特集 1 High Fidelity PCR 酵素がヒトゲノム 30 kb を増幅！ PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ® ® 製品コード R050A R050B 250 U 1,000 U（A × 4） ¥35,000 ¥100,000 高い正確性と優れた増幅効率を兼ね備え、 「使いやすい High Fidelity PCR 酵素」として多くの研究者の皆様から ご好評をいただいている PrimeSTAR® シリーズに、新たに PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase が加わりまし た。PrimeSTAR® GXL は PrimeSTAR® HS DNA Polymerase を改良し、さらに独自の伸長因子を組み合わ せることにより PCR パフォーマンスを飛躍的に向上させた、画期的な High Fidelity PCR 酵素です。本特集で は、High Fidelity PCR 酵素の常識を打ち破る PrimeSTAR® GXL の性能をご紹介いたします。 ■ 特長 ■ 各種 PCR 酵素との正確性の比較 【方法】 正確性 Pfu DNA Polymerase を上回ります。 GC リッチで変異が入りやすい Thermus thermophilus HB8 ● 長鎖増幅 ゲノム DNA を鋳型として、任意に選択した 10 領域 （増幅サイ ® ヒトゲノム DNA を鋳型として 30 kb、λDNA では ズはそれぞれ約 500 bp） を PrimeSTAR GXL と各種 PCR 40 kb を増幅可能。長鎖ターゲットの増幅が得意です！ 酵素で増幅しました （反応液組成および PCR 条件は各酵素 ● GC リッチ対応 の推奨プロトコールを使用） 。増幅産物をベクターにクローニ バッファーの 変 更 や 特 別 な 反 応 条 件 の 設 定 なしに、 ングし、各配列について複数クローンをピックアップしてシーケ 高い成功率で GCリッチターゲットを増幅できます。 ンシングにより塩基配列を確認しました。解析した総塩基数 ● cDNA 増幅 に対するエラー塩基数からmutant frequency を求めました。 核酸量の多い cDNA を鋳型とする増幅にも威力を発 揮します *。 【結果】 ＊：一般的に正確性の高いPCR 酵素は核酸量の影響を受けやすく、cDNA を ● PrimeSTAR® GXL では、解析した総塩基数 486,923 塩基に対 鋳型とする増幅が苦手とされています。 しエラーは 30 塩基であり、mutant frequency は 0.0062％とな ■ 内容（200 反応分＊１） りました。この結果は High Fidelity PCR 酵素の原点である PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase（1.25 U/µl） 200 µl ＊２ 5 × PrimeSTAR® GXL Buffer（Mg2+ plus） dNTP Mixture（2.5 mM each） Pfu DNA Polymerase の正確性を上回っています（図 1） 。 1 ml × 2 800 µl ＊1 ：標準プロトコール、反応容量 50 µl での回数 2+ です。 ＊2 ： Mg 濃度は5 mM（5 ×） （弊社比較データ） 図1 PrimeSTAR ® シリーズと各種 PCR 酵素との正確性の比較 2 ● BIO VIEW No.54 特集 1 High Fidelity PCR 酵素がヒトゲノム30 kbを増幅！ PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ® ■ 長鎖ターゲットの増幅 【方法】 ヒトゲノムDNA、λDNA および cDNA を鋳型として、さまざま ■ GC リッチなターゲットに対する反応性を 他社 High Fidelity PCR 酵素と比較 【方法】 なサイズのターゲットを増幅しました（サーマルサイクラーは ヒトゲノムDNA および T. thermophilus HB8 ゲノムDNA を鋳 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice ® Standard を使用。 型として、増幅領域の GC 含量が 70％前後の4 種類のGC なお、本稿の PCR はすべて本装置で行いました） 。 リッチなターゲットについて、PrimeSTAR® GXL と他社 High Fidelity PCR 酵素で増幅を行い反応性を比較しました。反 【結果】 ヒトゲノム DNA を鋳型とした場合は 30 kb、λDNA では 応液組成および PCR 条件は各酵素の推奨プロトコールに従 いました。 40 kb、cDNA では 13.5 kb までの増幅が確認できました。高 次構造をとりやすいゲノムDNA をはじめ、様々なターゲットに 【結果】 対して非常に良好な伸長性を示すことがわかります（図 2） 。 PrimeSTAR® GXL は他社 High Fidelity PCR 酵素よりも効率 優れた伸長性を有するPrimeSTAR® GXL を用いることで、こ よく、高い反応特異性で目的のターゲットの増幅が可能でし れまでの High Fidelity PCR 酵素では増幅できなかった長鎖 た （図 3） 。非特異的な増幅がおこりやすい GCリッチなターゲ の増幅が可能です。 ットでも、PrimeSTAR® GXLを用いれば特別なバッファーや反 応条件を設定することなく、特異性の高い増幅が可能です。 