すずきじゅん氏名(本籍) 鈴木学位の種類医学博士学位記番号医学位授与年月日平成2年2月'28日学位授与の要件学位規則第5条第2項該当最終学歴昭和57年3月潤(福島県) 第2215号東北大学医学部医学科卒業学位論文題目 IL- 2 receptor subunit p75:d.irect demon、stra- tion of its IL- 2 bin(iing ability by using a novel mono lo nal a, ntibod.y (新しい単クロン抗体を用いてのIL -2受容体p 75サブユニットのIL-2結合能の直接証明) (主査) 論文審査委員教授多田啓也教授橘武彦一 477一教授京極方久論文内容要旨【目的】ヒトインターロイキン2 (IL- 2) は丁細胞増殖因子として免疫機構に重要なかかわりをもつ, 分子量15000の液性因子である。 IL-2受容体 (IL-2R) にはこれまで少なくとも2っのサブユニットp55とp75が同定されていた。また結合親和性の相違から3つの形態が存在するが, 低親和性IL- 2R (Kd∼10nM) はp55単独, 中間親和性IL- 2R (Kd∼1nM) はp75単独, 高親和性IL-2R (Kd∼10pM) はp55とp75の複合体で構成されていることが示唆されている。機能的 IL-2Rである高親和性IL-2Rにおいてp75がシグナル伝達機能を荷うと考えられているが, p75の特性及び高親和性IL-2Rの詳細は未だ不明な点が多い。本研究ではIL- 2Rサプユニットと結合親和性の関係を詳細に検討するため, IL-2結合を阻害しないp75 に対する新しい単クロン抗体TU11抗体を作製した。【方法薯細胞株:IL-2R陽性丁細胞株MT-2, TL-Mor, ILT-Ma七, MT-1, MLA144, CTLL- 2及びIL-2R陰性骨髄系細胞株HL-60を用いた。単クロン抗体:ヒトIL-2Rp75特異的TU27抗体 (lgG、), ヒトIL-2Rp55特異的抗体H-31 (lgG1), H-48 (lgG1), コントロール抗体としてヒトパルボウイルス特異的PAR3抗体 (lgGI) を用いた。抗体作製:TU27抗体を用いて細胞可溶化物よりIL-2Rp75を精製してマウスに免疫しハイブリドーマを作製。町標識TU27抗体の固相ラジオイムノアッセイ法を利用して, IL-2Rp75特異的単クロン抗体TU11抗体 (lgG、) を産生する細胞株を選択した。細胞表面へのIL-2, 単クロン抗体の結合実験:1聞1-IL-2 (1.5xlO6dpm/pmo1), 阿一TU 27抗体 (4,4×106dpm命mo1), '251-TUll抗体 (4.6×105dp/pmo1) を種々の濃度で1×105細胞と4℃で1.5時間反応させた後, 細胞に結合した放射活i 性と遊離のそれを測定し, 結果をScatchard plo七解析して求めた。 1251-IL-2結合に及ぼす抗体の影響は50 μg/mlの抗体存在下で4℃で1 時間前処理後結合実験を行なって求めた。 Sequen七ia1免疫沈降:MT-2細胞をIODOGEN法を用いて 1251で細胞表面標識して可溶化し種々の抗体を用いて前吸収した後, TUll抗体またはTU27抗体で免疫沈降して10%SDS-PAGEで解析した。化学架橋実験:MT-2細胞に '251-IL-2 (1 nM) を結合させ, 非還元型化学架橋剤DSSで一 478一化学的にクロスリンクして可溶化した。可溶化物は直接に, あるいは種々の抗体で免疫沈降または前吸収したものを8.5%SDS-PAGEで解析した。可溶化IL-2Rサブユニットの結合実験:2×106 の非標識MT-2細胞可溶化物よりTU11, H48の抗体を用いて免疫沈降を行なったIL- 2Rサブユニット結合免疫沈降体を作製。