.J ASEV . npJ ，Vo .l 41 ， . oN 3 ( ) 302 二次元電気泳動法によるシャルドネワインタンパク質の分離と分析 0 奥田 徹 1 、福井正一 1、松土俊秀 1、 高 柳 勉 l、木羽信敏 z、横塚弘毅 1 (山梨大学大学院医学工学総合研究部、 I ワイン科学研究センター、 2 物質・生命工学科) 2D PAGE 。 Tohru noitarpeS OKUDA¥ ehTl etutitsnI and Maskazu FUKUI KIBA ytisrevinU deniatbo ∞leg 創 回6 G ・1 from edimalyrcaylop 組 d Iitomso ト ekil secnuqes nietorp fo lareves must snietorp ω 0 町 wer wer wer detarapes fo eht Hundres stops 合om C hardonay ， edihihsoT 恥 J iA TSUD0 2， 組d ikoK YOKOTSUKA ， tnemrapD2 fo deilpA ， Kofu ， Yamnshi wine Th esnietorp of 也e major secnuqes etihw ∞. yhpargotamorhc leg. siserohportcele dica ofYamnshi Char donay fo snietorP fo stops . dezylana ， Tsutomu sa eht stops w ぽ eesoht fo eht dezylordyh ed gnirud . noitacifiniv major and ygolnhcetoiB two snoitcarf ( lF wer htruf wer rof hcae . noitcarf snietorp showed 組 detarapes oisnemd Ian 怖か Th e Nlanimret amino ， nitameukaihlt . eniw fo 也e. se snietorp d) 2F by Sephadex by ぽ 也ta esatrevni ni 出e etihw stcudorp 1 yrtsimehC ， napJ two snoitcarf deniatbo ， TAKAYANAGl 1 otni The stluser deniatbo Wine 1 1 ihsotubN and erutlucitiV fo Enolgy Prsnieto Ansisyla The nietorp Nlanimret ， gnitsegus amino 也a tpro 包 sisylo ， dica fo I目的】ワインに存在するタンパク質は、ワインの呈味に影響を与える重要な成分として注目されて いる。我々はゲルろ過や SDS-PAGE でのワインタンパク質の分離を試み、白ワインに含まれる主要な タンパク質がインベルターゼ及びオスモチンまたはタウマチン様タンパク質であることを示してき た。今回の報告では分離がさらに良い二次元電気泳動法によりワインタンパク質を分離し、その N 末端アミノ酸配列を分析した。 I材料と方法】 タンパク質の調製には、山梨大学ワイン科学研究センター育種試験地で 20 年に栽培したシャル 5 L を用いた。ワインを 011 ドネブドウを用いて製造したシヤルドネワイン 3. 容量まで濃縮し、常 法に従って硫酸アンモニウム塩析物を調製した。タンパク質量として 05 10mM HCl で平衡化した Sephadx G-I0 カラム(i. . d . 26 x 01 cm) mg 相当量の塩析物を予め に供し、溶出液を F 1 及び F2 の 画分に分け透析後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を等電点電気泳動と SDS-PAGE た二次元電気泳動法で分離した。等電点電気泳動(一次元目)は Ready Ready MTpirtS SDS-PAGE IPG spirtS (pH 3) 6 を用いて行った。二次元目の電気泳動はLa ilme で行い、分離には 951 ものポリアクリルアミドゲル (pH . 8) 8 クリルアミドスラブゲルを PVDF 質を CBB perP 別 を組み合わせ 2-D retratS 回tおよび の不連続緩衝液系 を用いた。電気泳動後のポリア 膜にエレクトロブロッティングした。ブ ロッティングしたタンパク P 染色液で染色後，剃刀で切り出し， ABI 杜のプロテインシーケンサーを用い N- 末端アミノ 酸配列を決定した。 【結果】 二次元電気泳動法により F1 及び F2 画分はそれぞれ 20 以上のスポットに分離された erugiFC ) 1。 主要なスポットの N- 末端アミノ酸配列を決定したところ、 13 スポットの配列を決定した。 lF 画分の 主要なタンパク質は分子量が約 60 aDk でインベルターゼと高い相同性を示した。また、 F2 画分の主 n a tD .J ASEV . npJ ，Vo.l 41 ， . oN 3 ( ) 302 k Da 付近に見られ、オスモチン様タンパク質またはタウマチン様タンパク質と 要なタンパク質は 03 高い相同性を示した。 N- 末端アミノ酸配列のアライメント解析したところ、インベルターゼやオスモ チン様タンパク質の内部配列を示すタンパク質が多数存在したことから ( erugiF ) 2 、醸造中にプロテ アーゼ等の作用により果汁中のタンパク質が切断されている可能性が示唆された。 lp . 46 . 52 . 59 . 60 世十主 F -. : " " ' " / '. : : 噌 ，， . / J 鳴 毒 dー/ 苛世 45-4 30-+- ー 電按 02 / . : ー 令 嘩 4 iF 伊 er 1 百lanovisnemid . eniwstopS F- 拙 . . . . ・ ・. . edimalyrcaylop wora htiw トM DTHASD 幽 F etacidni lesgiserohportcele laninNret LHDEAYPPYSLDHV fonoitcarf dica secneuqes oninra F1 deniatbo foesatrevni PAGLQR RPLKVCTS 12LPGDNMW F~制Gwn江FY QYNPDSAVWG NITWGHAVSR 18ITASGWVN LPNGQIMY TGDNSVQ SLNAPYQ DPLHWIKY ENPVMA-240 142 -GPDRFSGI TMWVGADNWRVAGSLN TGIVLFQ TNFDEL GELHVPT-30 301-MWECVDFYP TDLGYVNIS DYALGP ESDLKGWA ls SPG 舵 VAQGSEKF YSLRGF RTAFHQPEK-120 RTAF AMVPDRWFL-180 361-ELDVGIR DYERASKT IRKVQDYF LKASMDNRHDYALGEP ￨ASMD IDGESWYL 421-HDNKTGYL LWPIEVS RTNSEFDV LEPGSIV IDLQSAG TENDVFA084 LVADTSE LTPIYFAK DTGSYKF-540 184IVDAEML 541-CTDLSRA iF 思. r e2 ilA g nment and Nlanimret SAHGPIKV YNCSTAGGRALPF ￨ IV YNESTAG GVfRQDV fo decud amino GRA PVIS amino dica dica secneuqes Chardony ro trap f. oesatrevni LMFVS-60 NWTAMLQ ￨ Y XTAMFWQ DMIHWLYP 61-IRVHTDN REG from 市I KEPQ MTDWP-360 剛 SLQIPRTV-420 凶I FP KEOJICA ecneuqes deniatbo PT 阻S HDVL fo eparg esatrevni from Chardonaywine -一一 from cDNA ecneuqes nietorp . ( cca . on ) A67412 ) ( dexo. b etihw aA2 F h υ
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