの見方について

置局設計の技術

乳頭状髄膜腫の二例