道衛研所報 Rep. Hokkaido Inst. Pub. Health, 57, 69-72（2007) DNA フラグメント多型解析法による食中毒事例等 Bacillus cereus 菌株の系統析離 DNA Fragment Length Polymorphism Analysis of Bacillus cereus Isolates from Several Food Poisoning Outbreak 山口敬治間明美森本洋池田徹也 Keiji YAMAGUCHI, Akemi KUZUMA, Yo M ORIMOTO and Tetsuya IKEDA ；PFGE（パルスフィールドゲル電気泳動）；RAPD-PCR； Key words：Bacillus cereus（セレウス菌） repetitive sequence-based PCR（繰り返し配列 PCR）セレウス菌 Bacillus cereus はグラム陽性通性嫌気性芽胞形成桿菌であり，土壌，塵埃，河川などの自然環境中にれらの PCR フラグメント解析は RAPD-PCR 法と同様に存在している．セレウス食中毒は，これら自然環境から PCR 法が基礎となっているため，短時間に結果を得ることができる．農畜産物等を介してセレウス菌芽胞が食品を汚染し，加熱平成 18年北海道内で嘔吐毒産生セレウス菌による食中により芽胞を形成しない菌が死滅するなどの条件が整った毒が発生し，疫学的に起源が同一とえられる食品・患者場合に増殖し，それにより発生するとえられる．しかし，由来の菌株がセレウス食中毒は事例数が少なく，食中毒発生時に行う B.cereus 株を併せて，DNA フラグメント多型解析法を用いて，菌株の識別を行い，有用性の比較検討を行ったの細菌検査において，食品から検出されない場合が多い．セレウス食中毒発生時の原因究明調査では，Ｈ血清型及で報告する．びファージ型を指標として原因菌の由来の特定が行われる．しかし，これらを一般の検査機関では用いられていない．法１．試験材料子疫学解析が 10株の B.cereus を用した．嘔吐毒産生株として５株，盛んになってきた．その中で RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）法の一種であるパルスすなわち，平成 18年食中毒事例原因食品由来１株（No. フィールドゲル電気泳動（PFGE）法は事実上の標準法と１株（No.5）．下痢毒産生株として５株，すなわち，検食からの離株１株（No.6），自然環境由来１株（No.7），して，離菌株の疫学解析に多用されており，セレウス食中毒事例も， ▶ 組注意方用できる機関は一部にとどまり，近年，遺伝子型を様々な手法で析する離されたことから，当所に保存してあった 1），同患者由来株３株（No.2，3，4），嘔吐毒産生対照株離株について PFGE 法を用いて析さ食中毒事例の食品由来１株（No.8），同事例患者由来２株．PCR（Polymerase Chain Re- （No.9，10）であった．２．PFGE 法及び PCR-DNA フラグメント多型解析法 action）法を基礎とした方法は，DNA を抽出した後迅速れるようになったに試験が行える利点があり，中でも Randomly amplified B.cereus 菌株の系統を識別するため，次の５種類の polymorphic DNA (RAPD)-PCR 法は過去に多用された． DNA フラグメント多型解析法を用いた．すなわち，現在，繰り返し配列を利用した PCR 法を用いた子疫学 PFGE 法，RAPD-PCR 法，REP-PCR ，BOX-PCR 解析が利用されはじめている．それらには Repetitive Extragenic Palindromic sequence (REP)-PCR，Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)-PCR， BOX element (BOX)-PCR，M ultiple-Locus Variablenumber tandem repeat Analysis (MLVA) 等がある．こ及び（GTG) -PCR である．１）PFGE 用プラグ作成ならびに DNA の抽出コロニーから釣菌し，LB ブロス（Difco,USA）に接種後 37℃で一夜培養した．２本のマイクロチューブに培養液を１mL ずつ無菌的に取し，１本を PFGE プラグ作成用，他の１本を DNA 抽出用とした．PFGE 用プラグは Liu et al. に従い作成した．制限酵素は Not I，Sma I 小市保所康増進課 69 (New England Biolab, UK)を用い，それぞれ 50U/plug の濃度で 37℃，６時間消化した．一方，DNA の抽出精製間泳動した．泳動後，ゲルを臭化エチジウム（１μg/ mL）で染色した．泳動像は， UV 照射下で PHOTODYNE を用いて TIFF ファイル化し保存した．は DNeasy Tissue Kit（QIAGEN, Germany）を用いて用説明書に従った．