鋳型：ヒ PrimeSTAR ® GXL Ｍ 1 2 3 4 A 社酵素 Ｍ Ｍ B 社酵素 2 Ｍ 1 2 3 1 2 B 社酵素 3 4 4 Ｍ Ｍ C 社酵素 4 Ｍ 1 2 3 1 2 3 4 Ｍ D 社酵素 1 2 3 4 Ｍ （弊社比較データ） 鋳型：ヒトゲノム DNA （100 ng/50 μl 反 応 系） レーン 1： APOE gene 746 bp（GC 含 量 74 %） 2： TGFβ1 gene 2005 bp（GC 含 量 69 %） 鋳 型： T. thermophilus HB8 ゲノム DNA （10 ng/50 μl 反 応 系） レーン 3： 2029 bp（GC 含 量 74 %） M： pHY Marker 4： 4988 bp（GC 含 量 74 %） 反 応は 各 社 推 奨 条 件で実 施 B 社 酵 素 2： GC リッチ 対応 酵 素 D 社 酵 素： ＧＣバッファー 使 用 図3 GC リッチターゲットに対する PrimeSTAR ® GXL と他社 High Fidelity PCR 酵素との反応性の比較 図2 PrimeSTAR ® GXL の伸長性の確認 ヒトゲノム DNA を鋳型とした場合は 30 kb、λDNA では 40 kb、cDNA では 13.5 kb までの増幅が確認でき、様々なターゲットに対して非常に良好な伸長性 を示しました。 PrimeSTAR ® GXL は様々な GC リッチターゲットをもっとも効率よく増幅し、 かつ、高い反応特異性を示しました。 BIO VIEW No.54 ● 3 特集 1 High Fidelity PCR 酵素がヒトゲノム30 kbを増幅！ PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ® ■ 他社 High Fidelity PCR 酵素および rTaq との ■ cDNA を鋳型とする反応 【方法】 増幅効率の比較 様々な量の HL60 細胞由来 total RNA を逆転写して得られた cDNA を鋳型に、トランスフェリンレセプター （TFR）領域 4 kb を ® 【方法】 様々な量のヒトゲノム DNA を鋳型として、PrimeSTAR® GXL PrimeSTAR シリーズの各酵素で増幅し、感度および鋳型量 と他社 High Fidelity PCR 酵素および r Taq の増幅効率を に対する許容性を比較しました。 比較しました。 【結果】 【結果】 一般に、正確性の高い PCR 酵素は反応液中の核酸量に影 PrimeSTAR® GXL では他社 High Fidelity PCR 酵素や rTaq 響を受けやすく、cDNA を鋳型とする増幅が比較的苦手で より高感度かつ良好な増幅が見られました。また、他社 ® す。しかし、PrimeSTAR GXL では 2.5 ng ∼ 1 µg にわたる鋳 High Fidelity PCR 酵素が反応阻害を受けた鋳型量が多い 型 cDNA の非常に広い濃度範囲において良好な増幅が見 条件下（ヒトゲノム DNA 500 ng/50 µl 反応系）でも高い反応 られ、感度、鋳型量許容性とも優れていることがわかりまし 性を示しました （図 5） 。 た （図 4） 。 PrimeSTAR® GXL PrimeSTAR® GXL Ｍ 1 2 3 Ｍ 1 2 3 Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 9 10 Ｍ Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 Ｍ 8 9 10 Ｍ Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 Ｍ Ｍ Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 Ｍ PrimeSTAR® HS 4 5 6 7 B 社酵素 E 社酵素 PrimeSTAR® Max 4 5 6 7 8 9 10 ター ゲット：TFR 4 kb 鋳 型 cDNA 量 （total RNA 相 当 量）/ 50 μl 反 応 系 レーン 1： 25 2： 250 3： 2.5 4： 25 pg pg ng ng 5： 250 ng 6： 500 ng 7： 751 ng 8： 1μg A 社酵素 8 9： 1.5 μg 10： 2 μg M： λ- Hin d III digest C 社酵素 ｒ Taq （弊社比較データ） 鋳型：ヒトゲノムDNA ターゲット：DCLRE1A 遺伝子 （2 kb） 反応は各社推奨条件で実施 鋳型量 （/50 μl反応系） 5： 100 ng レーン１： 鋳型なし 6： 200 ng 2： 100 pg 3： 1 ng 7： 500 ng 4： 10 ng M： λ- Hin d III digest 図4 cDNA を鋳型とする反応：鋳型量への適応性の比較 正確性の高い PCR 酵素は核酸量の影響を受けやすく、cDNA を鋳型とする 増幅が比較的苦手です。しかし、PrimeSTAR® GXL は鋳型 cDNA 量が多い場 合でも高い反応性を示しました。 図5 PrimeSTAR ® GXL と他社 High Fidelity PCR 酵素および rTaq との増幅効率の比較 PrimeSTAR® GXL は、他社 High Fidelity PCR 酵素や r Taq より高感度かつ 良好な増幅性を示しました。また、他社 High Fidelity PCR 酵素が反応抑制を 受ける鋳型量が多い条件下でも高い反応性が見られました。 4 ● BIO VIEW No.54 特集 1 High Fidelity PCR 酵素がヒトゲノム30 kbを増幅！ PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ® ■ 高速 PCR プロトコールでの反応 PrimeSTAR® GXL は、伸長時間が 1 分/kb のスタンダードな PCR 条件を標準プロトコールとしていますが、酵素を 2 倍量 ＜標準プロトコール＞ Ｍ 1 2 3 酵素量： 1.25 U/50 µl 反応系 4 5 6 7 8 9 10 Ｍ 98 ℃ 10 秒 55 ℃ 15 秒 68 ℃ 4 分 使用することにより、伸長時間 10 秒/kb の高速 PCR を幅広 いターゲットに対して行うことができます。 30 サイクル 反応所要時間： 3 時間 【方法】 ヒトゲノム DNA を鋳型として、高速プロトコールで各サイズの ターゲットを増幅しました。また、様々な濃度の HL60細胞由 ＜高速プロトコール＞ 酵素量： 2.5 U/50 µl 反応系 Ｍ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ｍ 98 ℃ 10 秒 55 ℃ 15 秒 68 ℃ 40 秒 来 total RNA を逆転写して得られた cDNA を鋳型に、トラン スフェリンレセプター （TFR）領域 4 kb を高速プロトコールで増 幅し、感度および鋳型量に対する許容性を確認しました。 30 サイクル 反応所要時間： 1 時間 20 分 ターゲット： TFR 4 kb 鋳型 cDNA 量（total RNA 相当量/50 µl 反応系） 【結果】 ヒトゲノム DNA を鋳型とした反応では、20 kb までの増幅が 確認できました （図 6） 。また cDNA を鋳型とする反応では、 標準プロトコールと同等の感度、鋳型量許容性を維持しなが ら反応時間を 3時間から半分以下の 1時間 20分に短縮する 1： 25 pg 2：250 pg 3： 2.5 ng 4： 25 ng 5：250 ng 6：500 ng 7：750 ng 8： 1 µg 9： 1.5 µg 10： 2 µg M：λ-Hind # digest ことができました （図 7） 。 図7 cDNA を鋳型とした標準プロトコールと 高速プロトコールの比較（2） ＜標準プロトコール＞ 酵素量：1.25 U/50 µl 反応系 増幅鎖長≦ 8.5 kb 98 ℃ 10 秒 60 ℃ 15 秒 68 ℃ 1 分/kb ■ 最後に 以上のように PrimeSTAR ® GXL DNA Polymerase は長鎖 の増幅や GC リッチターゲット、cDNA を鋳型とする増幅に威 30 サイクル 力を発揮し、これまでの High Fidelity PCR 酵素の不可能 を可能にします。ぜひ一度皆様の研究にもお試しいただき、 増幅鎖長 15 & 20 kb 98 ℃ 10 秒 30 サイクル 68 ℃ 10 分 その高い性能をお確かめください。 ■ PrimeSTAR® シリーズおよび関連製品 ＜高速プロトコール＞ 酵素量：2.5 U/50 µl 反応系 増幅鎖長≦ 8.5 kb 98 ℃ 10 秒 60 ℃ 15 秒 68 ℃ 10 秒/kb 30 サイクル 増幅鎖長 15 & 20 kb 98 ℃ 10 秒 30 サイクル 68 ℃ 5 分＊ 鋳型：ヒトゲノム DNA（100 ng/50 µl 反応系） ターゲット 1：p53 2：DCLRE1A 3：DCLRE1A 4：DCLRE1A 0.5 kb 1 kb 2 kb 4 kb 5：β-globlin 8.5 kb 6：β-globlin 15 kb 7：β-globlin 20 kb M：λ-Hin d # digest ＊2 step PCR で高速反応を行う場合は、伸長時間を 20 秒/kb に設定してください。 図6 ヒトゲノム DNA を鋳型とした標準プロトコールと 高速プロトコールの比較（１） ・PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase NEW 製品コード R050A 250 U ¥35,000 R050B （A × 4） 1,000 U ¥100,000 ・ PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 製品コード R010A 250 U ¥30,000 R010B （A × 4） 1,000 U ¥96,000 （Premix） ・ PrimeSTAR® HS 製品コード R040A 100 回 ¥22,000 ・ PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 製品コード R045A 100 回 ¥30,000 ・ PrimeSTAR® Mutagenesis Basal Kit 製品コード R046A 25 回 ¥19,000 ・ PrimeScript® High Fidelity RT-PCR Kit 製品コード R022A 50 回 ¥42,000 R022B （A × 4） 200 回 ¥140,000 ・ Mighty Cloning Kit（Blunt End） 製品コード 6026 20 回 ¥30,000 ・ Mighty TA-cloning Kit for PrimeSTAR® 製品コード 6029 20 回 ¥32,000 ・ TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® Gradient 製品コード TP600 １台 ¥780,000 ・ TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® Standard 製品コード TP650 １台 ¥680,000 本文中の製品に該当するライセンス確認事項は42 ∼ 43 ページをご覧ください。 x⁄8 ¤3 BIO VIEW No.54 ● 5
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