一般研究用試薬。In vitro use only. r Roche Applied Science LightCycler® FastStart DNA MasterPlus SYBR Green I ® キャピラリLightCycler 共通のHot Startタイプのマスターミックス簡易マニュアル Sep. 2007 製品に添付される最新バージョンのマニュアル (英語版) を必ずご確認ください。本マニュアルと製品に添付されるマニュアル (英語版) の内容に相違のある場合，製品に添付されるマニュアル (英語版) の内容が優先されます。本キットは、キャピラリタイプのLightCycler® 専用試薬です。その他の機器での使用については保証できかねます。製品番号：3 515 869 (03 515 869 001)， (96 反応分/20 µL 反応) 製品番号：3 515 885 (03 515 885 001)， (480 反応分/20 µL 反応) 製品番号：3 752 186 (03 752 186 001)，(1,920 反応分/20 µL 反応) 保存温度：-15 ∼ -25℃ Reaction Mix (ﾊﾞｲｱﾙ 1b) は遮光して保存してください。 1. キットの内容 4. プライマーについてﾊﾞｲｱﾙ 1a 1b 2 ﾗﾍﾞﾙ Enzyme Reaction Mix H2O, PCR-grade まずは、各最終濃度 500 nM で反応させてください。必要に応じて 200∼1000 nM で最適化ください。内容 a) 3 515 869 (96 反応分) b) 3 515 885 (480 反応分) c) 3 752 186 (1,920 反応分) a) 1a (約 42 µL) x 1 本, 1b (約 114 µL) x 3 本：混合すると 3 本の 5x ﾏｽﾀｰﾐｯｸｽ (各約 128 µL) となります。 b) 1a (約 42 µL) x 5 本, 1b (約 114 µL) x 15 本：混合すると 15 本の 5x ﾏｽﾀｰﾐｯｸｽ (各約 128 µL) となります。 c) 1a (約 210 µL) x 4 本, 1b (約 570 µL) x 12 本：混合すると 12 本の 5x ﾏｽﾀｰﾐｯｸｽ (各約 640 µL) となります。ｱﾝﾌﾟﾘｺﾝｻｲｽﾞは、最長 700 bp まで可能ですが、よりより PCR 効率のために 300 bp 以下でﾃﾞｻﾞｲﾝすることをお勧めします。 5. 反応溶液の調製反応溶液の調製の一例を示します。実験に合わせて濃度や液量を調整してください。ｺﾝﾎﾟｰﾈﾝﾄ液量最終濃度 H2O (ﾊﾞｲｱﾙ 2) 9.0 µL Forward ﾌﾟﾗｲﾏｰ（10 µM）最終濃度 0.5 µM の場合 1.0 µL Reverse ﾌﾟﾗｲﾏｰ（10 µM）最終濃度 0.5 µM の場合 1.0 µL 5x ﾏｽﾀｰﾐｯｸｽ (1a と 1b 混合後) 1x 濃度 4.0 µL ・ｹﾞﾉﾑ DNA：< 50 ng ・ cDNA：20 倍程度希釈したものﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄ (DNA や cDNA) 5.0 µL 10 ・ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ：< 10 ｺﾋﾟｰ Total 液量 20.0 µL <使用方法> ・融解していることを確認した後、1a と 1b をｽﾋﾟﾝﾀﾞｳﾝし、液をﾊﾞｲｱﾙの底にあつめます。・ a), b) ：1aから 14 µL分取し、1 本の 1bへ加え穏やかに混合します。・ c)：1aから 70 µL分取し、1 本の 1bへ加え穏やかに混合します。・下記「反応溶液の調製」を参考にして調製してください。 a) 1 mL x 2 本 b) 1 mL x 7 本 c) 25 mL x 2 本 2+ ﾌﾟﾗｲﾏｰやﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄの希釈は、H2Oでおこなってください (TEを用いると溶液中のMg 濃度が変化してしまいます)。 cDNA は反応液量の 10% (2 µL) を超えて持ち込むと、PCR を阻害することがあります。まずは、20 倍、200 倍などと段階希釈したもので阻害がないかを確認ください (阻害されている場合は、増幅ｼｸﾞﾅﾙが等間隔で得られません)。 <別売り Cat. No.> 3 315 932 (1 mL x 25 本) 3 315 959 (25 mL x 1 本) 3 315 843 (25 mL x 4 本) 6. 反応プロトコル反応ﾌﾟﾛﾄｺﾙの一例を示します。ﾌﾟﾗｲﾏｰの Tm 値や増幅長に合わせてｱﾆｰﾘﾝｸﾞ温度や伸長時間を調整してください。解析ﾓｰﾄﾞｻｲｸﾙ数ｾｸﾞﾒﾝﾄ温度保持時間蛍光取得熱変性 10 分酵素活性化 95℃ None 1 None 600 秒増幅熱変性 95℃ 10 秒 None ﾌﾟﾗｲﾏｰの Tm 10 秒値-5℃程度か (ﾌﾟﾗｲﾏｰ結 45 ら検討。