４）繰り返し配列 PCR 法２）PFGE 法 REP-PCR 法， BOX-PCR 法，（ GTG) -PCR 法は，それぞれの PCR mixture に DNA 鋳型を添加し，次 PFGE の条件は，１％PFC アガロースゲルを担体とし， 0.5×TBE（Tris-Borate-EDTA）緩衝液下にて，電圧６の PCR 増幅条件で行った．まず 95℃で７間反応させ， V/cm，液温 14℃で 18時間泳動とした．スイッチタイムは Not I では１∼50秒間，Sma I では１∼35秒間とした．その後 90℃で 0.5 間，45℃で１間，65℃で５泳動後，ゲルを臭化エチジウム（１μg/mL）で染色した．た．１％PFC アガロースゲルを泳動用担体とし，１× UV 照射下で泳動像を PHOTODYNE（Atto, Tokyo）にて TIFF ファイル化し，次いで BioNumerics ver. 3.0 TBE 緩衝液下で Subcell 192 システム（BioRad, USA）を用いて，100V で 90 間泳動した．泳動後，ゲルを臭（Applied M aths, Belgium）を用いて Dice 法により解析した．なお，クラスター析には，Tolerance 1.5％の条化エチジウム（１μg/mL）で染色した．泳動像は，UV 照射下で PHOTODYNE により TIFF ファイル化し保存サイクルを 30回行い，最後に 70℃で 10 件で Unweighted Pair Group M ethod with arithmetic Average 法を用いた．間の間の反応としした．結果及び３）RAPD-PCR 法 RAPD-PCR には，牧野による AP40，AP41，AP42， AP43，AP45，AP47 の６種類のプライマーを用いた．察 PFGE 法により解析した B.cereus 10株の結果を Fig. 1a 及び 1b に示した．Fig. 1a は制限酵素として Not I を PCR の反応条件は，94℃で５間，36℃で５間，72℃ で５間のサイクルを４回行い，その後 94℃で１間，泳動像は A（No.1∼4），B（No.5），C（No.6），D（No. 36℃で１間のサイクルを 30回行い，最 7），E（No.8），F（No.9，10）の６種類のタイプに識別後に 72℃で 10 間の反応とした．２％ GTG アガロースゲルを泳動用担体とし，１×TAE 緩衝液下で 100V，90 された（Table 1）．嘔吐毒産生株では，原因食品離株（No.1）と患者由来株（No.2∼4）が同じタイプに識別さ間，72℃で２用した泳動像及び菌株間の相同性を表す樹状図である． Fig.1a Phylogenic Tree of PFGE Pattern by Not I Digestion The electrophoresis patterns were emphasized by a computer software. Fig.1b Phylogenic Tree of PFGE Pattern by Sma I Digestion The electrophoresis patterns were emphasized by a computer software. 70 れた．一方，下痢毒産生株では，患者由来の菌株（No.9， RAPD-PCR 法によるそれらと異なる結果を示した．すなわち，（GTG) -PCR では食中毒由来株（No.1∼4）と嘔 10）が同じグループに識別された．Fig.1b は Sma I 処理によるものを示したが，泳動パターンは Not I のものと同吐毒産生対照株（No.5）が識別不能であり，REP-PCR， BOX-PCR では食中毒由来株（No.1，3，4）と嘔吐毒産様の結果が得られた．下痢型食中毒事例の食品ならびに患者から離された菌株（No.8ならびに No.9，10）は， PFGE 型が異なる（タイプＥとタイプＦ）のみならず生化学性状も異なった（データは示さない）．従って，No.8 は食品残品から離されたものの食中毒原因菌でないことが，遺伝子型からも証明されたとよる系統 ▶ 組注意えられる．PFGE に類を行う場合，菌の種類によって用いる制限酵素を選択しなければならない．例えば Salmonella Enteritidis では以前 Xba I が用いられていたが，現在は識別能の良い Bln I が用いられている．Liu et al. は８種類の制限酵素を検討し，B.cereus の PFGE には Sma I が最も適しており，Bln I は識別能が低いとしている．今回の結果は Not I，Sma I 共に良好な識別能を示したことから，山口らの報告に示されているように，どちらの制限酵素もセレウス食中毒発生時の子疫学解析に利用できるとえられる． Fig.2a Fragment Pattern by RAPD-PCR with Primer AP41 RAPD-PCR 法により増幅した DNA フラグメントの泳動像を Fig.2a 及び Fig.2b に示した．