高濃度エタノール存在下において清酒酵母の生育を促進する温度

三重県工業研究所
研究報告
No.38 (2014)
高濃度エタノール存在下において清酒酵母の生育を促進する
温度ストレス処理条件
山岡千鶴＊，栗田修＊
Improvement of Yeast Growth by Heat Stress in the Presence
of High Ethanol Concentrations
Chizuru YAMAOKA and Osamu KURITA
Key words: Sake yeast, Saccharomyces cerevisiae, Heat stress, Ethanol tolerance
１．はじめに
植菌し，振とう温度勾配培養装置（型名
清酒酵母は高い発酵能を持つ
1)一方で，高濃度の
TVS126MB，アドバンテック東洋）を用いて，振と
エタノールに対する耐性が低い
2)．このため，発酵
う速度 30 rpm，一定温度で培養した．酵母の生育
後期のもろみでは高濃度のエタノールによって清
度を 660 nm の濁度（OD）で測定することにより
酒酵母が死滅する．これは，酒質の劣化をもたらす
判断した対数増殖期において，L 字管をウォーター
ことから，いくつかのエタノール耐性酵母が育種さ
バスに入れ，次項の処理条件にて静置することによ
れてきた
3)．
り温度ストレスを与えた．その後，培養温度まで冷
一方で，酵母には,さまざまなストレスに対して
却し，培地にエタノールを添加し，再び振とう培養
共通のストレス耐性獲得メカニズムが存在してお
を行った．酵母のエタノール耐性に対する効果につ
り，例えば，温度ストレスを与えると，エタノール
いては生育度（OD 値）で評価した．
耐性を獲得することが報告されている 4)．
２．２．２試験条件
（１）ストレス処理温度の検討
既存の清酒酵母に温度ストレスを与えてエタノ
ール耐性を付与することができれば，育種をせずと
YPD 液体培地を用い，培養温度は清酒製造にお
も酒質の向上が期待できる．そこで本研究では，温
いて標準的な発酵温度である 15℃，ストレス温度は
度ストレスを与えた場合のエタノール存在下での
Watson らの報告 4)を参考に 30℃または 37℃とし，
清酒酵母の生育を指標として，清酒酵母のエタノー
1 時間処理した後，培地のエタノール濃度が 10，12，
ル耐性の向上に効果を示す温度ストレス処理条件
14 または 16％（v/v，以下同様）となるようにエタ
を検討することとした．
ノールを添加した．
（２）ストレス処理時間の検討
YPD 液体培地を用い，培養温度は 15℃，ストレ
２．実験方法
２．１供試菌株
ス温度は 30℃とし，1 時間または 2 時間処理した後，
清酒酵母は協会 701 号（K-701）を用いた．
培地のエタノール濃度が 10，12 または 14％となる
２．２エタノール耐性試験
２．２．１試験方法
ようにエタノールを添加した．
液体培地を 15 mL 入れた L 字管に，YPD 液体培
（３）温度ストレス処理時の培地のエタノ
ール濃度の検討
地（酵母エキス 1％，ポリペプトン 2％，グルコー
YPD 液体培地を用い，培養温度は 15℃とし，培
ス 2％）で 30℃，2 日間静置培養した菌液を 150 µL
地中にエタノールを 2，4，6 または 8％含む状態で
＊
ストレス温度 30℃，2 時間の処理を行った後，最終
食と医薬品研究課
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濃度が 12％となるようにエタノールを添加した．
No.38 (2014)
３．結果と考察
３．１ストレス処理温度および処理時間
が酵母の生育に及ぼす影響
（４）培養温度の検討
YPD 液体培地を用い，培養温度は清酒製造の酒
母工程の最高温度を参考に 22℃とし，ストレス温度
30℃または 37℃でストレス処理を行ったところ，
は 15℃での培養時と同じ 15℃の温度差を確保する
図 1 に示すように，培地のエタノール濃度が 10％
ため 37℃で 2 時間処理した後，培地のエタノール
および 12％の場合，温度ストレス処理区での酵母の
濃度が 6，8，10，12 または 14％となるようにエタ
生育は無処理区と同程度もしくはわずかに下回っ
ノールを添加した．
た．30℃処理区は，エタノールが 14％および 16％
（５）培地の炭素源の検討
の場合，無処理区より酵母の生育がよかった．37℃
YPG 液体培地（酵母エキス 1％，ポリペプトン
処理区は，エタノール 14％では無処理区より酵母の
2％，グリセロール 3 v/v％）を用い，培養温度は
生育がよかったが，エタノール 16％では無処理区よ
15℃，ストレス温度は 30℃で 2 時間処理した後，
り悪かった．
培地のエタノール濃度が 6，8，10，12 または 14％
次に，ストレス処理温度 30℃において，処理時間
