BD バイオコートTM T細胞活性化プレート（抗ヒトCD3）製品説明ヒトPBMC細胞増殖アッセイ T細胞レセプター複合体抗体をコーティングしたプレートは、様々な動 1. 物種のT細胞活性化誘導に使われています。BD バイオコートTM T ように調整し、T細胞活性化プレートに分注します。CO2インキュベータにプレートを入れ、37℃で45∼48時間培養します。細胞活性化プレートは、高品質の抗CD3抗体（BD ファーミンジェン）でコーティングされています。BD バイオコート T細胞活性化プレート PBMCが適当な濃度1.0×104∼2.0×105細胞/ウェルになる 2. BrdU（ブロモデオキシウリジン）ELISAキット（ロシュ、1 647 は、ロット間の品質にバラツキがなく、プレートが使いやすいようにフ 229）を用いて細胞増殖を測定します。まずCO 2培養器にてタ付きで個別包装されています。全ロットは培養T細胞の活性化能 37℃で、2∼24時間、細胞をラベルします。ラベリング終了後、力について品質テスト済みです。培養液を捨てて、細胞を固定し、DNAの変性処理をします。固定/変性試薬を除去し、抗-BrdU-POD（ペルオキシダーゼ）を加えて室温で90分インキュべートします。細胞を3回洗浄し、 BD バイオコート T細胞活性化プレート（抗ヒトCD3）の用途 ● T細胞の活性化基質液を加えて室温で10分間インキュべートします。対象波 ● サイトカイン産生長492 mm、測定波長370 mmで吸光度を測定します。 ● サイトカインmRNAの定量 ● Co-stimulation ● T細胞機能におよぼす薬効の研究 BD バイオコート T細胞活性化プレート（抗ヒトCD3）品質保証 ● 細菌、および真菌の陰性確認検査済み ● Jurkat細胞（ヒトTリンパ球）活性化テスト済みヒトPBMC（末梢血単核球）細胞増殖アッセイ細胞培養培養液 ● RPMI 1640に2 mM L-グルタミン、10%FBSとなるように添加します。（2日間）のBrdUによ T細胞活性化プレートを使用したヒトPBMC細胞増殖アッセイる検出（ラベリング6時間） JURKAT細胞（ヒトTリンパ球）における活性化 ― 細胞死誘導アッセイヒトPBMCの調製 1. 2. 3. 血液を採取し、血液と同等量のDPBS（Dulbecco's PBS）を細胞培養加えます。培養液組成： 10%FBS（胎児ウシ血清）を加えたRPMI-1640 500 Ficoll-PaqueTM プラス溶液（アマシャムファルマシアバイオテ mLに以下のものが含まれるようにします。クAB、17-1440-02）を、血液/PBS混合液の下に層状になる ● HEPES（1M）：10 mL ようゆっくりと加えます。10 mLの血液/PBS混合液に対し、3 ● L-グルタミン（200 mM）：5 mL mLのFicoll-paque溶液を加えます。 ● ピルビン酸ナトリウム（100 mM）：5 mL 900×g、18∼20℃で30分遠心分離し、ブレーキを使用せず ● 硫酸ゲンタマイシン（50 mg/mL）：0.6 mL に自然に減速するのを待ちます。使用説明書 4 5 6 滅菌されたピペットを用いて、血漿および大部分の血小板を Jurkat 細胞の調製含んだ上層を除去します。別のピペットで、単核球層を遠心 Jurkat E6-1細胞株については、継代数30以下の細胞で使用前に分離用試験管に移します。少なくとも1日培養したものを使用します。細胞密度については細胞を多めのPBSで2回洗浄した後、400×gで10分間、遠 ATCCの指示書に従ってください。心分離します。 1. Jurkat細胞を回収して200×gで5分間、遠心します。細胞をRPMI培養液に浮遊させ、コールターカウンターで細胞 2. 培養液を静かにデカント、または吸引除去した後、細胞を数を測定します。 DPBS 50 mLの入ったチューブに移し、洗浄します。 3. 4. 200×gで5分間遠心し、上清をデカントします。適当な濃度になるように細胞数を調整します（本試験の場合、 2×106 細胞/mL）。 234 活性化-細胞死誘導アッセイ（Jurkat細胞） 1. 製品リスト適当な濃度（0.5×105 ∼2.0×105 細胞/ウェル）に調整した細胞をT細胞活性化プレート、およびコーティングされていないコントロール用プレートそれぞれに100 µL/ウェルとなるように分注します。 37℃、5%CO2培養器で45∼48時間培養します。 3. EthD-1（エチジウムホモダイマー1粉末、Molecular Probes、 E-1169）を20%DMSO/H2O（v/v）で溶解し、2 mMのストック溶液を作製します。ストック溶液を小分けし、-20℃で保存します。 EthD-1ストック溶液をDPBSで希釈し、使用濃度10 µMに調整します。 5 各ウェルに100 µLの10 µM EthD-1を加え、Wallac Victor 2蛍光プレートリーダー（530 nm励起フィルター、645 nm蛍光フィルター）を用いて測定します（他のプレートリーダーも使用できます）。 6 入数（ケース）カタログ番号抗ヒトCD3 96ウェル、透明、フタ付き 5枚 354725 コーティングなし、コントロールプレート 5枚 354730 96ウェル、透明、フタ付き 2. 4 製品 5 EthD-1は死細胞に侵入して蛍光度を増強します。2×10 細胞/ウェルにおいて、信号/ノイズ（S/N比）は、コントロール用のプレートを用いた場合と比較して2.5以上となります。（2日間）のEthD-1による検出（ラベ T細胞活性化プレートにおけるJurkat 細胞死アッセイリング16分）関連製品 BD バイオコートTM 製品製品入数（ケース）カタログ番号抗マウスCD3 96ウェル、透明、フタ付き 5枚 354720 BD ファルコン 50 mL コニカルチューブポリプロピレン、25本/ラック×20、滅菌 500 352098 BD ファルコン 50 mL コニカルチューブポリプロピレン、25本×20 （ラックなし）、滅菌 500 352070 BD ファルコン 100 mm ディッシュ 100mm×15mm、滅菌、スタンダード 500 351029 BD ファルコン 100 mm ディッシュ 100mm×15mm、滅菌、スタッカー 240 351999 BD ファルコン 5mL ピペット 200 357543 200 357551 BD ファルコンTM 製品滅菌、個別包装 BD ファルコン 10mL ピペット滅菌、個別包装 BD ファーミンジェン製品 BD OptEIATM ヒトIL-2セットヒトIL-2ELISAセット、IL-2捕捉抗体、検出用ビオチン化抗体（1キット、96ウェルプレート20回分） 555190 BD Discovery Labware製品 IL-2ヒトナチュラルマウスT細胞株CTLLにおける増殖促進能テスト済み（2,000BRMPユニット） 354121 IL-2ヒトリコンビナントマウスT細胞株CTLLにおける増殖促進能テスト済み（10,000BRMPユニット） 354043 登録商標 354725 BD バイオコートTM、BD ファルコンTM、およびBD OptEIATMは、ベクトン・ディッキンソン社の登録商標です。注意：製品は受領後、2∼8℃で保管してください。製品は発送後3ヶ月間安定。研究以外の目的には使用しないでください。使用説明書カタログ番号： 235