合の特異性ﾌﾟﾗｲﾏｰのｱﾆ (ﾀｰｹﾞｯﾄのｺ (例：Tm 値 None をより高めｰﾘﾝｸﾞﾋﾟｰ数に合 60℃のﾌﾟﾗｲﾏたい場合はわせて 45 ｻ Quantification ｰの場合 55℃ 1) 0∼10 秒) ｲｸﾙ以下を ∼) 目安に設増幅長/25 定) 秒伸長反応 72℃ Single (例：250bp の場合 10 秒) Melting (融解曲線分析) 熱変性 95℃ 0秒 None ｱﾆｰﾘﾝｸﾞ 65℃ 15 秒 None Melting 1 0 秒 Curves ﾒﾙﾃｨﾝｸﾞ 95℃ Slope = Continuous 0.1℃/秒冷却 (Cooling) 冷却 40℃ 30 秒 Cooling 1 None 1a には主に酵素、1b にはﾊﾞｯﾌｧ (SYBR Green I を含む) が含まれます。 1a は非常に粘性が高いため十分にｽﾋﾟﾝﾀﾞｳﾝ後、注意深く分取してください (不足の原因になります)。混合後の 5xﾏｽﾀｰﾐｯｸｽには、PCR酵素、反応ﾊﾞｯﾌｧ (dTTPの代わりにdUTPを含む)、SYBR Green I、MgCl2が含まれます。別途MgCl2を加える必要はありませんが、ｻﾝﾌﾟﾙによっては最適化するとよりよい結果が得られることがあります。 2. 保存温度未開封のｷｯﾄは、-15 ∼ -25℃でﾗﾍﾞﾙに記載の有効期限まで使用可能です。開封後のｷｯﾄは、下の表を参照し保存してください。ﾊﾞｲｱﾙﾗﾍﾞﾙ保存・ -15 ∼ -25℃ 1a Enzyme ・凍結融解を繰り返さないでください。凍結融解を繰り返す可能性がある場合は小分け分注しておくことをお勧めします。 1b Reaction Mix ・ 1b には蛍光物質が含まれるため遮光して保存してください。・ -15 ∼ -25℃で 3 ヶ月以内に使用してください。・ +4 ∼ +8℃で 1 週間以内に使用してください。・凍結融解を繰り返さないでください。凍結融解を繰り 1a と 1b Master Mix を混合後返す可能性がある場合は小分け分注しておくことをお勧めします。・蛍光物質が含まれるため遮光して保存してください。・ -15 ∼ -20℃ 2 H2O, PCR-grade Ver.3.3 以前のｿﾌﾄｳｪｱでは、Gain を以下のように設定してください (ﾗﾝ終了後の変更はできません）。Ver.3.5 以上のｿﾌﾄｳｪｱでは設定の必要がありません。 F1=3、F2=1、F3=1 1) 100 µL反応の場合は、30∼45 秒 3. サンプルについてｻﾝﾌﾟﾙ RNA は、あらかじめ cDNA に逆転写しておいてください。RNA のｸｵﾘﾃｨは結果の正確性と再現性に影響を及ぼします。ｻﾝﾌﾟﾙ RNA は高濃度で DNA の混入のない、RNase やその他のｲﾝﾋﾋﾞﾀｰを含まない高純度のものを調製ください。 7. 解析についてｹﾞﾉﾑ DNA は 50 ng 以下になるよう調整してください。ご使用のｿﾌﾄｳｪｱのﾊﾞｰｼﾞｮﾝに合わせて下記を参照ください。 Ver.3.5 以前の場合：F1 Ver.4.0 以降の場合：Channel 1 (530) 10 ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞDNAは 10 ｺﾋﾟｰ以下になるよう調整してください。 cDNA は反応液量の 10% (2 µL) を超えて持ち込むと、PCR を阻害することがあります。まずは、 20 倍、200 倍などと段階希釈したもので阻害がないかを確認ください (阻害されている場合は、増幅ｼｸﾞﾅﾙが等間隔で得られません)。 1/2 8. よくある質問 Q1. 1a 液が足りません。 A1. 1a 液は、1 ﾊﾞｲｱﾙにつき 14 µL x 3 回分 (または 70µL x 3 回分) の液量が入っています。しかし粘性が非常に高いため、ｽﾋﾟﾝﾀﾞｳﾝが十分でないと足りなくなる場合がありますのでご注意ください。 Q2. ﾗﾝ開始直後に｢1 本目以降のｷｬﾋﾟﾗﾘが見つかりません｣というｴﾗｰﾒｯｾｰｼﾞが表示されます。 ® A2. ｷｬﾋﾟﾗﾘﾀｲﾌﾟのLightCycler では、ﾗﾝ開始直後にｷｬﾋﾟﾗﾘ内の蛍光物質を検出し、検出機のﾎﾟｼﾞｼｮﾝ調整をおこないます。そのためｷｬﾋﾟﾗﾘ内に蛍光物質が入っていない場合や感度以下の蛍光強度の場合はｴﾗｰが表示されます。1aと 1bの混合比や加える量を再度ご確認ください。それでも解消されない場合は、弊社担当者までご連絡ください。 Q3. 増幅されません。 A3-1. ｻﾝﾌﾟﾙが cDNA の場合、原液を反応液量の 10% (2 µL) を超えて持ち込むと、PCR を阻害することがあります。まずは、20 倍、200 倍などと段階希釈したもので阻害がないかを確認ください (阻害されている場合は、増幅ｼｸﾞﾅﾙが等間隔で得られません)。 A3-2. ｻﾝﾌﾟﾙがｹﾞﾉﾑDNAの場合、1 反応あたり 50 ngを超えないようにしてください。またﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ 10 DNAの場合、10 ｺﾋﾟｰを超えないようにしてください。お問い合わせやご質問は・・・ r ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 AS 事業部(研究用機器・試薬) 製品学術部 Tel：03-5443-5287 / Fax：03-5443-7098 Mail：[email protected] 2/2