となるようにエタノールを添加した．
の影響を調べたところ，培地のエタノール濃度が
14％では 2 時間処理区の方が 1 時間処理区より酵母
2.0
2.0
1.5
1.5
生育度 (OD660)
生育度(OD660)
の生育がよかった（図 2）．なお，エタノール 10％
無処理
1.0
ストレス処理
(30℃)
ストレス処理
(37℃)
0.5
無処理
1.0
0.5
0.0
0
1
2
3
4
5
6
0.0
7
0
培養日数
生育度 (OD660)
2
3
4
5
6
7
培養日数
培地中のエタノール濃度が 10％の場合
b)
2.0
培地中のエタノール濃度が 12％の場合
2.0
1.5
1.5
無処理
1.0
ストレス処理
(30℃)
ストレス処理
(37℃)
0.5
0.0
0
1
2
3
4
5
6
ストレス処理
(30℃)
ストレス処理
(37℃)
0.5
0.0
7
0
1
2
3
4
5
6
7
培養日数
培地中のエタノール濃度が 14％の場合
図1
無処理
1.0
培養日数
c)
1
生育度 (OD660)
a)
ストレス処理
(30℃)
ストレス処理
(37℃)
d)
培地中のエタノール濃度が 16％の場合
ストレス処理温度の違いが酵母の生育に及ぼす影響
培地，YPD 培地；培養温度，15℃；ストレス処理時間，1 時間．
図中の矢印はストレス処理を行った時点を示す．
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1.5
生育度 (OD660)
生育度 (OD660)
1.5
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無処理
1.0
ストレス処理
(2時間)
ストレス処理
(1時間)
0.5
エタノール0％
エタノール2％
1.0
エタノール4％
エタノール6％
0.5
エタノール8％
エタノール10％
0.0
0.0
0
1
2
3
4
5
6
0
7
1
2
3
4
5
6
7
培養日数
培養日数
図 2 温度ストレス処理時間の違いが酵母の生育
図 3 温度ストレス処理時における培地へのエタ
に及ぼす影響
ノール添加が酵母の生育に及ぼす影響
培地，YPD 培地；培養温度，15℃；スト
培地，YPD 培地；培養温度，15℃；ストレ
レス温度，30℃；培地中のエタノール濃度，
ス温度，30℃；ストレス処理時間，2 時間．
14％．
ストレス処理後に最終濃度が 12％となる
図中の矢印はストレス処理を行った時点を
ようにエタノールを添加．
示す．
図中の矢印はストレス処理を行った時点
を示す．
および 12％では温度ストレス処理の有無および処
理時間に関わらず酵母の生育に差はみられなかっ
1.5
ル耐性の向上に寄与することが確認でき，14％付近
の濃度のエタノール存在下において，30℃，2 時間
処理という条件でその効果が高いことがわかった．
３．２温度ストレス処理時の培地のエ
タノール濃度がストレス処理効果に及ぼ
す影響
生育度 (OD660)
た．これより，温度ストレスは清酒酵母のエタノー
無処理
(15℃)
ストレス処理
(15℃)
無処理
(22℃)
ストレス処理
(22℃)
1.0
0.5
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
培養日数
図 3 に示すように，エタノールを添加した培地で
温度ストレス処理を行った場合，エタノール 6％ま
図 4 培養温度およびストレス温度の違いが酵母
ででは，酵母の生育はエタノールを含まない培地で
の生育に及ぼす影響
温度ストレス処理を行った場合と同程度であった
培地，YPD 培地；ストレス温度，30℃（□）
が，エタノール 8％および 10％では，酵母の生育は
または 37℃（■）；ストレス処理時間，2 時
悪くなった．酵母は温度ストレスとエタノールスト
間；培地中のエタノール濃度，14％．
レスに対してよく似たストレス応答をするという
図中の矢印はストレス処理を行った時点を
報告
5)があるが，温度ストレス時の培地へのエタノ
示す．
ール添加は，酵母の生育に効果を示さなかった．
３．３培養温度がストレス処理効果に
及ぼす影響
して感受性が高いことを報告しているため，培養温
度 22℃では，高温が温度ストレスの効果を低下させ
培養温度を 22℃とした場合，培地のエタノール濃
たものと推察される．なお，22℃の培養では 15℃
度が 14％では，培養温度が 15℃の場合よりも，温
の時より酵母の生育度が高かったが，これは酵母の
度ストレスの効果が小さかった（図 4）．なお，エ
生育至適温度（30℃前後）に近いためと考えられる．
タノール濃度が 6~12％においては温度ストレス処
この結果から，温度ストレスは，培養温度が比較的
理の有無で酵母の生育に差はみられなかった．Gao
低い場合にエタノール耐性の向上に寄与すること
ら
6)は，培養温度が高いほど酵母はエタノールに対