６種類のプライマーを用したなかで，AP41 及び AP42 の結果を示した．この２種のプライマーを用した場合，PFGE と同様に，試験に供した B.cereus 10株を６種類のタイプに識別することができた（Table 1）．RAPD-PCR は PFGE 法に比較して，はるかに迅速に遺伝子解析が可能である．このことから，AP41 及び AP42 プライマーによる RAPD-PCR は，離した B.cereus 菌株の識別に有効な手段の一つであるとえられた． REP-PCR 法，BOX-PCR 法及び（GTG) -PCR 法により得た泳動像をそれぞれ Fig.3∼5に示した．下痢毒産生性セレウス食中毒患者菌株（No.9，10）は同一グループとして識別されたが，嘔吐毒産生性 B. cereus 菌株の泳動像は，PFGE 法，AP41 や AP42 プライマーを用した Fig.2b Fragment Pattern by RAPD-PCR with Primer AP42 Table 1 Bacillus cereus Isolates and Their Groups by PFGE, RAPD-PCR and rep-PCR Based on the Fragment Pattern No. RAPD-PCR PFGE Origin rep-PCR Sma I Not I AP40 AP41 AP42 AP43 AP45 AP47 REP-PCR (GTG) -PCR BOX-PCR 1 food 2 feces 3 feces 4 feces 5 emetic toxin strain fried rice patient 1 patient 2 patient 3 A A A A B A A A A B A A A A A A A A A B A A A A B A A A A A A A A A A A A A A A A G A A B A A A A A A G A A B 6 7 8 9 10 cabbage sand spinach patient 1 patient 2 C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F C D E F F food environment food vomit feces No.1-5：Cereulide producing Bacillus cereus No.6-10：Enterotoxin producing Bacillus cereus rep-PCR：Repetitive sequence based PCR 71 Fig.3 Fragment Pattern by REP-PCR Fig.5 Fragment Pattern by (GTG) -PCR 文 Fig.4 Fragment Pattern by BOX-PCR 生対照株（No.5）が識別できるものの，食中毒由来株の中で No.2が他の株と異なる泳動像を示した．このことは， REP-PCR 法，BOX-PCR 法及び（GTG) -PCR 法を B. cereus 菌株の識別に活用するためには，識別指標とする DNA 領域を新たに設定する必要があることを示唆しているとえられる．今回実施した B.cereus 菌株の DNA フラグメント多型解析では，PFGE 法や RAPD-PCR 法が系統類に有効であることが示された．しかし，PFGE 法では，操作の煩雑さとともに試験に時間を要する．また RAPD-PCR 法は，菌株の同定や種内変異の検討に用されているものの，再現性に問題があることが指摘されている．行政検査には，迅速簡さに加えて高い再現性が求められる．今後，迅速・簡で再現性の高い結果が得られる PCR-増幅 DNA フラグメント多型解析法を検索していくことが重要であろう． 72 献 1) 坂崎利一編集：新訂食水系感染症と細菌性食中毒，中央法規出版，東京，2000，p.485 2) 厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課：食品衛生研究，56⑼，88-174（2006） 3) 満田年宏：感染症対策のための子疫学入門，メディカ出版，大阪，2002，p.20 4) Liu PY-F,Ke S-C,Chen S-L：J.Clinical M icrobiol., 35 (6), 1533-1535 (1997) 5) 山口友美，野池道子，佐々木美江，畠山敬，齋藤紀行，白石廣行，後藤つね子，日野久美子，氏家雪乃，小林妙子：宮城県保環境センター年報，19，51-54（2001） 6) 木村凡：モダンメディア，52⑺，209-216（2006） 7) Cherif A, Brusetti L, Borin S, Rizzi A, Boudabous A, Khyami-Horani H, Daffonchio D：J. 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