これに 4nMの 1251-IL-2を反応させ細胞と同様に結合実験を行なった。結合特異性はTU27抗体 (100 μg/m1) 及びH-31抗体 (100μg/m1) 存在下での結合阻害の有無により検討した。【結果】 ① 125卜TU11抗体はIL-2Rp75陽性細胞とのみ反応し, 反応性はエ251-TU27抗体とほぼ一致した。 ②MT-2細胞表面の75kd分子のみを特異的に免疫沈降した。 ③この75kd分子はTU27抗体が免疫沈降する分子と同一であった。 ④TU11抗体は阿一IL-2の高親和性IL-2Rへの結合を阻害しない。 ⑤MT-2細胞の高親和性IL-2Rのみ給合する条件下での化学架橋実験では, p55 と p75に相当するバンドの他に70kdのIL- 2結合分子が検出された。 TU11抗体は主にp75と阿一IL2の複合体を免疫沈降したが, p55の複合体及び70kd分子の複合体の共沈を認めた。これら3っのバンドはTU11抗体により完全に前吸収された。 ⑥TU11抗体を用いて免疫沈降した可容化IL2Rp75に阿一IL-2は特異的に結合し, その86%がTU27抗体によって阻害を受け, H-31抗体で阻害を受けたのは, わずか17%のみであった。【考察】 ①TU-11抗体はIL-2結合を阻害しないIL-2Rp75特異的単クロン抗体であり, IL-2が結合したp75を免疫沈降することができる。 ②TU1 1抗体を用いて得られた可溶化IL-2Rp75の結合実験から, IL-2Rp75単独で特異的な IL-2結合能を有することを示した。 ③しかし, 同一条件下でIL-2結合親和性を求めたところ, 細胞表面上のIL-2Rp75 (中間親和性IL-2R) と比較して著しく低い結果を得た (未発表)。この事実は細胞表面でのp75の結合親和性を高める別の因子の存在を示唆するものと考えられ, 化学架橋実験で認められる70kdのIL- 2結合分子の存在を考慮すると, 中間親和性, 高親和性IL-2Rを解析するうえで興味深い知見と考える。 IL-2Rp75と70kd分子の異同を含め, TU11抗体を用いてのIL- 2Rの詳細な解析が今後さらに必要と考える。一479一審査結果の要旨ヒトインターロイキン2 (IL- 2) は丁細胞増殖因子として免疫機構に重要な関わりを持つ液性因子である。 IL-2受容体 (IL-2R) として少なくとも2っのサブユニットp55 とp75が同定されていた。またIL-2結合親和性の相違からは, 低親和性, 中間親和性, 高親和性の3っの形態が存在し, 特異な受容体であることが示唆されていた。しかし, 機能的IL∼2Rである高親和性IL-2Rの詳細及び, シグナル伝達の主体と考えられているp75に関しては不明な点が多かった。著者は, これを解明する手段として, IL-2結合を阻害しないIL- 2R p75に対する新しい単クローン抗体TU11抗体を作製した。まずTU11抗体の特異性を検討し, 次のような結果を得た。 1) IL-2R p75陽性細胞とのみ反応した。 2) それら細胞表面の75kd分子を特異的に免疫沈降した。 3) この75kd分子は抗IL- 2R p75抗体TU27抗体が免疫沈降する分子と同一である。 4.) TU11抗体は町一IL-2の高親和性IL-2Rへの結合を阻害しない。 5) 化学架橋実験より得られる1-IL-2とII・一 2R p75の複合体を免疫沈降した。次にこの抗体を用いて免疫沈降して作製した可溶化IL- 2R p75 に対する 1器1-IL-2の結合実験を行ない, p75単独でIL-2結合能を有することを直接証明した。以上の研究成果は著者が作製したIL- 2R p75特異的単ク口回ン抗体, TU11抗体が, IL- 2R サブユニットと結合親和性との関係をさらに詳細に解析するために有用な手段となることを示したものであり, 医学博士の授与に価いするものと判定された。一480一