が示唆された．
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３．４培地の炭素源がストレス処理効
果に及ぼす影響
No.38 (2014)
2.0
YPG 液体培地における酵母の生育度に差はない
ことを確認した．YPG 液体培地において，培地の
エタノール濃度が 6％および 8％では温度ストレ
ス処理の有無で酵母の生育に差はみられなかった．
生育度 (OD660)
エタノール非存在下では，YPD 液体培地及び
無処理
(YPD培地)
1.5
ストレス処理
(YPD培地)
1.0
無処理
(YPG培地)
0.5
ストレス処理
(YPG培地)
エタノール濃度 10％の YPG 液体培地では酵母の
0.0
生育が悪くなり，無処理区よりも温度ストレス処
0
1
理区の方が酵母の生育度が低かった（図 5）．エ
2
3
4
5
6
7
培養日数
タノール濃度 12％および 14％の同液体培地では，
図 5 異なる培地における温度ストレス処理が酵
温度ストレス処理の有無に関わらず酵母の生育が
母の生育に及ぼす影響
著しく悪かった．グリセロールはストレスに対す
培養温度，15℃；ストレス温度，30℃；ス
7)，
トレス処理時間，2 時間；培地中のエタノ
る保護物質として働くことが知られているが
今回の実験条件ではグリセロールを含む YPG 液
ール濃度，10％．
体培地のストレスに対する保護効果は確認できな
図中の矢印はストレス処理を行った時点を
かった．
示す．
４．まとめ
Biosci. Bioeng., 107(6), p636-640 (2009)
2) Y. Ogawa et al. : “Tolerance Mechanism of the
清酒酵母のエタノール耐性の向上に効果を示す
Ethanol-Tolerant Mutant of Sake Yeast” . J.
温度ストレス処理条件を検討した．YPD 培地を用
い，培養温度を 15℃とした場合，対数増殖期におけ
Biosci. Bioeng., 90(3), p313-320 (2000)
る酵母への 30℃，2 時間の温度ストレス処理によっ
3) 新田朝子ほか：“K1 キラー耐性を利用した清酒
て，培地のエタノール濃度 14％での酵母の生育が促
酵母からのアルコール耐性酵母の取得”．生物工
進された．培養温度を 22℃とした場合は，培養温度
学会誌, 78(3), p77-81 (2000)
を 15℃とした場合と比べて温度ストレスの効果が
4) K. Watson et al. : “Acquisition of Ethanol
小さかったことから，温度ストレスは，培養温度が
Tolerance in Yeast Cells by Heat Shock” .
15℃という比較的低い場合に酵母のエタノール耐
Biotechnol. Lett., 5(10), p683-688 (1983)
性の向上に寄与することが示唆された．一方，温度
5) P. W. Piper : “The Heat Shock and Ethanol
ストレス処理時に，培地へエタノールを添加した場
Stress Responses of Yeast Exhibit Extensive
合および YPG 培地を用いた場合は，酵母の生育促
Similarity and Functional Overlap”. FEMS.
進効果がみられなかった．以上のように，高濃度の
Microbiol. Lett., 134(2-3), p121-127 (1995)
エタノール存在下において，清酒酵母の生育を促進
6) C. Gao. et al. : “The Effects of Temperature and
する温度ストレス処理条件を見出すことができた．
pH on the Ethanol Tolerance of the Wine
Yeasts, Saccharomyces cerevisiae, Candida
参考文献
stellata and Kloeckera apiculata”. J. Appl.
1) H. Wu et al. : “Disruption of Ubiquitin-Related
Bacteriol., 65(5), p405-409 (1988)
Genes in Laboratory Yeast Strains Enhances
7) S. Hohmann : “Osmotic Stress Signaling and
Ethanol Production during Sake Brewing” . J.
Osmoadaptation in Yeasts”. Microbiol. Mol.
Biol. Rev., 66(2), p300-372 (2002)
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